분광광도법

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1. 개요

분광광도법은 빛의 흡수 현상을 이용하여 물질의 농도를 정량적으로 분석하는 방법으로, 분광광도계를 사용하여 측정한다. 1940년 아놀드 O. 베크만이 개발한 분광광도계는 이후 다양한 모델로 발전했으며, 1979년 휴렛 패커드가 최초의 상용 다이오드 어레이 분광광도계를 개발하면서 현대적인 분광광도계의 기반을 마련했다. 분광광도계는 광원, 단색화 장치, 검출기로 구성되며, 빛의 흡수와 투과, 비어-람베르트 법칙을 기반으로 작동한다. 자외선-가시광선 분광법, 적외선 분광법, 원자 흡수 분광법 등 다양한 종류가 있으며, 화학, 생화학, 재료 과학, 환경 과학, 의학/약학 등 다양한 분야에서 활용된다.

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분광광도법
기본 정보
분광광도법의 모식도
분야	분광학
측정	빛의 흡수 또는 투과
관련	색깔
상세 정보
설명	특정 파장에서 물질에 의해 흡수되거나 투과되는 빛의 양을 측정하는 기술
활용	물질의 식별 및 정량 분석에 사용
관련 학문
관련 학문	화학 물리학 생물학 재료 과학
활용 분야
활용 분야	약학 환경 모니터링 식품 과학 임상 진단
역사
고안	1941년경

2. 역사

1940년 아놀드 O. 베크만(Arnold O. Beckman)은 이전 분광광도계의 자외선 흡수 문제를 해결한 새로운 분광광도계를 발명했다. 베크만은 내셔널 테크니컬 래보러토리스(이후 베크만 인스트루먼트 컴퍼니를 거쳐 베크만 쿨터(Beckman Coulter)가 됨)의 동료들과 함께 이 기기를 개발했다.^[6]

베크만은 초기 모델 A, B, C를 거쳐 DU 분광광도계로 알려진 Model D를 개발했다. 이 기기는 1941년부터 1976년까지 생산되었으며, 당시 가격은 723USD였다.^[6] 브루스 메리필드(Bruce Merrifield)는 이 기기를 "생명 과학 발전에 기여한 가장 중요한 기기"라고 평가했다.^[7]

1979년 휴렛 패커드(Hewlett-Packard)는 최초의 상용 다이오드 어레이 분광광도계인 HP 8450A를 개발했다.^[9] 이 기기는 여러 파장을 동시에 스캔할 수 있었다.^[10] 이후 분광광도계는 현대의 가장 혁신적인 기기 중 하나가 되었다.

2. 1. 개발 배경

1940년 아놀드 O. 베크만(Arnold O. Beckman)이 분광광도계를 발명했다. 이는 1935년에 설립된 그의 회사 내셔널 테크니컬 래보러토리스(National Technical Laboratories, 이후 베크만 인스트루먼트 컴퍼니(Beckman Instrument Company)를 거쳐 베크만 쿨터(Beckman Coulter)가 됨) 동료들의 도움을 받아 이루어졌다.^[6] 이전 분광광도계는 자외선을 제대로 흡수하지 못하는 문제가 있었는데, 베크만은 이를 해결하고자 했다.

처음에는 유리 프리즘을 사용하여 UV 광을 흡수하는 Model A를 개발했으나, 만족스러운 결과를 얻지 못했다. Model B에서는 유리 프리즘 대신 석영 프리즘을 사용하여 흡광도 결과를 개선했다. 이후 파장 분해능을 조정한 Model C가 세 대 생산되었다. 마지막 모델이자 가장 인기 있었던 Model D는 현재 DU 분광광도계로 더 잘 알려져 있으며, 기기 케이스, 자외선 연속 스펙트럼을 가진 수소 램프, 더 나은 단색화 장치를 포함했다.^[6] 이 기기는 1941년부터 1976년까지 생산되었으며, 1941년 당시 가격은 723USD였다(원거리 자외선 액세서리는 추가 비용 선택 가능). 노벨 화학상 수상자 브루스 메리필드(Bruce Merrifield)는 이 기기를 "생명 과학 발전에 기여한 가장 중요한 기기일 것"이라고 평가했다.^[7]

1976년 단종된 후,^[8] 휴렛 패커드(Hewlett-Packard)는 1979년에 HP 8450A로 알려진 최초의 상용 다이오드 어레이 분광광도계를 개발했다.^[9] 다이오드 어레이 분광광도계는 베크만이 만든 원래의 분광광도계와 달리, 최초의 단일빔 마이크로프로세서 제어 분광광도계로서, 수 초 안에 여러 파장을 동시에 스캔할 수 있었다. 시료에 다색광을 조사하면 시료는 특성에 따라 빛을 흡수하고, 회절격자를 통해 광다이오드 어레이로 전달되어 스펙트럼의 파장 영역을 검출한다.^[10] 이후 분광광도계 기기 개발과 구현은 크게 증가하여, 현대의 가장 혁신적인 기기 중 하나가 되었다.

2. 2. 초기 모델

1940년에 아놀드 O. 베크만(Arnold O. Beckman)이 발명한 분광광도계는 1935년에 설립된 그의 회사인 내셔널 테크니컬 래보러토리스(National Technical Laboratories, 이후 베크만 인스트루먼트 컴퍼니(Beckman Instrument Company)가 되었고 궁극적으로 베크만 쿨터(Beckman Coulter)가 됨) 동료들의 도움을 받아 만들어졌다. 이는 이전에 만들어진 자외선을 제대로 흡수하지 못하는 분광광도계의 문제를 해결하기 위한 것이었다. 그는 유리 프리즘을 사용하여 UV 광을 흡수하는 Model A를 발명하는 것으로 시작했다. 그러나 이것으로는 만족스러운 결과를 얻을 수 없다는 것이 밝혀졌다. 따라서 Model B에서는 유리 프리즘 대신 석영 프리즘을 사용하여 흡광도 결과를 개선했다. 그 후, 파장 분해능을 조정한 Model C가 탄생했고, 총 세 대가 생산되었다. 마지막이자 가장 인기 있는 모델은 Model D였는데, 이는 현재 DU 분광광도계로 더 잘 알려져 있으며, 기기 케이스, 자외선 연속 스펙트럼을 가진 수소 램프, 그리고 더 나은 단색화 장치를 포함하고 있다.^[6] 이 기기는 1941년부터 1976년까지 생산되었으며, 1941년 당시 가격은 723USD였다(원거리 자외선 액세서리는 추가 비용으로 선택 가능). 노벨 화학상 수상자인 브루스 메리필드(Bruce Merrifield)의 말에 따르면, 이것은 "생명 과학 발전에 기여한 가장 중요한 기기일 것"이라고 한다.^[7]

