형광 상관 분광학

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1. 개요
2. 역사
3. 방법 및 원리
4. 일반적인 형광 탐침 (Common Fluorescent Probes)
5. 다양한 FCS 기술 (Variations)
6. 다른 형광 동역학 접근법 (Other Fluorescent Dynamical Approaches)
- 6.1. 광퇴색 후 형광 회복 (Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP)
- 6.2. 입자 추적 (Particle Tracking)
7. 자동 형광 상관 분광법 (Auto-fluorescence Correlation Spectroscopy)
8. 2광자 및 3광자 FCS 여기 (Two- and Three-photon FCS Excitation)
참조

1. 개요

형광 상관 분광학(FCS)은 광학 현미경을 이용하여 형광 강도의 변동을 측정하고 분석하는 기술이다. 이 기술은 분자의 확산, 화학 반응, 상호 작용 등을 연구하는 데 사용되며, 생물학 분야에서 단백질 상호 작용 연구에 활용된다. FCS는 시간적 자기 상관 함수를 통해 확산 계수, 유체 회전 반경, 화학 반응 속도 등을 계산하며, 측정 장비는 레이저, 현미경, 검출기로 구성된다. FCS는 여러 변형 기술로 발전하여 FCCS, 밝기 분석 방법, FRET-FCS, 주사 FCS 등 다양한 분야에 적용되고 있다.

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형광 상관 분광학

2. 역사

신호 상관 기술은 1972년 Magde, Elson, Webb에 의해 형광에 처음으로 실험적으로 적용되었으며,^[5] 이들은 형광 상관 분광학(FCS)의 발명가로 널리 인정받는다. 이후 이들과 다른 연구자들에 의해 이론적 기초와 다양한 응용 분야가 확립되었다.^[6]^[7]^[8]

1990년경, 매우 적은 수의 형광 입자를 감지할 수 있게 되면서 두 가지 주요 과제가 등장했다. 하나는 형광 강도가 가우시안 분포를 따르지 않는 문제였고, 다른 하나는 레이저 현미경 시스템에서 3차원 공초점 측정 부피를 정확히 다루는 문제였다.^[9] 첫 번째 과제는 분자 정보를 추출하기 위해 형광 신호의 분포와 모멘트를 분석하는 연구로 이어졌고,^[10]^[11] 이는 결국 밝기 분석이라는 방법론으로 발전하게 되었다.^[12]

1993년부터^[13] 공초점 현미경과 이후 개발된 2광자 현미경 같은 발전된 측정 기술이 도입되었다. 이러한 기술들은 측정 부피를 더 정밀하게 정의하고 배경 신호를 효과적으로 제거하여 신호 대 잡음비를 크게 향상시켰으며, 단일 분자 수준의 감도를 가능하게 만들었다.^[14]^[15] 그 결과 FCS에 대한 관심이 다시 높아졌고, 2007년 8월 기준으로 Web of Science 데이터베이스에서 FCS를 활용한 논문이 3,000편 이상 검색될 정도로 연구가 활발해졌다.^[16] 또한 FCS 기술은 다양한 방식으로 확장되었다. 예를 들어, 고정된 한 지점에서 측정하는 방식을 넘어 레이저 주사 방식이나 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하기도 하고, 단일 형광 신호의 자기 상관 분석 대신 두 개의 다른 형광 채널 간의 교차 상관(FCCS)을 이용하거나, 형광 신호 자체 대신 Förster Resonance Energy Transfer(FRET) 현상을 활용하는 등의 새로운 시도들이 이루어졌다.

3. 방법 및 원리

형광 상관 분광학(FCS)은 일반적으로 광학 현미경, 특히 공초점 현미경이나 2광자 현미경을 이용하여 수행된다. 이 기술의 핵심 원리는 샘플 내 매우 작은 부피(미소 범위)에 레이저 빛을 집중시켜 조사하고, 그 영역을 통과하는 형광 분자들이 방출하는 형광 신호의 강도가 시간에 따라 미세하게 변동하는 현상, 즉 요동(fluctuation)을 측정하는 것이다.

측정된 형광 강도 데이터는 시간에 따른 신호 변화를 보여주는데, 이 신호의 파워 스펙트럼을 계산한 뒤 역 푸리에 변환을 적용하면 시간 영역에서의 상관관계 정보(시간 스펙트럼)를 얻을 수 있다. 이를 통해 시간적 자기 상관 함수를 계산하고 분석하는 것이 FCS의 기본 분석 과정이다.

형광 강도의 요동은 주로 관찰 부피 내 형광 분자의 확산 운동, 분자 간의 물리적 또는 화학적 반응(결합, 분해 등), 혹은 분자들이 서로 뭉치는 응집 현상 등에 의해 발생한다. 따라서 자기 상관 함수를 분석하면 이러한 동적 과정들에 대한 정보를 얻을 수 있다.

특히 생물학 분야에서는 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 표지를 이용해 특정 단백질 분자의 세포 내 움직임이나 다른 분자와의 상호 작용을 연구하는 데 FCS가 유용하게 활용된다. 실험적으로 얻어진 자기 상관 곡선을 적절한 수학적 모델(예: 확산 모델, 반응 모델 등)에 적용하여 분석함으로써, 분자의 확산 계수, 유체 역학적 반경, 화학 반응 속도 상수 등 다양한 정량적 정보를 얻을 수 있다.

3. 1. 측정 장비 (Typical Setup)

일반적인 형광 상관 분광학(FCS) 장비는 레이저 빛을 다이크로익 거울을 통해 현미경 대물렌즈로 반사시켜 샘플에 초점을 맞추는 방식으로 구성된다. 사용되는 레이저 파장은 보통 405–633 nm 범위의 연속파(CW) 또는 690–1100 nm 범위의 펄스 레이저이다.

샘플에는 형광을 내는 입자(분자)가 포함되어 있으며, 이 입자들은 매우 낮은 농도로 희석되어 있어 레이저 빔의 초점 부피(약 1 fL) 내에는 일반적으로 1개에서 100개 정도의 소수 분자만 존재하게 된다. 이 형광 입자들이 초점 부피를 통과할 때 형광을 방출한다.

방출된 형광 빛은 여기광을 보낸 것과 동일한 대물렌즈에 의해 수집된다. 형광 빛은 원래의 레이저 빛(여기광)보다 파장이 길기 때문에(적색 이동), 다이크로익 거울을 통과하여 검출기에 도달한다. 검출기로는 주로 광전자 증배관, 애벌런치 포토다이오드, 또는 초전도 나노와이어 단일 광자 검출기 등이 사용된다.

검출기에서 생성된 전기 신호는 시간에 따른 형광 강도 변화(intensity vs. time trace) 형태로 직접 저장되거나, 특수한 데이터 획득 카드를 사용하여 실시간으로 자기상관 함수를 계산하는 데 사용될 수 있다. 이렇게 얻어진 FCS 곡선 자체는 시간에 따른 형광 신호의 변화 패턴만을 보여준다. 따라서 측정된 데이터로부터 물리적인 의미를 해석하기 위해서는 적절한 이론적 모델을 적용하여 분석해야 한다. 관심 있는 물리적 매개변수들(예: 확산 계수, 농도 등)은 측정된 자기상관 곡선을 이론적인 모델 함수에 맞추는(fitting) 과정을 통해 얻을 수 있다.^[17]

FCS 측정에는 주로 광학 현미경, 특히 공초점 현미경이나 2광자 현미경이 사용된다. 이 현미경들은 샘플의 매우 작은 특정 영역에만 빛을 조사하고 그 영역에서 나오는 형광 강도의 시간에 따른 변화, 즉 요동(fluctuation)을 정밀하게 측정할 수 있게 해준다. 측정된 형광 강도 신호의 파워 스펙트럼을 계산한 뒤, 이를 역 푸리에 변환하면 시간에 따른 자기상관 함수를 얻을 수 있다.

형광 강도의 요동은 주로 형광 분자의 확산 운동, 분자 간의 물리적 또는 화학적 반응, 분자들의 응집 현상 등에 의해 발생한다. 생물학 분야에서는 녹색 형광 단백질(GFP) 등으로 표지된 특정 단백질 분자들이 세포 내에서 어떻게 움직이고 서로 상호 작용하는지를 연구하는 데 FCS 기술이 널리 활용된다. 측정된 자기상관 곡선을 적절한 모델로 분석하면 분자의 확산 계수, 유체 역학적 반경(hydrodynamic radius), 화학 반응 속도 상수 등 다양한 정보를 얻을 수 있다.

3. 2. 측정 부피 (Measurement Volume)

측정 부피는 관련된 광학 요소에서 발생하는 조명(여기) 및 감지 기하학의 컨볼루션으로 정의된다. 결과 부피는 수학적으로 점 확산 함수(PSF)로 설명되는데, 이는 본질적으로 점 광원의 이미지를 나타낸다. PSF는 종종 초점 직경이 수백 나노미터이고 광축을 따라 길이가 거의 1 마이크로미터인 타원체(경계가 불분명함) 형태로 묘사된다. 이 모양은 사용되는 광학 요소의 품질에 크게 좌우되므로, 수차를 피하고 장비의 실제 PSF 모양을 확인하는 것이 중요하다. PSF의 형태는 결과적으로 얻어지는 FCS 곡선에 큰 영향을 미친다. 공초점 현미경의 경우, 작은 핀홀(약 1 에어리 단위)을 사용하면 PSF는 가우시안 함수로 잘 근사될 수 있다.

:

PSF(r,z)= I_0 e^{- 2 r^2/\omega_{xy}^2} e^{-2 z^2/\omega_{z}^2}

위 식에서

I_0

는 최대 강도, r과 z는 각각 방사형 및 축 방향 위치를 나타낸다.

\omega_{xy}

와

\omega_{z}

는 방사형 및 축 방향 반지름이며, 일반적으로

\omega_{z} > \omega_{xy}

관계를 가진다. 이 가우시안 형태는 자기상관 함수의 기능적 형태를 유도할 때 가정으로 사용된다.

일반적으로

\omega_{xy}

는 200–300 nm이며,

\omega_{z}

는 이보다 '''2–6'''배 더 크다.^[18] 측정 부피의 매개변수를 보정하는 일반적인 방법은 이미 확산 계수와 농도를 알고 있는 기준 물질에 대해 FCS 측정을 수행하는 것이다. 물에서 흔히 사용되는 형광체의 확산 계수 정보는 관련 자료에서 찾아볼 수 있다.

가우시안 근사는 실제 광학계의 세부 사항에 따라 정확도가 달라질 수 있으며, 근사로 인한 오차를 줄이기 위해 때때로 보정 계수를 적용하기도 한다.^[19]

형광 상관 분광학에서는 일반적으로 광학 현미경, 특히 공초점 현미경이나 2광자 현미경을 사용한다. 시료의 매우 작은 영역에 빛을 비추고, 그곳에서 발생하는 형광 강도의 요동을 측정한다. 측정된 강도 신호의 파워 스펙트럼을 계산하고 이를 역 푸리에 변환하면 시간 영역에서의 정보를 얻을 수 있으며, 이를 통해 시간적 자기상관 함수를 분석할 수 있다. 이러한 형광 강도의 요동은 측정 부피 내 형광 분자의 확산, 물리적 또는 화학적 반응, 응집 등 다양한 현상에 의해 발생한다. 생물학 분야에서는 녹색 형광 단백질(GFP) 등으로 표지된 단백질의 상호 작용을 연구하는 데 널리 활용된다. 분석된 자기상관 곡선을 적절한 이론 모델에 적용하여 분자의 확산 계수, 유체 역학적 반경, 화학 반응 속도 등 다양한 물리화학적 매개변수를 정량적으로 구할 수 있다.

3. 3. 자기 상관 함수 (Autocorrelation Function)

(시간적) 자기 상관 함수는 시간

\tau

만큼 이동된 시계열 신호의 자기 상관 정도를 나타내는 함수로, 시간 지연

\tau

에 따라 그 값이 변한다. 수학적으로는 다음과 같이 정의된다:

:

G(\tau)=\frac{\langle\delta I(t)\delta I(t+\tau)\rangle}{\langle I(t) \rangle^2}=\frac{\langle I(t)I(t+\tau) \rangle}{\langle I(t)\rangle^2}-1

여기서

\delta I(t)=I(t)-\langle I(t)\rangle

는 특정 시간

t

에서의 형광 강도

I(t)

가 평균 형광 강도

\langle I(t)\rangle

로부터 얼마나 벗어나는지를 나타내는 편차이다. 위 식처럼 평균 강도의 제곱

\langle I(t)\rangle^2

으로 나누어 정규화하는 방식은 형광 상관 분광학(FCS)에서 가장 널리 쓰인다. 이렇게 정규화하면 시간 지연이 0일 때의 상관 값, 즉 ''G''(0)이 측정 부피 안에 존재하는 형광 입자의 평균 개수

\langle N \rangle

와 역수 관계 (

G(0) = 1/\langle N \rangle

)를 가지기 때문이다.

예를 들어, 용액 속에서 자유롭게 확산하는 형광 물질인 로다민 6G에 대한 원시 FCS 데이터와 이를 이용해 계산한 자기 상관 결과가 오른쪽 그림에 제시되어 있다. 위쪽 그래프는 시간에 따른 형광 강도의 변화를 보여준다. 로다민 6G 분자가 레이저 초점 영역을 드나들면서 형광 강도가 불규칙하게 변동하는 것을 관찰할 수 있다. 아래쪽 그래프는 이 강도 데이터로부터 계산된 자기 상관 함수

G(\tau)

를 보여준다. 이 상관 곡선의 형태를 분석하면 로다민 6G 분자의 확산 속도나 농도와 같은 유용한 정보를 얻을 수 있다.

만약 측정에 사용된 레이저 빛의 공간적 분포, 즉 점 확산 함수(PSF)가 가우시안 함수 형태

PSF(r, z)

라고 가정하면, 자기 상관 함수는 다음과 같은 일반적인 공식으로 표현될 수 있다.^[20]

:

G(\tau) = \frac{1}{\langle N \rangle} \left\langle \exp\left(-\frac{\Delta X(\tau)^2 + \Delta Y(\tau)^2}{w_{xy}^2} - \frac{\Delta Z(\tau)^2}{w_z^2} \right)  \right\rangle ,

여기서 벡터

\Delta \vec R(\tau) = (\Delta X(\tau), \Delta Y(\tau), \Delta Z(\tau))

는 시간

\tau

동안 형광 입자가 겪는 확률적인 공간 이동 변위를 나타낸다.

w_{xy}

와

w_z

는 각각 가우시안 형태 레이저 초점의 수평(xy 평면) 방향 및 수직(z축) 방향 크기를 나타내는 파라미터이다. 괄호

\langle \dots \rangle

는 모든 가능한 입자 이동 경로에 대한 평균을 의미한다.