2. 3. 현대적 발전

아놀드 O. 베크만(Arnold O. Beckman)이 1940년에 발명한 분광광도계는 1935년에 설립된 내셔널 테크니컬 래보러토리스(National Technical Laboratories, 이후 베크만 인스트루먼트 컴퍼니(Beckman Instrument Company)를 거쳐 베크만 쿨터(Beckman Coulter)가 됨) 동료들의 도움을 받아 만들어졌다. 이는 이전에 만들어진 분광광도계가 자외선을 제대로 흡수하지 못하는 문제를 해결하기 위한 것이었다.^[6] 베크만은 유리 프리즘을 사용하여 UV 광을 흡수하는 Model A를 개발했지만, 만족스러운 결과를 얻지 못했다. Model B에서는 유리 프리즘 대신 석영 프리즘을 사용하여 흡광도 결과를 개선했다. 이후 파장 분해능을 조정한 Model C가 세 대 생산되었다. 마지막 모델이자 가장 인기 있었던 Model D(현재 DU 분광광도계로 더 잘 알려짐)는 기기 케이스, 자외선 연속 스펙트럼을 가진 수소 램프, 더 나은 단색화 장치를 포함했다.^[6] 이 기기는 1941년부터 1976년까지 생산되었으며, 1941년 당시 가격은 723USD였다(원거리 자외선 액세서리는 추가 비용 선택 가능). 노벨 화학상 수상자 브루스 메리필드(Bruce Merrifield)는 이 기기를 "생명 과학 발전에 기여한 가장 중요한 기기일 것"이라고 평가했다.^[7]

1976년 DU 분광광도계가 단종된 후,^[8] 휴렛 패커드(Hewlett-Packard)는 1979년에 HP 8450A로 알려진 최초의 상용 다이오드 어레이 분광광도계를 개발했다.^[9] 다이오드 어레이 분광광도계는 베크만이 만든 원래의 분광광도계와 달리, 최초의 단일빔 마이크로프로세서 제어 분광광도계로서, 수 초 안에 여러 파장을 동시에 스캔할 수 있었다. 시료에 다색광을 조사하면 시료는 그 특성에 따라 빛을 흡수한다. 흡수된 빛은 회절격자를 통해 광다이오드 어레이로 전달되어 스펙트럼의 파장 영역을 검출한다.^[10] 이후 분광광도계 기기의 개발과 구현은 크게 발전하여 현대의 가장 혁신적인 기기 중 하나가 되었다.

3. 원리

분광광도법은 빛이 물질을 통과할 때 흡수되는 정도를 측정하여 물질의 농도를 분석하는 방법이다. 측정에는 분광광도계(spectrophotometer)라는 장치가 사용된다.

일반적으로 빛(백색광)이 물체에 닿으면 반사, 흡수, 투과 등의 현상이 일어난다. 이때 물체에 의해 흡수되는 빛의 양은 물질의 농도에 따라 달라진다. 이러한 빛의 흡수 현상을 이용하여 시료 용액 속 화학 물질의 양을 정량적으로 분석할 수 있다. 주로 자외선(180~320nm) 및 가시광선(320~800nm) 영역의 빛 흡수를 이용하며, 적외선 흡수 분광법은 화학 분자의 작용기에 대한 정보를 제공하여 분자 구조 확인에 활용된다.^[16]

분광광도계는 광원, 단색화 장치, 검출기로 구성된다. 광원에는 텅스텐 램프, 중수소 아크 램프, 글로바, 헬륨-네온 레이저, 레이저 다이오드 등이 사용된다. 단색화 장치는 빛을 각 성분 파장으로 분산시키고 좁은 띠의 파장을 선택하여 시료 또는 검출기로 보낸다. 검출기는 광자가 검출기에 도달할 때 발생하는 전기 신호를 이용하여 흡광도를 측정한다.^[16]

분광광도계는 홑살형(단일빔)과 겹살형(이중빔)으로 나뉜다. 홑살형 분광광도계는 광원에서 나온 빛이 단색화 장치를 거쳐 시료를 통과한 후 검출기에서 측정되는 방식이다. 겹살형 분광광도계는 회전 거울을 이용하여 빛이 시료와 기준 큐벳에 교대로 지나가도록 하여 두 시료를 통과한 빛의 세기를 연속적으로 비교한다. 겹살형은 광원의 세기나 검출기 감응 변화를 자동 보정하지만, 홑살형보다 비싸다.^[16]

분광광도계의 작동 순서는 다음과 같다.

# 광원에서 나온 빛이 시료를 통과한다.

# 시료는 빛의 일부를 흡수한다.

# 검출기는 시료를 통과한 빛의 양을 측정한다.

# 측정된 빛의 양은 수치로 표시되거나 컴퓨터로 전송되어 처리된다.

분광광도계는 "영점 조정"이라는 보정 과정을 거치는데, 이는 기준 물질의 투과율을 기준으로 설정하여 다른 물질의 투과율을 상대적인 값으로 기록하는 것이다.

3. 1. 빛의 흡수와 투과

분광광도법에서 빛이 시료를 통과하면 시료에 의해 빛이 흡수되어 빛의 강도가 약해진다. 시료 용액을 통과한 빛의 양(투과율, T)은 흡광 물질이 없을 때의 빛의 강도($I_0$)에 대한 흡광 물질이 있을 때의 빛의 강도($I$)의 비율, 즉 $T = I/I_0$로 표시된다. 빛의 통과율은 항상 1보다 작으며, %로 표시할 수 있다.^[16]

빛의 통과율은 시료의 농도와 특별한 상관관계를 나타내지 않지만, 로그 함수는 시료의 농도와 일정한 상관관계를 보인다.