이 표현식은 초점 부피 내 형광 입자의 평균 개수

\langle N \rangle

가 충분히 적고, 형광 입자가 일시적으로 빛을 내지 않는 암흑 상태(dark state)로 변하는 현상 등을 무시할 수 있을 때 유효하다. 중요한 점은 이 공식이 입자의 구체적인 운동 방식(예: 단순 확산, 능동 수송 등)에 대한 특별한 가정을 포함하지 않는 일반적인 형태라는 것이다. 이 공식을 통해 자기 상관 함수

G(\tau)

는 (i) 빔 크기

w_{xy}, w_z

가 작을 때 입자가 시간

\tau

후에도 여전히 초점 부피 내에 머무를 확률(재귀 확률)과 관련되거나, (ii) 빔 크기

w_{xy}, w_z

를 변화시킬 때 입자의 평균 제곱 변위

|\Delta \vec R(\tau)|^2

의 모멘트 생성 함수로 해석될 수 있다.

일반적으로 형광 상관 분광학 실험에는 광학 현미경, 특히 공초점 현미경이나 2광자 현미경이 사용된다. 이 현미경들은 시료의 매우 작은 부피(펨토리터 수준)에 레이저 빛을 집중시켜 조사하고, 그 영역에서 방출되는 형광 강도의 시간에 따른 요동(fluctuation)을 정밀하게 측정한다. 측정된 강도 신호의 파워 스펙트럼을 역 푸리에 변환하면 시간에 따른 상관관계를 나타내는 시간 스펙트럼, 즉 자기 상관 함수

G(\tau)

를 얻을 수 있다. 이러한 형광 강도의 요동은 주로 관찰 부피 내외로 형광 입자가 확산을 통해 이동하거나, 입자들 사이에서 일어나는 물리적 또는 화학적 반응(결합, 분해 등), 혹은 응집 현상 등에 의해 발생한다.

특히 생물학 분야에서는 녹색 형광 단백질(GFP)이나 다른 형광 표지를 이용하여 특정 단백질 분자의 세포 내 움직임, 다른 분자와의 상호 작용, 농도 변화 등을 연구하는 데 형광 상관 분광학이 매우 유용하게 활용된다. 실험적으로 얻어진 자기 상관 곡선을 적절한 물리적 모델(예: 확산 모델, 반응-확산 모델 등)에 적용하여 분석함으로써, 관심 있는 분자의 확산 계수, 유체역학적 반경, 화학 반응 속도 상수, 농도 등 다양한 정량적 정보를 얻을 수 있다.

3. 4. 자기 상관 함수 해석 (Interpreting the Autocorrelation Function)

자기 상관 함수 데이터를 분석하여 관심 있는 정보를 추출하기 위해서는 일반적으로 레벤베르크-마쿼트 알고리즘과 같은 비선형 최소 자승법을 사용하여 데이터를 특정 모델 함수에 맞추는 과정(피팅, fitting)을 거친다. 어떤 모델 함수를 사용할지는 분석하려는 분자의 움직임(동역학) 유형과 실험에 사용된 광학 현미경(주로 공초점 현미경이나 2광자 현미경)의 광학적 구성에 따라 달라진다.

형광 상관 분광학(FCS) 실험에서는 먼저 샘플의 아주 작은 영역에 레이저 빛을 비추어 형광 분자를 들뜨게 하고, 이때 방출되는 형광의 세기가 시간에 따라 미세하게 변하는 요동(fluctuation)을 측정한다. 이 형광 세기 변화, 즉 강도 스펙트럼(파워 스펙트럼)을 수학적으로 역 푸리에 변환하면 시간에 따른 변화 정보(시간 스펙트럼)를 얻을 수 있으며, 이를 통해 시간적 자기 상관 함수를 계산하고 분석하게 된다.

형광 세기의 요동은 주로 형광 분자가 측정 영역 안팎으로 이동하는 확산 과정 때문에 발생하지만, 분자 간의 물리적 또는 화학적 반응이나 분자들이 뭉치는 응집 현상 등에 의해서도 나타날 수 있다. 따라서 자기 상관 함수를 분석하면 이러한 현상들에 대한 정보를 얻을 수 있다. 예를 들어, 생물학 연구에서는 녹색 형광 단백질(GFP) 등으로 표지된 특정 단백질 분자의 움직임이나 다른 분자와의 상호 작용을 관찰하는 데 FCS 기법이 널리 활용된다.

실험으로 얻은 자기 상관 함수 데이터를 적절한 수학적 모델(예: 정상 확산 모델, 이상 확산 모델, 화학 반응 모델 등)에 피팅함으로써, 분자의 확산 계수, 대략적인 크기를 나타내는 유체 역학적 반경, 화학 반응 속도 상수 등 다양한 물리·화학적 파라미터를 정량적으로 알아낼 수 있다.

3. 4. 1. 정상 확산 (Normal Diffusion)

FCS에서 사용되는 형광 입자는 크기가 작기 때문에 용액 내에서 열 운동을 한다. 가장 간단한 FCS 실험 상황은 이러한 입자들이 정상적인 3차원 확산을 하는 경우이다. 이 경우, 자기 상관 함수 G(τ)는 다음과 같이 표현된다.

G(\tau)=G(0)\frac{1}{(1+(\tau/\tau_D ))(1+a^{-2}(\tau/\tau_D ))^{1/2}} +G(\infty)

$\tau$ : 상관 시간
$\tau_D$ : 입자가 측정 부피를 통과하는 데 걸리는 평균 시간 (특성 체류 시간)
$a = \omega_z / \omega_{xy}$ : 측정 부피의 축 방향 반경( $\omega_z$ )과 반경 방향 반경( $\omega_{xy}$ )의 비율 ( $e^{-2}$ 강도 기준)
$G(0)$ : 상관 시간 $\tau=0$ 에서의 상관 함수 값
$G(\infty)$ : 상관 시간이 무한대로 갈 때의 상관 함수 값 (배경 값)

이 수식은 측정 부피가 가우시안 형태라고 가정하여 유도되었다. 실험적으로 얻은 상관 데이터를 이 모델 함수에 맞추는 과정(피팅, fitting)을 통해 일반적으로 세 가지 매개변수 값, 즉 G(0),

G(\infty)

, 그리고

\tau_D

를 결정할 수 있다. 이 값들을 이용하면 확산 계수와 형광 물질의 농도를 계산할 수 있다.

상관 함수의 초기 값인 ''G''(0)은 측정 부피 내에 존재하는 분자(확산체)의 평균 개수 의 역수와 같다. 만약 측정 부피의 크기(

V_\text{eff}

)를 알고 있다면, 평균 농도 도 계산할 수 있다.

G(0)=\frac{1}{\langle N\rangle}=\frac{1}{V_\text{eff}\langle C\rangle}

여기서 유효 부피

V_\text{eff}

는 측정 부피의 가우시안 형태를 고려하여 계산하며, 다음 식으로 주어진다.

V_\text{eff}=\pi^{3/2}\omega_{xy}^2\omega_z

특성 체류 시간

\tau_D

는 입자의 확산 계수 D와 관련이 있으며, 다음 식을 통해 확산 계수를 구할 수 있다.

D=\frac{\omega_{xy}^2}{4\tau_D}

3. 4. 2. 이상 확산 (Anomalous Diffusion)

확산하는 입자가 장애물에 부딪히거나 분자 모터, 흐름 같은 힘에 의해 밀려날 때, 그 움직임은 평균 제곱 변위(MSD)가 시간에 따라 일정하게 증가하는 일반적인 확산 모델로는 설명하기 어려운 경우가 많다. 이런 경우 확산은 이상 확산으로 더 잘 설명될 수 있는데, 이상 확산에서는 MSD가 시간에 따라 다음과 같은 멱함수(power law) 형태로 비선형적으로 변한다:

:

\ MSD= 6 D_a t^\alpha \,

여기서

D_a

는 이상 확산 계수이다. 일반적으로 '이상 확산'이라고 하면 이 멱함수 모델을 가리키는 경우가 많으며, 다른 여러 가지 비정상적인 확산 현상 전체를 의미하지는 않는다. 또한, 이 멱함수 형태는 엄밀히 말해 장애물의 분포가 프랙탈 구조를 이루는 경우처럼 매우 제한적인 시스템에서만 정확히 나타난다. 하지만 실제로는 더 넓은 범위의 시스템에서도 이 멱함수 형태가 유용한 근사 모델로 사용될 수 있다.

이상 확산 현상을 형광 상관 분광학(FCS)로 분석할 때 사용하는 자기상관 함수는 다음과 같다:

:

G(\tau)=G(0)\frac{1}{(1+(\tau/\tau_D)^\alpha)(1+a^{-2}(\tau/\tau_D)^\alpha)^{1/2}} +G(\infty),

여기서 이상 지수

\alpha

는 앞서 설명한 MSD 식의 지수와 같으며, 실험 데이터를 분석(피팅)할 때 결정되는 값이다.

FCS 실험을 통해 얻은 이상 지수

\alpha

는 분자가 얼마나 혼잡한 환경에 있는지를 나타내는 지표가 된다. 일반적으로

\alpha

값은 1보다 작으며, 주변 환경이 더 혼잡할수록

\alpha

값은 더 작아지는 경향을 보인다.^[21]

3. 4. 3. 다분산 확산 (Polydisperse Diffusion)

서로 다른 크기(확산 계수)를 가진 확산 입자가 있는 경우, 단일 성분 형태의 합으로 구성된 함수를 사용하는 것이 일반적이다.

:

G(\tau)=G(0)\sum_i \frac{\alpha_i}{(1+(\tau/\tau_{D,i}))(1+a^{-2}(\tau/\tau_{D,i}))^{1/2}} +G(\infty)

여기서 합은 i로 색인된 입자의 서로 다른 크기의 수에 대한 것이며,

\alpha_i

는 각 유형의 양자 수율 및 농도와 관련된 가중치를 제공한다. 이 방식은 새로운 매개변수를 도입하여 더 높은 차원의 공간을 검색해야 하므로 피팅을 더 어렵게 만든다. 비선형 최소 자승 피팅은 일반적으로

\tau_{D,i}

가 조금만 있어도 불안정해진다. 다분산 샘플에 특히 유용한 보다 강력한 피팅 방식은 최대 엔트로피 방법이다.^[22]

3. 4. 4. 흐름을 동반한 확산 (Diffusion with Flow)

균일한 흐름 속도

v

와 함께 측면 방향으로의 확산이 있는 경우, 자기 상관 함수는 다음과 같이 표현된다.^[23]

:

G(\tau)=G(0)\frac{1}{(1+(\tau/\tau_{D}))(1+a^{-2}(\tau/\tau_{D}))^{1/2}} \times \exp[-(\tau/\tau_v)^2 \times \frac{1}{1+\tau/\tau_D}] +G(\infty)

여기서

\tau_v=\omega_{xy}/v

는 흐름만 존재하고 확산이 없을 때의 평균 체류 시간이다.

3. 4. 5. 화학 반응 (Chemical Relaxation)

다양한 형광 상관 분광학(FCS) 실험에서는 열운동으로 인해 평형 상태에서 끊임없이 변동하며 원래 상태로 돌아가려는("이완") 화학 반응을 관찰하는 경우가 많다. 이러한 변동은 확산과 달리 서로 다른 에너지 상태 사이의 변화를 일으킨다. 이를 화학적 이완(Chemical Relaxation^eng)이라고 한다.

화학적 이완을 보여주는 간단한 예시는 측정 부피 안에 고정된 결합 부위가 있는 시스템이다. 이 시스템에서는 입자가 결합할 때만 신호가 발생한다(예: FRET 현상을 이용하거나, 확산 시간이 샘플링 간격보다 훨씬 빠른 경우). 이 경우 자기상관 함수는 다음과 같이 표현된다.

G(\tau)=G(0) \exp(-\tau/\tau_B) +G(\infty)

여기서

\tau_B

는 이완 시간으로, 다음과 같이 정의된다.

\tau_B=(k_\text{on}+k_\text{off} )^{-1}

이 값은 반응 속도론(결합 속도

k_\text{on}

과 해리 속도

k_\text{off}

)에 따라 결정된다. 또한,

G(0)

는 다음과 같이 평형 상수 ''K''와 관련이 있다.

G(0) = \frac{1}{\langle N\rangle} \frac{k_{on}}{k_{off}} = \frac{1}{\langle N\rangle} K

(

\langle N\rangle

은 평균 입자 수)

많은 경우 화학적 이완이 있는 시스템은 측정 가능한 확산도 보인다. 이 경우 자기상관 함수는 시스템의 구체적인 특성에 따라 달라진다. 만약 확산과 화학 반응이 독립적으로 일어난다면, 전체 자기상관 함수는 화학적 요인과 확산 요인에 의한 자기상관 함수의 곱으로 나타낼 수 있다.

일반적으로 화학 반응을 포함한 FCS 측정에는 광학 현미경(특히 공초점 현미경 또는 2광자 현미경)을 사용한다. 샘플의 미세한 영역에 빛을 비추고, 형광 강도의 요동(fluctuation)을 측정한다. 측정된 강도 스펙트럼(파워 스펙트럼)을 역 푸리에 변환하면 시간 스펙트럼을 얻을 수 있으며, 이를 통해 시간적 자기상관을 분석한다. 이러한 요동은 분자의 확산, 물리·화학적 반응, 응집 등에 의한 형광 강도 또는 분자 수의 변화를 반영한다. 생물학 분야에서는 녹색 형광 단백질(GFP) 등으로 표지된 단백질의 상호 작용을 연구하는 데 FCS가 활용된다. 분석 결과를 적절한 모델에 적용하면 확산 계수, 유체 회전 반경, 화학 반응 속도 등을 계산할 수 있다.

4. 일반적인 형광 탐침 (Common Fluorescent Probes)

형광 상관 분광학(FCS)에 사용되는 형광 종은 일반적으로 형광단으로 표지된 관심 생체 분자(예: 면역조직화학 사용)이거나 관심 환경(예: 세포의 세포 골격)을 탐구하는 데 사용되는 베어 형광단이다.^[8] 다음 표는 실온에서 물 속의 일부 일반적인 형광단의 확산 계수와 여기 파장을 나타낸다.

형광 염료	D [10⁻¹⁰ m² s⁻¹]	T [°C]	여기 파장 [nm]	참고
로다민 6G	2.8, 3.0, 4.14 ± 0.05, 4.20 ± 0.06	25	514	^[8]^[25]^[26]^[27]
로다민 110	2.7		488	^[28]
테트라메틸 로다민	2.6		543
Cy3	2.8		543
Cy5	2.5, 3.7 ± 0.15	25	633	^[29]^[30]
카르복시플루오레세인	3.2		488
알렉사 488	1.96, 4.35	22.5±0.5	488	^[28]^[31]
아토 655-말레이미드	4.07 ± 0.1	25	663	^[26]
아토 655-카르복실산	4.26 ± 0.08	25	663	^[26]
2′, 7′-디플루오로플루오레세인 (오리건 그린 488)	4.11 ± 0.06	25	498	^[26]

5. 다양한 FCS 기술 (Variations)

형광 상관 분광학(FCS)은 일반적으로 단일 지점, 단일 채널에서 시간적 자기상관 측정을 의미하는 경우가 많다. 하지만 '형광 상관 분광학'이라는 용어 자체는 이러한 특정 방식에 국한되지 않는다. FCS는 여러 연구자들에 의해 다양한 목적과 방식으로 변형되어 발전해 왔으며, 각각의 확장된 기법들은 고유한 이름(주로 약어 형태)을 가지고 있다.