:-log T = K × C

여기서 C는 시료 중 흡광 물질의 농도이고, K는 상수이다. 위 식에서 -log T를 흡광도(A)라고 하면, 흡광도는 시료의 농도와 특별한 상관관계(A = K × C)를 가지며, 이 관계를 비어-람베르트 법칙(Beer's law)이라고 한다. 하지만 시료의 흡광도는 시료 중 흡광 물질의 농도뿐만 아니라 큐벳(cuvette)의 직경 또는 폭에 따라서도 달라진다. 또한 흡광도는 물질 고유의 특성인 몰 흡수 계수(ε)에 따라서도 달라진다. 따라서 비어-람베르트 법칙은 다음과 같이 쓸 수 있다.^[16]

:A = ε × b × c

여기서 A는 흡광도, ε는 물질 고유의 흡광 계수, b는 큐벳의 직경 또는 폭, c는 흡광 물질의 농도이다. 시료 용액의 흡광도는 대조구(blank test)의 흡광도에 대한 비율이므로 단위가 없으며, 시료 중 흡광 물질의 농도와 정의 상관관계를 가진다. 따라서 표준 용액의 농도에 대한 흡광도를 얻으면 미지 농도 시료의 농도를 계산할 수 있다.^[16]

빛의 흡수는 빛과 분자의 전자 및 진동 모드의 상호 작용 때문에 발생한다. 각 유형의 분자는 화학 결합과 원자핵의 구성과 관련된 개별적인 에너지 준위 집합을 가지므로, 특정 파장 또는 에너지의 빛을 흡수하여 고유한 스펙트럼 특성을 나타낸다.^[22]

3. 2. 투과율과 흡광도

빛이 시료를 통과하면 시료에 의해 빛이 흡수되어 빛의 강도가 약해진다. 시료 용액을 통과한 빛의 양(투과율, T)은 흡광 물질이 없을 때의 빛의 강도($I_0$)에 대한 흡광 물질이 있을 때의 빛의 강도(I)의 비율, 즉 T = I / $I_0$로 표시된다. 따라서 빛의 투과율은 항상 1보다 작으며, 백분율(%)로도 나타낼 수 있다.

빛의 투과율은 시료의 농도와 직접적인 상관관계를 나타내지 않지만, 투과율의 로그 함수는 시료의 농도와 일정한 상관관계를 보인다.

log T = K × C

여기서 C는 시료 중 흡광 물질의 농도이고, K는 상수이다. 위 식에서 -log T를 흡광도(Absorbance, A)라고 하면, 흡광도는 시료의 농도와 A = K × C 의 관계를 가지며, 이를 비어-람베르트 법칙(Beer's law)이라고 한다.

하지만 시료의 흡광도는 시료 중 흡광 물질의 농도뿐만 아니라 큐벳(cuvette)의 직경 또는 폭에 따라서도 달라진다. 또한 흡광도는 물질 고유의 특성인 몰 흡수 계수(molar absorptivity, ε)에 따라서도 달라진다. 따라서 비어-람베르트 법칙은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

A = ε × b × c

여기서 A는 흡광도, ε는 물질 고유의 흡광 계수, b는 큐벳의 직경 또는 폭, c는 흡광 물질의 농도를 의미한다. 시료 용액의 흡광도는 대조구(blank test)의 흡광도에 대한 비율이므로 단위가 없으며, 시료 중 흡광 물질의 농도와 정비례 관계를 가진다. 따라서 표준 용액의 농도에 대한 흡광도를 얻으면 미지 농도 시료의 농도를 계산할 수 있다.

3. 3. 비어-람베르트 법칙(Beer-Lambert Law)

비어-람베르트 법칙(Beer–Lambert law)은 빛이 물질을 통과할 때 빛의 흡수 정도를 나타내는 법칙이다. 이 법칙은 빛의 흡수량이 시료의 농도와 빛이 통과하는 거리(큐벳의 폭)에 비례한다는 것을 설명한다.

분광광도법에서 빛의 흡수 현상을 이용하면 시료 용액 속에서 빛을 흡수하는 화학 물질의 양을 정량적으로 측정할 수 있다. 시료 용액이나 적절한 시약을 넣어 발색시킨 용액의 흡광도를 측정하는데, 주로 자외선(180~320nm) 및 가시광선(320~800nm) 영역에서 빛의 흡수를 이용한다.^[16]

빛이 시료를 통과하면 시료에 의해 빛이 흡수되어 빛의 강도가 약해진다. 시료 용액을 통과한 빛의 양(투과율, T)은 흡광 물질이 없을 때의 빛의 강도(I0^영어)에 대한 흡광 물질이 있을 때의 빛의 강도(I)의 비율, 즉 T = I/I0^영어로 표시된다. 빛의 투과율은 항상 1보다 작으며, 백분율(%)로 표시할 수 있다.

빛의 투과율은 시료의 농도와 특별한 상관관계를 나타내지 않지만, 그 로그 함수는 시료의 농도와 일정한 상관관계를 가진다.

:-log T = K × C

여기서 C는 시료 중 흡광 물질의 농도이고, K는 상수이다. 위 식에서 -log T를 흡광도(A)라고 하면, 흡광도는 시료의 농도와 특별한 상관관계(A = K × C)를 가지게 되며, 이 관계를 비어-람베르트 법칙이라고 한다.

하지만 시료의 흡광도는 시료 중 흡광 물질의 농도뿐만 아니라, 큐벳의 직경 또는 폭에 따라서도 달라진다. 또한 흡광도는 물질 고유의 특성인 몰 흡광 계수(ε)에 따라서도 달라진다. 그러므로 비어-람베르트 법칙은 다음과 같이 쓸 수 있다.

:A = ε × b × c

여기서 A는 흡광도, ε는 물질 고유의 흡광 계수, b는 큐벳의 직경 또는 폭, c는 흡광 물질의 농도를 나타낸다. 시료 용액의 흡광도는 대조구(blank test)의 흡광도에 대한 비율이므로 단위가 없으며, 시료 중 흡광 물질의 농도와 정비례 관계를 가진다. 따라서 표준 용액의 농도에 대한 흡광도를 얻으면 미지 농도 시료의 농도를 계산할 수 있다.

작은 범위 내에서 비어-람베르트 법칙이 적용되며 샘플 간의 흡광도는 농도에 따라 선형적으로 변한다.

4. 구성 요소

분광광도계는 크게 광원, 단색화장치, 검출기로 구성된다.^[16] 측정 방식에 따라 홑살형(single-beam)과 겹살형(double-beam)으로 나뉜다. 홑살형은 광원에서 나온 빛이 단색화 장치를 통해 좁은 띠의 파장으로 분리된 후 시료를 통과하여 검출기에서 측정된다. 겹살형은 회전 거울을 이용하여 빛을 시료와 기준 큐벳에 번갈아 통과시킨다. 겹살형은 두 빛의 세기를 연속적으로 비교하여 시간과 파장에 따른 광원 세기나 검출기 감응 변화를 자동 보정한다.^[16]

4. 1. 광원 (Light Source)

분광광도계의 광원에는 다음이 포함된다.

텅스텐 램프: 320-2500nm 영역의 복사선을 방출한다.
중수소 아크 램프: 200-400nm 영역의 자외선을 방출한다.
글로바: 4000-200cm^-1의 적외선 복사선을 방출한다.
헬륨-네온 레이저: 638nm의 빛을 방출한다.
레이저 다이오드: 680-1550nm의 근적외선을 방출한다.^[16]

4. 2. 단색화 장치 (Monochromator)

분광광도계에서 단색화 장치는 빛을 각 성분 파장으로 분산시키고 좁은 띠의 파장을 선택하여 시료 또는 검출기로 보내는 역할을 한다.^[16]

역사적으로 분광광도계는 분석 스펙트럼을 생성하기 위해 회절격자가 포함된 단색화 장치를 사용했다. 격자는 이동식이거나 고정식일 수 있다. 단일 검출기를 사용하는 경우, 검출기가 각 파장에서 빛의 강도를 측정할 수 있도록 격자를 단계적으로 스캔할 수 있다(스캐닝 분광광도계). 전하결합소자(CCD) 또는 광다이오드 어레이(PDA)와 같은 검출기 어레이를 사용할 수도 있다(어레이 분광광도계). 이러한 시스템에서는 격자가 고정되어 있고 각 파장의 빛의 강도는 어레이의 다른 검출기에 의해 측정된다.^[11]

광원 램프의 빛은 단색화 장치를 통과하여 회전하는 프리즘을 통해 파장의 "무지개"로 빛을 회절시키고, 단색화 장치의 출력 측면에 있는 기계적 슬릿을 통해 이 회절 스펙트럼의 좁은 대역폭을 출력한다.^[12]

4. 3. 시료 셀 (Sample Cell, Cuvette)

분광광도법에서 시료는 일반적으로 큐벳에 넣어 측정한다. 측정하고자 하는 파장 영역에 따라 사용하는 큐벳의 재질이 달라진다. 유리 및 플라스틱은 가시광선 영역에서, 석영은 자외선 영역에서 주로 사용된다.^[16]

4. 4. 검출기 (Detector)

검출기는 광자가 검출기에 도달할 때 발생하는 전기 신호를 이용하여 흡광도를 측정한다. 이때 전류의 세기와 복사 세기는 비례한다는 사실을 이용한다.^[16]

5. 종류

분광광도계는 빛을 이용하여 물질의 특성을 분석하는 장치로, 크게 홑살형(단일빔)과 겹살형(이중빔)으로 나뉜다. 홑살형은 광원에서 나온 빛이 단색화 장치를 거쳐 시료를 통과한 후 검출기에서 측정되는 방식이다. 겹살형은 빛이 회전 거울에 의해 시료와 기준 큐벳에 번갈아 가며 지나가, 두 시료를 통과한 빛의 세기를 비교하여 광원의 세기나 검출기 감응 변화를 보정한다.

분광광도법은 측정하는 빛의 종류 및 파장 대역에 따라 다음과 같이 분류할 수 있다.

자외-가시선 분광광도계 (UV-vis spectrophotometer): 자외선 및 가시광선 영역(200-800 nm)에서 빛의 흡수를 측정한다. 무기 및 유기 화합물의 정량 분석에 주로 사용된다.^[16]
적외선 분광광도계 (Infrared spectrophotometer): 적외선 영역의 빛 흡수를 측정하여 화학 결합 및 작용기를 확인한다.
원자흡수 분광광도계 (Atomic absorption spectrophotometer, AAS): 기화된 분석물 원자에 의한 빛의 흡수를 이용하여 금속 및 준금속의 농도를 측정한다.
형광 분광광도계 (Fluorescence spectrophotometer): 시료에서 방출되는 형광의 세기를 측정한다. 고유 형광 또는 유도 형광을 가진 시료의 고감도 분석에 사용된다.
컬러리미터 (Colorimeter): 색도 분석 및 검사를 위해 빛의 흡수를 측정하는 간단한 분광광도계이다.^[13]

이 외에도, 전하결합소자(CCD) 또는 광다이오드 어레이(PDA) 검출기를 사용하는 어레이 분광광도계도 있다.

5. 1. 단일빔 분광광도계 (Single-beam Spectrophotometer)

분광광도계는 단일빔형과 이중빔형 두 가지 종류가 있다. 이중빔 분광광도계^[11]는 기준 시료와 시험 시료를 각각 다른 빛 경로에 놓고 두 경로의 빛 강도를 비교한다. 반면 단일빔 분광광도계는 시험 시료를 넣기 전과 후의 상대적인 빛 강도를 측정한다. 이중빔 방식이 더 쉽고 안정적이지만, 단일빔 방식은 동적 범위가 더 크고 광학적으로 단순하며 크기가 작다는 장점이 있다. 또한 현미경이나 망원경에 부착된 분광광도계와 같이 특수한 기기는 실용성 때문에 단일빔 방식을 사용한다.^[24]

홑살형 분광광도계(single-beam spectrophotometer)는 광원에서 나온 빛이 단색화 장치를 통해 좁은 띠의 파장으로 분리된 후 시료를 통과하고 검출기에서 측정되는 원리로 작동한다. 홑살형 분광광도계는 시료와 기준을 번갈아 빛살에 놓아야 하므로 불편하고, 광원 세기와 검출기 감응도 변화가 시간에 따라 측정되는 반응 속도 실험에는 적합하지 않다.