5. 1. Spot Variation FCS (svFCS)

형광 상관 분광법(FCS)이 주어진 관찰 부피에서 확산 시간을 제공하는 단일 지점 측정 방식인 반면, Spot Variation FCS(svFCS)는 관찰 지점을 바꿔가며 여러 다른 크기의 지점에서 확산 시간을 측정하는 기법이다.

이 방법에서는 확산 시간과 측정 지점의 면적 사이에 선형적인 관계가 나타나는데, 이를 그래프로 그려 '확산 법칙(diffusion law)' 곡선을 얻을 수 있다. 이 곡선을 분석하면 분자가 어떻게 구속되어 움직이는지에 대한 주요 정보를 파악할 수 있다.

svFCS는 특히 생물학 분야에서 살아있는 세포의 세포막 구조와 조직을 연구하는 데 유용하게 사용된다.

확산 법칙은 다음 수식으로 표현될 수 있다.

:

\ \omega_{xy}^2=4D\tau_D+t_{0}

여기서

t_{0}

는 그래프의 y축 절편을 의미한다. 만약 분자가 단순한 브라운 운동을 한다면

t_{0}=0

이다. 특정 영역에 갇혀 움직이는 경우(격리된 도메인으로 인한 구속)에는

t_{0}>0

값을 가지며, 반대로 특정 영역을 통과하며 움직이는 경우에는

t_{0}<0

값을 가진다.

살아있는 세포를 대상으로 한 svFCS 연구 및 관련 시뮬레이션 논문들이 다수 발표되었다.^[32]^[33]^[34]^[35]^[36]

svFCS와 관련된 다른 기술들은 다음과 같다.

샘플링 부피 제어 형광 상관 분광법(SVC-FCS)^[37]
z-스캔 FCS^[38]
나노 크기의 구멍(Nano-apertures)을 이용한 FCS: 회절 한계를 넘어서는 기술^[39]
STED-FCS^[40]

5. 2. 형광 교차 상관 분광법 (Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy, FCCS)

형광 상관 분광학(FCS)는 때때로 확산 시간의 차이를 이용하여 분자 상호 작용을 연구하는 데 사용된다. 예를 들어, 결합 반응의 생성물은 개별 반응물보다 크기가 커서 확산 시간이 더 길어지는 원리를 이용한다. 그러나 FCS는 분자 질량 변화에 비교적 둔감하다는 한계가 있다. 구형 입자(예: 단백질)의 확산 시간(

\ \tau_D

)과 분자 질량(

\ M

)의 관계는 다음 식으로 나타낼 수 있다.

:

\ \tau_D=\frac{3\pi\omega_{xy}^2\eta}{2kT}(M)^{1/3}

여기서

\ \eta

는 샘플의 점도이다. 실제로 의미 있는 차이를 구별하려면 확산 시간이 1.6배 이상 차이 나야 하는데, 이는 분자 질량이 4배 이상 달라져야 함을 의미한다.^[41]

FCS의 이러한 한계를 보완하기 위해 형광 교차 상관 분광법(Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy, FCCS)이 개발되었다. FCCS는 두 개 이상의 형광 채널(각 반응물에 대해 하나씩 할당)에서 나오는 신호를 교차 상관시켜 분자 간의 상호 작용을 측정한다. 이 방법은 특히 반응 전후의 질량 변화가 작을 때, FCS보다 더 민감하게 상호 작용을 구별할 수 있다는 장점이 있다.^[41]

FCCS 실험에는 일반적으로 광학 현미경, 특히 공초점 현미경이나 2광자 현미경이 사용된다. 샘플의 미세한 영역에 빛을 비추고, 그 영역을 통과하는 형광 분자에 의해 발생하는 형광 강도의 요동을 측정한다. 측정된 강도 신호의 파워 스펙트럼을 역 푸리에 변환하면 시간 스펙트럼을 얻을 수 있으며, 이를 통해 시간적 자기 상관 함수를 분석할 수 있다. 형광 강도의 요동은 분자의 확산, 물리·화학적 반응, 응집 등 다양한 요인에 의해 발생한다. 생물학 분야에서는 녹색 형광 단백질(GFP) 등으로 표지된 단백질들의 상호 작용 연구에 FCCS가 활발히 응용되고 있다. 분석된 결과를 적절한 모델에 적용하면 확산 계수, 유체 역학적 반경, 화학 반응 속도 등의 정량적인 정보를 얻을 수 있다.

5. 3. 밝기 분석 방법 (Brightness Analysis Methods)

밝기 분석 방법에는 수 및 밝기(Number and Brightness, N&B),^[42] 광자 계수 히스토그램(Photon Counting Histogram, PCH),^[43] 형광 강도 분포 분석(Fluorescence Intensity Distribution Analysis, FIDA),^[44] 큐뮬런트 분석(Cumulant analysis),^[45] 공간 강도 분포 분석(Spatial Intensity Distribution Analysis, SpIDA)^[46] 등이 있다. 여러 방법을 조합하여 사용하는 연구도 보고되고 있다.^[47]

형광 상호 상관 분광법(FCCS)은 여러 색깔의 형광 표지를 동시에 관찰하여 분자량에 따른 확산 속도 차이가 크지 않은 문제를 해결할 수 있지만, 같은 종류의 분자끼리 상호작용하는 동종 상호 작용을 분석하는 데는 한계가 있다. 동종 상호 작용 분석의 경우, 밝기 분석이 해답을 제공한다. 이 방법은 형광 신호의 강도 분포가 일정하지 않다는 점을 이용하여 샘플 안에 있는 서로 다른 분자들의 밝기를 측정한다. 예를 들어, 두 개의 분자가 결합한 이합체(Dimer)는 단일 분자인 단량체(Monomer)보다 형광 표지를 두 배 더 많이 가지므로, 분자 밝기도 단량체의 약 두 배가 된다. 따라서 상대적인 밝기 차이를 통해 분자들이 얼마나 서로 결합하여 올리고머(Oligomer)를 형성하는지 민감하게 측정할 수 있다.

평균 분자 밝기(

\langle \epsilon\rangle

)는 형광 강도의 분산(

\sigma^2

)과 평균 강도(

\langle I\rangle

)를 이용하여 다음과 같이 계산할 수 있다:^[48]

:

\ \langle \varepsilon\rangle =\frac{\sigma^2 - \langle I\rangle}{\langle I\rangle} = \sum_i f_i \varepsilon_i

여기서

f_i

는 특정 종류(

i

)의 분자가 내는 총 형광 강도에서 차지하는 비율이고,

\epsilon_i

는 그 분자 종류(

i

)의 고유한 분자 밝기이다.

밝기 분석 방법은 형광 표지가 없는 반응물과 형광 표지가 있는 반응물이 결합하는 생체분자 상호작용 연구에 활용될 수 있다.^[49] 복합체가 형성되면 입체 장애(Steric hindrance), 전하 이동(Charge transfer), 광 이성화 속도 변화 또는 이러한 현상들의 조합으로 인해 분자 밝기가 변하게 되며, 이를 통해 반응물과 생성물을 구별할 수 있다.

5. 4. FRET-FCS

형광 공명 에너지 전달(FRET)을 형광 대신 사용하는 또 다른 FCS 기반 분자 상호 작용 연구 방법으로 FRET-FCS가 있다.^[50] FRET-FCS는 FCCS와 마찬가지로 두 종류의 프로브를 사용하지만, 채널은 하나만 사용하며 두 프로브가 상호 작용을 보장할 만큼 매우 가까이 있을 때만 빛이 감지된다는 특징이 있다. FRET 신호는 일반적인 형광 신호보다 약하지만, 반응이 일어나는 동안에만 신호가 발생한다는 장점이 있다 (자가 형광은 예외).