5. 2. 이중빔 분광광도계 (Double-beam Spectrophotometer)

이중빔 분광광도계는 빛을 시료와 기준 큐벳에 교대로 통과시킨다.^[11] 회전 거울을 사용하여 빛의 진행 방향을 바꾸며, 빛살은 1초에 여러 번 분할된다.^[11] 회로는 투광도와 흡광도를 얻기 위해 시료에서 나오는 빛의 조사도(P)와 기준 큐벳에서 나오는 빛의 조사도(P0)를 자동적으로 비교한다.^[11] 이처럼 두 시료를 통과한 빛의 세기를 연속적으로 비교하므로, 시간과 파장에 따른 광원 세기나 검출기 감응 변화를 자동 보정한다.^[11]

이중빔 분광광도계는 기준 시료와 시험 시료를 각각 다른 빛 경로에 놓고, 두 경로의 빛 강도를 비교하는 방식이다. 이중빔 방식은 측정의 편리성과 안정성이 높다.^[11]

분광측색계는 크게 단일빔 방식과 이중빔 방식으로 나뉘며, 이중빔 분광측색계는 두 빛 경로의 광도 비율을 측정한다.^[24]

5. 3. 어레이 분광광도계 (Array Spectrophotometer)

전하결합소자(CCD) 또는 광다이오드 어레이(PDA)와 같은 검출기 어레이를 사용하는 시스템에서는 격자가 고정되어 있고 각 파장의 빛의 강도는 어레이의 다른 검출기에 의해 측정된다.^[11]

어레이 분광광도계에서 빛이 시료에 닿아 흡수되고, 흡수되지 않은 빛은 반사 격자를 통해 굴절되어 광검출기에 도달한다. 이후 전자 회로를 통해 선형 투과율 백분율 및/또는 흡광도/농도 값으로 변환되는 과정은 다음과 같다.^[12]

# 광원이 시료에 비춰지고 슬릿에 초점이 맞춰진다.

# 투과된 빛은 반사 격자를 사용하여 무지개로 굴절된다.

# 결과적으로 생성된 빛은 광검출기 장치에 도달하여 빔의 강도를 비교한다.

# 전자 회로는 상대 전류를 선형 투과율 백분율 및/또는 흡광도/농도 값으로 변환한다.

광센서 어레이를 사용하는 분광광도계도 있다.

6. 활용 분야

분광광도법은 물리학, 재료 과학, 화학, 생화학, 화학 공학, 분자 생물학 등 다양한 과학 분야에서 활용된다.^[4] 뿐만 아니라 반도체, 레이저 및 광학 제조, 인쇄 및 법의학 검사와 같은 산업 현장과 화학 물질 연구를 위한 실험실에서도 널리 사용된다.

분광광도계는 일반적으로 용액, 투명하거나 불투명한 고체(예: 연마된 유리) 또는 기체의 투과율이나 반사율을 측정하는 데 사용된다.

천문학에서는 천체의 스펙트럼 측정에 사용되며, 지구 대기의 빛 흡수를 보정하여 플럭스 척도를 파장의 함수로 보정한다.^[5]

분광광도법은 다음과 같이 활용된다.

화학: 시료 용액 속에서 빛을 흡수하는 화학 물질의 양을 정량하거나, 적외선 분광법을 통해 분자 구조를 확인한다.
생화학: DNA, RNA 및 단백질 분리, 효소 반응 속도 및 생화학 분석 등에 활용된다.^[14]
재료 과학: 비색정량을 통해 잉크, 인쇄, 직물 등의 색상 품질 관리에 사용된다.
환경 과학: 시료 용액 내 화학 물질의 농도를 정량한다.
의학/약학: 자외선-가시선 분광광도계를 이용하여 무기 및 유기 화합물을 정량 분석하거나, 적외선 분광광도계를 사용하여 화학 결합 및 작용기를 확인한다.

6. 1. 화학

빛(백색광)이 물체에 닿으면, 빛은 물체의 표면에서 반사되거나, 표면 내부로 약간 들어간 후 반사되거나, 물체에 흡수되거나, 물체를 통과한다. 이때 물체에 흡수되는 빛의 양은 그 농도에 따라 달라진다. 이러한 빛의 흡수 현상을 이용하여 시료 용액 속에서 빛을 흡수하는 화학 물질의 양을 정량할 수 있다. 이를 흡광도법이라고 하며, 주로 자외선(180~320nm) 및 가시광선(320~800nm) 영역에서 빛의 흡수를 이용한다. 적외선 흡수 분광법은 화학 분자의 작용기에 대한 특성 스펙트럼을 비교적 쉽게 얻을 수 있으며, 광학 이성질체를 제외한 물질들의 스펙트럼이 다르므로 분자 구조 확인에 필요한 정보를 제공한다. 따라서 적외선 흡수 분광법은 무기 및 유기 화학을 포함한 모든 화학 분야에서 널리 사용된다.^[13]

빛이 시료를 통과하면 시료에 의해 빛이 흡수되어 빛의 강도가 약해진다. 시료 용액을 통과한 빛의 양(transmittance, T)은 흡광 물질이 없을 때의 빛의 강도()에 대한 흡광 물질이 있을 때의 빛의 강도()의 비율, 즉 = /로 표시된다. 따라서 빛의 통과율은 항상 1보다 작으며, 백분율(%)로 표시할 수 있다.

빛의 통과율은 시료의 농도와 특별한 상관관계를 나타내지 않지만, 로그 함수는 시료의 농도와 일정한 상관관계를 보인다.

log = ×

여기서 는 시료 중 흡광 물질의 농도이고, 는 상수이다. 위 식에서 -log 를 흡광도(absorbance, )라고 하면, 흡광도는 시료의 농도와 특별한 상관관계( = × )를 가지며, 이 관계를 비어-람베르트 법칙이라고 한다. 하지만 시료의 흡광도는 시료 속 흡광 물질의 농도뿐만 아니라 큐벳의 직경이나 폭에 따라서도 달라진다. 또한 흡광도는 물질 고유의 특성에 따라 달라지는데, 이를 몰 흡수 계수(molar absorptivity)라고 하며, 로 표시한다. 따라서 비어-람베르트 법칙은 다음과 같이 쓸 수 있다.

= × ×

여기서 는 흡광도, 는 물질 고유의 흡광 계수, 는 큐벳의 직경 또는 폭, 는 흡광 물질의 농도를 나타낸다. 시료 용액의 흡광도는 대조구(blank test)의 흡광도에 대한 비율이므로 단위가 없으며, 시료 속 흡광 물질의 농도와 양의 상관관계를 가진다. 따라서 표준 용액의 농도에 대한 흡광도를 얻으면 미지 농도 시료의 농도를 계산할 수 있다.

일반적인 분광광도계의 종류는 다음과 같다.

종류	설명
자외-가시선 분광광도계 (UV-vis spectrophotometer)	자외선 및 가시광선 영역(200-800 nm)에서 빛의 흡수를 측정한다. 많은 무기 및 유기 화합물의 정량 분석에 사용된다.
적외선 분광광도계 (Infrared spectrophotometer)	적외선 빛의 흡수를 측정하여 화학 결합 및 작용기를 확인하는 데 사용된다.
원자흡수 분광광도계 (Atomic absorption spectrophotometer, AAS)	기화된 분석물 원자에 의한 빛의 흡수를 이용하여 금속 및 준금속의 농도를 측정한다.
형광 분광광도계 (Fluorescence spectrophotometer)	여기 후 시료에서 방출되는 형광의 세기를 측정한다. 고유 형광 또는 유도 형광을 가진 시료의 고감도 분석을 가능하게 한다.
컬러리미터(Colorimeter)	색도 분석 및 검사를 위해 빛의 흡수를 측정하는 데 사용되는 간단한 분광광도계이다.^[13]

대부분의 분광광도계는 자외선 및 가시광선 영역에서 사용되며, 일부 기기는 근적외선 영역에서도 작동한다. 400–700nm 가시광선 영역 분광광도법은 색채측정 과학에서 광범위하게 사용된다. 0.2–0.8 O.D. 범위에서 가장 잘 작동하는 것으로 알려져 있다. 잉크 제조업체, 인쇄 회사, 섬유 판매업체 등은 색채측정을 통해 제공되는 데이터를 필요로 한다. 가시광선 영역을 따라 5–20나노미터마다 판독값을 읽고 분광 반사율 곡선 또는 대체 표현을 위한 데이터 스트림을 생성한다.

기존의 가시광선 영역 분광광도계는 색소 또는 기본 재료에 형광이 있는지 감지할 수 없다. 색소에 형광이 포함된 경우 이중 스펙트럼 형광 분광광도계를 사용한다. 가시 스펙트럼 분광광도계에는 d/8(구형)과 0/45의 두 가지 주요 설정이 있다. 과학자들은 이 기기를 사용하여 샘플 내의 화합물 양을 측정한다. 화합물의 농도가 높을수록 샘플에 의해 더 많은 빛이 흡수된다. 작은 범위 내에서 비어-람베르트 법칙이 적용되며 샘플 간의 흡광도는 농도에 따라 선형적으로 변한다.

샘플은 일반적으로 큐벳에서 준비된다. 관심 영역에 따라 유리, 플라스틱(관심 영역이 가시광선 영역인 경우), 또는 석영(관심 영역이 원자외선 영역인 경우)으로 만들어질 수 있다.

용존 유기 탄소(dissolved organic carbon) 농도 추정
방향족성 지표로서의 특정 자외선 흡광도(Specific ultraviolet absorbance)
펜토스(pentoses) 농도 측정을 위한 비알 시험(Bial's test)

6. 2. 생화학

분광광도법은 생화학에서 DNA, RNA 및 단백질 분리, 효소 동력학, 생화학 분석 등 다양한 실험에 활용되는 중요한 기술이다.^[14] 시료를 파괴하지 않고 분석할 수 있으며, 마이크로 볼륨 플랫폼을 사용하면 1µL 정도의 극소량 시료로도 분석이 가능하여 귀중한 샘플을 절약할 수 있다.^[15]

분광광도법의 기본 원리는 블랭크 시료(착색 화합물 없음)와 착색 화합물이 포함된 시료의 흡광도를 비교하는 것이다. 착색은 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250 염료(595nm에서 측정)와 같이 염료를 사용하거나, β-갈락토시다제와 ONPG의 효소 반응(420nm에서 측정)을 통해 이루어질 수 있다.^[16] 분광광도계는 가시광선 영역(350nm~800nm)에서 착색된 화합물을 측정하여,^[16] 연구 대상 물질에 대한 다양한 정보를 제공한다.

생화학 실험에서 분광광도법은 다음과 같은 다양한 목적으로 사용된다.