5. 5. 주사 FCS (Scanning FCS, sFCS)

주사 형광 상관 분광법(sFCS)은 측정 부피가 정의된 방식으로 시료를 가로질러 이동하는 기법이다.^[51] 이 방식은 표준 형광 상관 분광법(FCS)에서 종종 발생하는 몇 가지 뚜렷한 문제를 완화하거나 제거하고, 따라서 생물학적 시스템에서 형광 상관 방법의 적용 범위를 확장할 수 있다는 동기에서 도입되었다.^[51]

FCS의 일부 변형은 직렬 주사 레이저 현미경에만 적용될 수 있다. 이미지 상관 분광법(ICS)과 그 변형들은 모두 주사 공초점 현미경 또는 주사 2광자 현미경에서 구현되었지만, 회전 디스크 공초점 현미경과 같은 다른 현미경으로도 이전되었다. 래스터 ICS(RICS)^[52] 및 위치 감지 FCS(PSFCS)^[53]는 이미지 주사 지점 간의 시간 지연을 분석에 통합한다. 또한, 주사 시스템에서만 가능한 저차원 주사(예: 원형 링)^[54]는 단일 지점 측정과 전체 이미지 측정 사이의 시간 척도에 접근할 수 있게 한다. 주사 경로는 입자를 적응적으로 따라가도록 만들어지기도 했다.^[55]

5. 6. 회전 디스크 FCS (Spinning Disk FCS)

회전 디스크 공초점 현미경에서도 영상 상관 분광법을 수행할 수 있으며, 이는 레이저 주사 공초점 현미경에 비해 더 빠른 이미징 속도를 얻을 수 있다는 장점이 있다. 이러한 접근 방식은 최근 공간적으로 변화하는 복잡한 환경에서의 확산 연구에 적용되어, 확산 계수의 픽셀 해상도 지도를 생성하는 데 사용되었다.^[56] 형광 상관 분광학(FCS)을 이용한 확산의 공간 매핑은 이후 전반사 형광 현미경(TIRF) 시스템으로 확장되었다.^[57] 상관 기술을 사용하여 동역학을 공간적으로 매핑하는 것은 이전에도 적용되었지만, 드문 지점에서만 이루어지거나^[58] 해상도가 낮다는 한계가 있었다.^[61]

5. 7. 이미지 상관 분광법 (Image Correlation Spectroscopy, ICS)

생물학에서 막 내 확산과 같이 움직임이 느린 경우, 단일 지점 형광 상관 분광학(FCS) 실험만으로는 적절한 통계를 얻는 데 오랜 시간이 걸릴 수 있다. 이때 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하여 여러 공간 지점에서 동시에 실험을 진행하면 더 많은 데이터를 효율적으로 얻을 수 있는데, 이러한 접근 방식을 이미지 상관 분광법(Image Correlation Spectroscopy, ICS)이라고 한다.^[59] 이렇게 얻은 측정값들은 함께 평균 내어 분석할 수 있다.

ICS의 한 변형으로, 이미지에 대한 공간적 자기 상관 분석을 수행하는 방법이 있다. 이는 입자의 농도에 대한 정보를 제공하며^[60], 상관 관계는 시간에 따라 평균화된다. 카메라에서 발생하는 백색 잡음(white noise)은 시간적으로는 자기 상관성을 보이지 않지만 공간적으로는 자기 상관성을 가지므로, 공간 자기 상관 함수에서 백색 잡음 진폭이 나타난다. 따라서 형광 분자의 농도를 정확히 구하기 위해 자기 상관 진폭을 분석할 때 이 점을 고려해야 한다.

시간적 상관과 공간적 상관을 모두 활용하는 자연스러운 확장 기법으로 시공간 이미지 상관 분광법(Spatio-Temporal Image Correlation Spectroscopy, STICS)이 있다.^[61] STICS에서는 공간이나 시간에 대한 명시적인 평균화 과정 없이(상관 관계 계산에 내재된 평균화만 존재) 분석을 수행한다. 특히 방향성 흐름이나 비대칭적 확산과 같이 비등방성 운동이 있는 시스템에서 STICS는 운동 방향에 대한 정보를 추출할 수 있다. STICS와 푸리에 변환을 통해 밀접하게 관련된 변형으로는 ''k''-공간 이미지 상관 분광법(k-space Image Correlation Spectroscopy, kICS)이 있다.^[62]

ICS에는 상호 상관(cross-correlation)을 이용하는 버전도 존재한다. 이는 서로 다른 형광 표지를 가진 분자들이 공통된 위치에 존재할 때, 이들의 농도, 분포 및 동역학적 특성을 밝히는 데 사용된다.^[59] 여기서 '공통 위치'란, 각 형광 분자가 방출하는 빛이 점 확산 함수(point spread function)의 중첩으로 인해 개별적으로 구별하기 어려운 경우를 의미한다.

5. 8. 입자 이미지 상관 분광법 (Particle Image Correlation Spectroscopy, PICS)

입자 이미지 상관 분광법(Particle Image Correlation Spectroscopy^eng, PICS)은 나노미터(nm) 길이와 밀리초(ms) 시간 단위에서 상관 관계를 분석하는 강력한 도구이다.^[63] 이 방법은 시공간 이미지 상관 분광법의 원리를 적용하며,^[61] 단일 입자 추적 기술의 높은 위치 정확도를 활용한다.

기존의 입자 추적 방법은 여러 입자의 경로가 서로 겹칠 경우 제대로 작동하기 어렵다는 단점이 있다. 하지만 PICS는 개별 분자를 식별할 수만 있다면, 분자 밀도가 매우 높거나 다양한 동적 특성(확산 계수, 속도 등)을 가진 경우에도 원칙적으로 작동한다. 또한, 계산 비용이 상대적으로 저렴하고 분석 결과가 안정적이라는 장점이 있다. 연구자는 입자의 움직임(예: 확산, 능동 수송, 제한된 확산)에 대한 사전 정보 없이도 PICS를 통해 이러한 운동 방식을 식별하고 정량적으로 분석할 수 있다.

PICS의 확장된 형태로 입자 이미지 상호 상관 분광법(Particle Image Cross-Correlation Spectroscopy^eng, PICCS)이 있다.^[64] PICCS는 2색 현미경을 사용하여 여러 종류의 분자가 상호작용하는 생물학적 과정을 관찰하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

5. 9. FCS 초고해상도 광학적 변동 이미징 (FCS Super-resolution Optical Fluctuation Imaging, fcsSOFI)

초고해상도 광학적 변동 이미징 (SOFI)은 FCS와 유사하게 상관 관계 방정식을 이용한 후처리 분석을 통해 회절 한계 이하의 공간 해상도를 얻는 초고해상도 기술이다. SOFI가 처음 보고되었을 때는 형광체의 정지된 깜빡임에서 비롯된 변동을 사용했지만, 이후 FCS와 결합되었다. FCS는 확산하는 프로브에서 생성된 변동을 사용하므로, SOFI와 결합하여 확산 계수의 초고해상도 공간 지도를 생성할 수 있다.^[65] 이 결합 기술은 다공성이거나 제한된 재료의 확산 및 공간적 특성을 이해하는 데 적용되었다. 예를 들어 아가로스^[65] 및 온도 반응성 PNIPAM 하이드로겔,^[66] 액정,^[65] 그리고 상 분리된 중합체 및 RNA/단백질 응축물 연구에 활용되었다.^[67]