시료의 최적 파장 흡광도 결정
시료 흡광도의 최적 pH 결정
미지 시료의 농도 결정
다양한 시료의 pKa 결정^[16]
단백질 정제^[17]

분광광도계 데이터를 활용하여 맥주-람베르트 법칙(

A=-\log_{10}T=\epsilon cl=OD

)을 통해 투과율, 흡광도, 농도 간의 관계를 파악할 수 있다.^[16] 염료 결합 물질을 첨가하여 색 변화를 유도하고, 이를 통해 화합물의 농도를 측정할 수도 있다.^[18] 두 성분 혼합물의 경우, 각 성분의 표준 용액 흡수 스펙트럼을 이용하여 혼합물 내 각 성분의 농도를 계산할 수 있다.^[19]

큐벳 기반 비표지 분광법은 빛의 경로에 광학 필터를 추가하여 헨드 법칙에 따라 시료의 농도, 크기, 굴절률을 정량화하는 방법이다.^[20]

분광광도법은 DNA, RNA, 단백질의 정성 및 정량 분석에 모두 사용될 수 있다. 정성 분석에서는 분광광도계를 사용하여 넓은 파장 영역에서 화합물의 흡광 특성을 나타내는 스펙트럼을 기록한다.^[22] 예를 들어, 다양한 단백질 혼합물에서 β-갈락토시다아제를 분리하는 실험에서 분광광도법을 활용할 수 있다. 이 경우, 분광광도법은 총 단백질 농도에 대한 샘플의 정제량을 정량화하는 데 효과적이다. 친화 크로마토그래피를 통해 β-갈락토시다아제를 분리하고, 수집된 시료를 (ONPG)와 반응시켜 시료의 색 변화(노란색)를 확인한다.^[16] ONPG와의 반응은 420nm에서, 브래드포드 분석은 595nm에서 측정하여 정제량을 정량적으로 평가한다.^[16] 이 외에도 분광광도법은 SDS-PAGE 전기영동과 같은 다른 기법과 함께 다양한 단백질 시료를 정제하고 분리하는 데 사용된다.

6. 3. 재료 과학

분광광도법은 재료 과학 분야에서 널리 활용되는 기술이다. 특히 400nm부터 700nm의 가시광선을 이용하는 분광측색계는 비색정량(colorimetry)에 사용되어 잉크 제조업체, 인쇄업체, 직물 제조업체 등에서 색상 품질 관리에 중요한 역할을 한다.^[13] 가시광선 분광측색계는 일반적으로 가시광선 스펙트럼 범위를 20나노미터 간격으로 측정하여 스펙트럼 반사율 곡선을 작성하고, 이를 통해 새로운 착색제가 원하는 색상을 나타내는지 확인한다.

일반적인 가시광선용 분광측색계는 시료의 형광성 여부를 감지할 수 없다는 단점이 있다. 따라서 형광성이 있는 착색료를 다룰 때는 bi-spectral 형광 분광측색계를 사용해야 한다. 가시광선 분광측색계에는 d/8(확산 조명, 8° 수광 방식)과 45/0(45° 링 조명, 수직 수광 방식)의 두 가지 주요 유형이 있다.

과학자들은 분광측색계를 사용하여 시료 내 화합물의 양을 측정한다. 화합물이 많을수록 빛 흡수량이 증가하며, 작은 범위에서는 람베르트-베르의 법칙에 따라 시료 농도와 빛 흡수 사이에 선형적인 관계가 성립한다. 시료는 일반적으로 큐벳에 넣어 측정하며, 측정 범위에 따라 유리, 합성수지, 석영 재질의 큐벳을 선택한다.

적외선을 주로 다루는 분광측색계는 적외선 센서의 특성과 열을 가진 물체가 적외선을 방출하는 특성 때문에 기술적으로 다른 분광측색계와 차이가 있다. 또한, 유리나 플라스틱이 적외선을 흡수하므로 염(소금)과 같은 특수한 광학 재료가 필요하다. 적외선 분광측색에서는 시료를 브롬화칼륨 원반 사이에 넣거나, 브롬화칼륨과 함께 갈아서 펠릿 형태로 만든다. 수용액 시료의 경우에는 불용성 염화은 셀을 사용한다.

6. 4. 환경 과학

분광광도법은 환경 과학 분야에서 시료 용액 내 화학 물질의 농도를 정량하는 데 사용된다. 빛이 시료를 통과할 때 시료에 의해 빛이 흡수되는 현상을 이용하며, 흡수되는 빛의 양은 농도에 따라 달라진다. 주로 자외선 및 가시광선 영역에서의 빛 흡수를 이용한다.^[1]

빛의 통과율(T)은 흡광 물질이 없을 때의 빛의 강도(I₀)에 대한 흡광 물질이 있을 때의 빛의 강도(I)의 비율(T = I/I₀)로 표시된다. 빛의 통과율은 시료 농도와 직접적인 상관관계를 나타내지 않지만, 그 로그 함수는 시료 농도와 일정한 상관관계를 보인다. (-log T = K × C, K는 상수). 여기서 -log T를 흡광도(A)라고 하면, 흡광도는 시료 농도와 비례 관계(A = K × C)를 가지며, 이를 비어의 법칙(Beer's law)이라고 한다.^[1]

하지만 시료의 흡광도는 농도뿐만 아니라 큐벳(cuvette)의 직경(폭)과 물질 고유의 특성(몰 흡수 계수, ε)에 따라서도 달라진다. 따라서 비어의 법칙은 A = ε × b × c 로 표현된다. (A: 흡광도, ε: 몰 흡수 계수, b: 큐벳 직경/폭, c: 흡광 물질 농도). 시료 용액의 흡광도는 대조구(blank test)의 흡광도에 대한 비율이므로 단위가 없으며, 표준 용액의 농도에 대한 흡광도를 통해 미지 농도 시료의 농도를 계산할 수 있다.^[1]

6. 5. 의학/약학

분광광도법은 의학 및 약학 분야에서 널리 활용된다. 자외-가시선 분광광도계(UV-vis spectrophotometer)는 자외선 및 가시광선 영역에서의 빛 흡수를 이용하여 무기 및 유기 화합물의 정량 분석에 사용된다.^[13] 적외선 분광광도계(Infrared spectrophotometer)는 적외선 흡수를 측정하여 화학 결합 및 작용기를 확인하는 데 사용된다.^[13]

6. 6. 기타

분광광도법은 특정 파장의 빛이 시료를 통과할 때 흡수되는 정도를 측정하여 시료 내 물질의 농도를 분석하는 방법이다. 주로 분광광도계라는 장치를 사용하며, 자외선(180~320nm) 및 가시광선(320~800nm) 영역의 빛 흡수를 이용한다.^[16]

분광광도계는 용액, 투명 또는 불투명 고체, 기체의 투과율이나 반사율을 측정하는 데 사용된다. 생화학 물질은 색을 띠는 경우가 많아 가시광선을 흡수하여 비색법으로 측정할 수 있다. 무색 물질도 발색 반응을 통해 비색 분석이 가능하다.^[16]

분광광도법은 물리학, 재료 과학, 화학, 생화학, 화학 공학, 분자 생물학 등 다양한 과학 분야에서 활용된다.^[4] 반도체, 레이저, 광학 제조, 인쇄, 법의학 검사 등 산업 분야와 화학 물질 연구 실험실에서도 널리 사용된다. 효소 활성 측정, 단백질 농도 결정, 효소 운동 상수 결정, 리간드 결합 반응 측정에도 사용된다.^[16]

천문학에서 분광광도법은 천체의 스펙트럼 측정에 사용되며, 지구 대기의 빛 흡수를 보정하여 플럭스 척도를 파장의 함수로 보정한다.^[5]
일반적인 분광광도계 종류

종류	설명
자외-가시선 분광광도계(UV-vis spectrophotometer)	자외선 및 가시광선 영역(200-800 nm)에서 빛의 흡수를 측정. 무기 및 유기 화합물 정량 분석에 사용.
적외선 분광광도계(Infrared spectrophotometer)	적외선 빛의 흡수를 측정하여 화학 결합 및 작용기 확인.
원자흡수 분광광도계(Atomic absorption spectrophotometer, AAS)	기화된 분석물 원자에 의한 빛의 흡수를 이용하여 금속 및 준금속 농도 측정.
형광 분광광도계(Fluorescence spectrophotometer)	여기 후 시료에서 방출되는 형광 세기 측정. 고유 형광 또는 유도 형광을 가진 시료의 고감도 분석 가능.
컬러리미터(Colorimeter)	색도 분석 및 검사를 위해 빛의 흡수를 측정하는 간단한 분광광도계.^[13]

분광광도법은 DNA, RNA, 단백질 분리, 효소 동력학, 생화학 분석 등 많은 생화학 실험에 사용되는 중요한 기술이다.^[14] 비파괴적 기술로, 소량(1µL)의 샘플로도 분석이 가능하여 귀중한 샘플을 절약할 수 있다.^[15]

생화학 실험에서 분광광도법은 샘플의 최적 파장 흡광도 결정, 흡광도의 최적 pH 결정, 미지 샘플 농도 결정, 다양한 샘플의 pKa 결정 등에 사용될 수 있다.^[16] 단백질 정제에도 유용하며, 화합물의 광학적 분석을 생성하는 방법으로도 활용된다.^[17]

가시광선 영역(400nm~700nm)을 다루는 분광광도계는 비색정량(colorimetry)에 사용된다. 잉크 제조업체, 인쇄업체, 직물 제조업체 등에서 활용되며, 가시광선 스펙트럼 범위를 20나노미터마다 측정하여 스펙트럼 반사율 곡선을 작성한다.

적외선 영역 측정은 기술적 요구사항 때문에 적외선 분광 광도계 설계가 다르다. 주요 요인은 분광 영역별 광센서 유형이며, 약 5 μm를 넘는 파장에서는 열복사로 인해 측정이 어렵다. 유리나 플라스틱은 적외선을 흡수하므로 염과 같은 광학 재료를 사용한다. 적외선 분광 광도법 시료는 브롬화칼륨 디스크 사이에 도포하거나 브롬화칼륨과 함께 갈아서 펠릿으로 압축한다. 수용액 측정에는 불용성 염화은을 사용한다.

참조

_[1] 서적 ISO 12647-2: Graphic technology — Process control for the production of halftone colour separations, proof and production prints — Part 2: Offset lithographic processes International Organization for Standardization 2013
_[2] 웹사이트 Spectrophotometry https://www.nist.gov[...] 2009-11-13
_[3] 서적 The essential guide to analytical chemistry Wiley 1997
_[4] 서적 Experimental Methods in Modern Biochemistry https://archive.org/[...] W. B. Saunders Company 1976
_[5] 학술지 Secondary standard stars for absolute spectrophotometry 1983
_[6] 뉴스 The first commercial UV-vis spectrophotometer http://go.galegroup.[...] 2006
_[7] 학술지 A Classic Instrument: The Beckman DU Spectrophotometer and Its Inventor, Arnold O. Beckman http://www.jbc.org/c[...] 2003-12-05
_[8] 학술지 History of spectrophotometry at Beckman Instruments, Inc 1977-03-01
_[9] 학술지 Hewlett Packard: Compound Identification with HP 8450 A UV Visible Spectrophotometer 1979-10-01
_[10] 서적 Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology Wiley & Sons 2015
_[11] 웹사이트 Fully Automatic Double Beam - Atomic Absorption Spectrophotometer (AA 8000) http://www.labindia-[...] Labindia Analytical Instruments Pvt. Ltd.
_[12] 웹사이트 Spectrophotometry Applications and Fundamentals https://www.mt.com/u[...] Mettler-Toledo International Inc.
_[13] 웹사이트 Spectrometer vs Spectrophotometer: What's the Difference? https://www.dnatesti[...] 2024-01-14
_[14] 학술지 Applied Spectrophotometry: Analysis of a Biochemical Mixture 2013-04-27
_[15] 웹사이트 FastTrack™ UV/VIS Spectroscopy https://www.mt.com/d[...] Mettler-Toledo AG, Analytical 2016
_[16] 서적 Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology Wiley & Sons
_[17] 학술지 Exploring Proteins Purification Techniques Animations as Tools for the Biochemistry Teaching. 2010-05-01
_[18] 서적 Biochemistry Cengage
_[19] 학술지 Spectrophotometry of proteins 1936-05-27
_[20] 학술지 Refractive index dispersion sensing using an array of photonic crystal resonant reflectors https://aip.scitatio[...]
_[21] 서적 Accuracy in Spectrophotometry and Luminescence Measurements: Proceedings https://babel.hathit[...] U.S. National Bureau of Standards
_[22] 서적 Fundamental laboratory approaches for biochemistry and biotechnology Wiley 2004
_[23] 서적 Experimental Methods in Modern Biochemistry W. B. Saunders Company 1976
_[24] 서적 Experimental Methods in Modern Biochemistry

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