5. 10. 전반사 FCS (Total Internal Reflection FCS, TIR-FCS)

전반사 형광(TIRF)은 덮개 유리 표면 근처의 얇은 층에만 민감하게 반응하는 현미경 기술이다. 이 방식은 배경 형광을 크게 줄일 수 있다는 장점이 있다. 형광 상관 분광학(FCS)은 이러한 전반사 형광 현미경 기술과 결합하여 사용될 수 있으며, 이를 전반사 FCS(TIR-FCS)라고 부른다. TIRF 방식에서는 형광의 세기가 덮개 유리로부터의 거리가 멀어짐에 따라 지수적으로 감소한다. 이는 공초점 현미경에서 관찰되는 가우시안 형태의 감소와는 다르기 때문에, TIR-FCS의 자기상관 함수는 일반적인 공초점 현미경 기반 FCS와 다른 형태를 가진다.^[68]

5. 11. 광시트 형광 현미경을 이용한 FCS 이미징 (FCS Imaging Using Light Sheet Fluorescence Microscopy)

광시트 형광 현미경 또는 선택적 평면 이미징 현미경(SPIM)은 얇은 시트 형태의 레이저 빛을 사용하여 관찰 방향에 수직으로 시료를 조명하는 방식이다. 특정 조건 하에서 이 조명 원리를 형광 상관 분광법과 결합하면, 살아있는 생물학적 시료 내부에 있는 녹색 형광 단백질(GFP)로 표지된 단백질과 같은 형광 입자의 이동성이나 상호작용을 공간적으로 분해하여 이미징하는 것이 가능하다.^[69]

6. 다른 형광 동역학 접근법 (Other Fluorescent Dynamical Approaches)

형광 상관 분광학(FCS) 외에도 형광 물질의 동역학을 연구하는 데 널리 사용되는 주요 비상관 분석 기법이 있다. 대표적으로 형광 회복 후 광퇴색(FRAP)과 입자 추적 기법이 있으며, 이들은 FCS와 다른 방식으로 형광 신호를 분석하여 분자의 움직임이나 상호작용에 대한 정보를 제공한다.

6. 1. 광퇴색 후 형광 회복 (Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP)

FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)는 특정 영역에 강한 빛을 짧게 쬐어 형광 물질을 돌이킬 수 없이 광퇴색시킨 후, 주변의 광퇴색되지 않은 형광 물질이 확산해 들어오면서 형광이 회복되는 과정을 관찰하는 기법이다.

FRAP는 세포 생물학 분야에서 널리 사용되며, 실험 결과를 직관적으로 해석하기 쉽다는 장점이 있다. 예를 들어, 세포 종류나 특정 영역 간의 차이, 약물 처리 전후의 변화 등을 간단한 영상 관찰만으로도 파악할 수 있다. 반면, FCS 실험은 결과 분석에 복잡한 처리가 필요하고, 회전 확산, 진동, 광퇴색, 조명 및 형광 색상 의존성, 통계 부족 등 실험 결과를 해석하기 어렵게 만드는 요인들에 더 민감하다. FRAP는 측정 영역의 크기를 조절하기가 FCS보다 훨씬 쉬워 실험 통제에 유리하며, 일반적으로 FCS보다 더 큰 영역을 측정한다. 이러한 특징 때문에 FRAP 실험은 주로 정성적인 분석에 활용되지만, 일부 연구에서는 FRAP 데이터를 정량적으로 분석하여 분자 결합 동역학 등을 연구하기도 한다.^[70]

FRAP의 주요 단점은 강한 빛을 이용한 광퇴색 과정에서 세포에 자유 라디칼이 생성되어 손상을 줄 수 있다는 점이다. 또한, 분자의 농도나 회전 확산, 여러 분자가 같은 위치에 있는지(공동 국소화) 등을 측정할 수 없어 FCS에 비해 활용 범위가 제한적이다. FRAP 실험을 위해서는 FCS보다 훨씬 높은 농도의 형광 물질이 필요하다는 점도 단점으로 꼽힌다.

FRAP 실험에는 주로 광학 현미경, 특히 공초점 현미경이나 2광자 현미경이 사용된다. 샘플의 미세한 영역에 빛을 비추고, 시간에 따른 형광 강도의 변화(요동)를 측정한다. 이 형광 강도 변화 데이터(신호)의 파워 스펙트럼을 역 푸리에 변환하면 시간 변화에 따른 신호의 유사성(자기상관)을 분석할 수 있다. 형광 강도의 요동은 분자의 확산, 물리적 또는 화학적 반응, 응집 등 다양한 요인에 의해 발생한다. 생물학 연구에서는 녹색 형광 단백질(GFP) 등으로 표지된 단백질의 움직임이나 상호 작용을 연구하는 데 FRAP 기법이 활용된다. 측정된 데이터를 적절한 수학적 모델에 적용하면 분자의 확산 계수, 유체 역학적 반경, 화학 반응 속도 등 정량적인 정보를 얻을 수 있다.

6. 2. 입자 추적 (Particle Tracking)

입자 추적에서는 일련의 입자들의 궤적을 동영상에 입자 추적 알고리즘을 적용하여 측정한다. 입자 추적은 상관 관계가 역학을 단일 부드러운 곡선으로 평균화하는 형광 상관 분광학(FCS)과 달리 모든 동적 정보가 측정에 유지된다는 장점이 있다. 이러한 장점은 복잡한 확산을 보이는 시스템에서 명확하게 나타나며, 여기서 평균 제곱 변위를 직접 계산하면 정상 또는 멱법칙 확산과의 직접적인 비교가 가능하다. 입자 추적을 적용하려면 입자들이 구별되어야 하므로 FCS에 필요한 농도보다 낮아야 한다. 또한 입자 추적은 잡음에 더 민감하며, 이는 때때로 결과를 예측할 수 없게 만들 수 있다.

일반적으로 광학 현미경, 특히 공초점 현미경 또는 2광자 현미경을 사용한다. 샘플의 미소 범위에 빛을 조사하고, 형광 강도의 요동을 측정한다. 측정된 강도 스펙트럼(파워 스펙트럼)을 역 푸리에 변환하면 시간 스펙트럼을 얻을 수 있으며, 이를 통해 시간적 자기상관을 분석할 수 있다. 요동은 분자의 확산, 물리·화학적 반응, 응집 등에 의한 강도 또는 양에 따라 발생한다. 생물학에서는 녹색 형광 단백질(GFP)로 표지(labeling)된 단백질의 상호 작용 연구에 사용된다. 얻어진 결과를 적절한 모델에 적용함으로써, 확산 계수, 유체 회전 반경, 화학 반응 속도 등을 구할 수 있다.

7. 자동 형광 상관 분광법 (Auto-fluorescence Correlation Spectroscopy)

최근 자외선 나노 광학 기술의 발전으로 딥 자외선 빛으로 단백질을 여기시키고 동적 과정을 연구하여 라벨이 없는 단분자 연구가 가능해졌다.^[71]^[72]^[73]

8. 2광자 및 3광자 FCS 여기 (Two- and Three-photon FCS Excitation)

2광자 또는 3광자 여기 FCS는 유기 및/또는 생물학적 시료의 공간 해상도를 높이고 광손상이나 광표백을 최소화하는 데 여러 가지 장점을 가진다.^[74]^[75]^[76]^[77]^[78]

참조

_[1] 논문 In vivo applications of fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Tools for Biologists, Vol 2: In Vivo Techniques, 89, 3-+. 2008
_[2] 간행물 Nanoscale Viscosity of Cytoplasm Is Conserved in Human Cell Lines 2020
_[3] 간행물 Determination of oligomerization state of Drp1 protein in living cells at nanomolar concentrations
_[4] 간행물 Determination of oligomerization state of Drp1 protein in living cells at nanomolar concentrations
_[5] 간행물 Thermodynamic fluctuations in a reacting system: Measurement by fluorescence correlation spectroscopy
_[6] 간행물 Rotational brownian motion and fluorescence intensity fluctuations
_[7] 간행물 Fluorescence correlation spectroscopy I. Conceptual basis and theory, (1974)
_[8] 간행물 Fluorescence correlation spectroscopy II. An experimental realization
_[9] 간행물 Analysis of confocal laser-microscope optics for 3-D fluorescence correlation spectroscopy
_[10] 간행물 High-order fluorescence fluctuation analysis of model protein clusters
_[11] 간행물 Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments
_[12] 간행물 Topics in Fluorescence Spectroscopy Techniques vol 1, ed J R Lakowicz (New York: Plenum) pp 337–78 1991
_[13] 간행물 Fluorescence correlation spectroscopy with high count rate and low background: analysis of translational diffusion. 1993
_[14] 간행물 Sorting single molecules: application to diagnostics and evolutionary biotechnology
_[15] 간행물 Fluorescence correlations, single molecule detection and large number screening. Applications in biotechnology
_[16] 간행물 Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications
_[17] 간행물 Fluorescence correlation spectroscopy for the detection and study of single molecules in biology
_[18] 간행물 A new approach for fluorescence correlation spectroscopy (FCS) based immunoassays
_[19] 간행물 Focal volume optics and experimental artifacts in confocal fluorescence correlation spectroscopy
_[20] 간행물 Anomalous transport resolved in space and time by fluorescence correlation spectroscopy 2011
_[21] 간행물 Anomalous diffusion of proteins due to molecular crowding
_[22] 간행물 Measuring Size Distribution in Highly Heterogeneous Systems with Fluorescence Correlation Spectroscopy
_[23] 간행물 Active protein transport through plastid tubules: velocity quantified by fluorescence correlation spectroscopy
_[24] 간행물 Fluorescence correlation spectroscopy of triplet states in solution: a theoretical and experimental study
_[25] 간행물 Detection of specific DNA sequences using dual-color two-photon fluorescence correlation spectroscopy.
_[26] 간행물 Precise measurement of diffusion by multi-color dual-focus fluorescence correlation spectroscopy
_[27] 간행물 Conformation transition of Poly(N-isopropylacrylamide) Single Chains in Its Cononsolvency Process: A Study by Fluorescence Correlation Spectroscopy and Scaling Analysis. (2012) https://figshare.com[...]
_[28] 간행물 Fluorescence correlation spectroscopy studies of diffusion of a weak polyelectrolyte in aqueous solutions
_[29] 간행물 Characterization of photoinduced isomerization and back-isomerization of the cyanine dye Cy5 by fluorescence correlation spectroscopy. (2000)
_[30] 간행물 Comparison of optical saturation effects in conventional and dual-focus fluorescence correlation spectroscopy (2008)
_[31] 간행물 Precise Measurement of Diffusion Coefficients using Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy
_[32] 간행물 2005
_[33] 간행물 2006
_[34] 간행물 2011
_[35] 간행물 2011
_[36] 논문 Methods In Enzymology
_[37] 논문 Biophys J.
_[38] 논문 Biophys J.
_[39] 논문 Biophys J.
_[40] 논문 Nature
_[41] 논문 Resolution of fluorescence correlation measurements. (1999)
_[42] 논문 Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope
_[43] 논문 The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy
_[44] 논문 Fluorescence-intensity distribution analysis and its application in biomolecular detection technology
_[45] 논문 Cumulant analysis in fluorescence fluctuation spectroscopy
_[46] 논문 Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis 2011-04-26
_[47] 논문 Determination of G-protein–coupled receptor oligomerization by molecular brightness analyses in single cells http://edoc.mdc-berl[...] 2021
_[48] 논문 On the analysis of high order moments of fluorescence fluctuations
_[49] 논문 Ion Complexation Explains Orders of Magnitude Changes in the Equilibrium Constant of Biochemical Reactions in Buffers Crowded by Nonionic Compounds https://pubs.acs.org[...]
_[50] 논문 FRET-FCS as a tool to evaluate the stability of oligonucleotide drugs after intracellular delivery
_[51] 논문 Characterization of Protein Dynamics in Asymmetric Cell Division by Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy
_[52] 논문 Fluctuation Correlation Spectroscopy with a Laser-Scanning Microscope: Exploiting the Hidden Time Structure
_[53] 논문 Position-Sensitive Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy
_[54] 논문 Spatial-temporal studies of membrane dynamics: scanning fluorescence correlation spectroscopy (SFCS)
_[55] 논문 Tracking-FCS: Fluorescence correlation spectroscopy of individual particles https://authors.libr[...]
_[56] 논문 Spatially resolved fluorescence correlation spectroscopy using a spinning disk confocal microscope
_[57] 논문 Spatially resolved total internal reflection fluorescence correlation microscopy using an electron multiplying charge-coupled device camera https://figshare.com[...]
_[58] 논문 Anomalous diffusion of fluorescent probes inside living cell nuclei investigated by spatially resolved fluorescence correlation spectroscopy
_[59] 논문 Two-photon video rate image correlation spectroscopy (ICS) and image cross-correlation spectroscopy (ICCS)
_[60] 논문 Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application
_[61] 논문 Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS): theory, verification and application to protein velocity mapping in living CHO cells
_[62] 논문 k-Space Image Correlation Spectroscopy: A Method for Accurate Transport Measurements Independent of Fluorophore Photophysics
_[63] 논문 Particle Image Correlation Spectroscopy (PICS): Retrieving Nanometer-Scale Correlations from High-Density Single-Molecule Position Data
_[64] 논문 Quantification of Biological Interactions with Particle Image Cross-Correlation Spectroscopy (PICCS)
_[65] 논문 Characterization of Porous Materials by Fluorescence Correlation Spectroscopy Super-resolution Optical Fluctuation Imaging http://www.escholars[...]
_[66] 논문 Imaging Switchable Protein Interactions with an Active Porous Polymer Support
_[67] 논문 Probing Inhomogeneous Diffusion in the Microenvironments of Phase-Separated Polymers under Confinement
_[68] 논문 Total Internal Reflection with Fluorescence Correlation Spectroscopy: Nonfluorescent Competitors
_[69] 논문 Quantitative fluorescence imaging of protein diffusion and interaction in living cells. 2011-09-01
_[70] 논문 FRAP analysis of binding: proper and fitting
_[71] 논문 Deep Ultraviolet Plasmonic Enhancement of Single Protein Autofluorescence in Zero-Mode Waveguides 2019-10-09
_[72] 논문 Ultraviolet optical horn antennas for label-free detection of single proteins 2022-04-05
_[73] 논문 Ultraviolet Nanophotonics Enables Autofluorescence Correlation Spectroscopy on Label-Free Proteins with a Single Tryptophan 2023-01-05
_[74] 논문 Multi-photon Excitation Microscopy to Study Biosystems
_[75] 논문 Two-photon fluorescence microscopy of coexisting lipid domains in giant unilamellar vesicles of binary phospholipid mixtures
_[76] 논문 Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one- and two- photon excitation
_[77] 간행물 Near Infrared Microspectroscopy, Fluorescence Microspectroscopy, Infrared Chemical Imaging and High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Analysis of Soybean Seeds, Somatic Embryos and Single Cells. AOCS Press 2004
_[78] 문서 Single Cancer Cell Detection by Near Infrared Microspectroscopy, Infrared Chemical Imaging and Fluorescence Microspectroscopy https://arxiv.org/ab[...] 2004

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