4Pi 현미경
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1. 개요
4Pi 현미경은 두 개의 대물렌즈를 사용하여 샘플을 조명하고 형광을 수집하여 기존 광학 현미경보다 높은 해상도를 제공하는 형광 현미경의 한 종류이다. 1991년 슈테판 헬에 의해 실용적인 시스템이 처음 고안되었으며, 1990년대 후반부터 응용 분야가 증가했다. 4Pi 현미경은 100nm 이하의 분해능을 얻을 수 있지만, 시료를 기계적으로 주사해야 하고 얇게 슬라이스해야 하는 단점이 있다. 4Pi 현미경은 A, B, C 세 가지 작동 모드를 가지며, 초고해상도 기술과의 결합을 통해 성능을 향상시킬 수 있다.
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4Pi 현미경 | |
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4Pi 현미경 | |
![]() | |
유형 | 광학 현미경 |
개발자 | 슈테판 헬 |
개발 시기 | 1990년대 초반 |
상세 정보 | |
해상도 향상 | 축 방향 |
기술 | 형광 현미경 공초점 현미경 |
관련 기술 | STED 현미경 PALM 현미경 (f)PALM 현미경 ORM 현미경 STORM 현미경 |
2. 역사
1971년, 크리스토프 크레머와 토마스 크레머는 모든 방향에서 점 광원 방출에 대한 전체 필드 정보를 전달하는, 이른바 4π 홀로그램 생성을 제안했다.[2][3] 그러나 1978년의 출판물[4]에서는 부적절한 물리적 결론을 도출했고, 입체각의 다른 면을 추가함으로써 얻을 수 있는 실제 이점인 축 해상도 증가를 완전히 놓쳤다.[5]
이후 4Pi 현미경 개발은 슈테판 헬에 의해 계속되었으며, 그는 1991년에 4Pi 현미경의 실행 가능한 시스템을 최초로 발명하였다.
2. 1. 슈테판 헬의 발명과 초기 발전
1991년, 슈테판 헬은 두 개의 대물렌즈를 사용하는 4Pi 현미경의 실용적인 시스템을 최초로 고안하였다.[6] 1994년에 그는 자신이 고안한 4Pi 현미경을 실험적으로 시연하여 그 성능을 입증하였다.[7]2. 2. 상용화와 기술 발전
2002년, 4Pi 현미경은 효모 세포의 미토콘드리아 역학을 기록하는 데 성공하는 등 생명과학 분야에서 활용되기 시작했다.[8] 2004년, 라이카 마이크로시스템즈(Leica Microsystems)는 상용 4Pi 현미경(Leica TCS 4Pi)을 출시했으나,[9] 이후 단종되었다.[9] 이후 자극 방출 고갈 현미경(STED)과 같은 초고해상도 기술과의 결합을 통해 4Pi 현미경의 성능은 더욱 향상되었다.[10] 적절한 여기 및 탈여기 빔을 갖춘 4Pi 현미경은 균일하게 50 nm 크기의 점을 생성할 수 있었는데, 이는 고정 세포에서 공초점 현미경에 비해 초점 부피가 150~200배 감소한 것에 해당한다. 4Pi 현미경을 RESOLFT 현미경과 전환 가능한 단백질과 함께 사용하면 40 nm 미만의 등방성 해상도로 저조도에서 살아있는 세포의 이미지를 촬영할 수 있다.[11]3. 작동 원리
4Pi 현미경은 동일한 위치에 초점을 맞춘 두 개의 대물렌즈를 사용하여 샘플을 조명하고, 방출되는 형광을 수집하여 해상도를 향상시킨다. 이때, 두 대물렌즈를 통과하는 광학 경로 길이의 차이가 최소화되도록 정렬하여, 두 대물렌즈의 공통 초점 영역에 있는 분자가 양쪽에서 코히어런트하게 조명될 수 있도록 한다. 반사되거나 방출된 빛은 코히어런트하게 수집되며, 검출기에서 방출된 빛의 코히어런트 중첩이 일어난다. 조명 및 감지에 사용되는 입체각 는 최대값에 근접하게 증가하며, 샘플은 모든 방향에서 동시에 조명되고 감지된다.
4Pi 현미경은 1992년 슈테판 헬이 개발했으며, 대향하는 대물렌즈로부터 레이저를 조사하여 시료의 형광 염료를 여기시키고 방출된 빛을 간섭시켜 고분해능 영상을 얻는다.[15] 시료 스테이지의 XY 주사(走査)가 필요하여 촬영에 다소 시간이 걸리지만, 인공물을 제거할 수 있다는 장점이 있다.[15] 2004년 라이카 마이크로시스템즈에서 Leica TCS 4Pi를 출시했다.[16]
3. 1. 코히어런트 조명 및 검출
두 대물렌즈를 통과하는 광학 경로 길이를 정밀하게 조정하여, 두 렌즈의 공통 초점 영역에 있는 분자가 양쪽에서 코히어런트하게(coherent) 조명되도록 한다. 반사되거나 방출된 빛은 두 대물렌즈를 통해 코히어런트하게 수집되어 검출기에서 간섭을 일으킨다. 이를 통해 조명 및 검출에 사용되는 입체각 ()을 최대화하여 해상도를 향상시킨다.[15]
4Pi 현미경은 빔 분할기로 레이저 빛을 분할하고 거울을 통해 두 개의 대물렌즈로 보낸다. 공통 초점에서 두 초점 광선이 중첩되고, 이 위치에서 여기된 분자는 형광을 방출한다. 이 빛은 두 대물렌즈로 수집되어 빔 분할기로 결합된 후 이색성 거울을 통해 검출기로 향한다. 여기서 두 방출 광 경로가 다시 중첩될 수 있다.
이상적인 경우 각 대물렌즈는 의 입체각에서 빛을 수집할 수 있다. 두 대물렌즈를 모두 사용하면 모든 방향()에서 빛을 수집할 수 있으며, 이는 4Pi 현미경이라는 이름의 유래이다. 그러나 실제로는 대물렌즈의 조리개 각도가 약 140° ()로 제한된다.
3. 2. 4Pi 현미경의 작동 모드
4Pi 현미경은 세 가지 다른 방식으로 작동할 수 있다.- '''A형 4Pi 현미경''': 여기광의 코히어런트 중첩을 사용하여 해상도를 높인다. 방출된 빛은 한쪽에서만 감지되거나 양쪽에서 비코히어런트 중첩으로 감지된다.
- '''B형 4Pi 현미경''': 방출된 빛만 간섭한다.
- '''C형 4Pi 현미경''': 여기광과 방출광 모두 간섭을 허용하여 가능한 가장 높은 해상도 증가(공초점 현미경에 비해 광축을 따라 ~7배)를 얻는다.[15]
실제 4Pi 현미경에서는 모든 방향에서 동일하게 빛을 적용하거나 수집할 수 없으므로 점 확산 함수에 소위 측면 로브가 발생한다. 일반적으로 (그러나 항상 그런 것은 아님) 2광자 여기 현미경은 허용 가능한 수준으로 이러한 측면 로브를 낮추기 위해 방출 핀홀과 함께 4Pi 현미경에서 사용된다.
3. 3. 점 확산 함수와 측면 로브
실제 4Pi 현미경에서는 모든 방향에서 빛을 균일하게 적용하거나 수집할 수 없기 때문에 점 확산 함수(PSF)에 측면 로브(sidelobe)가 발생한다. 2광자 여기 현미경과 방출 핀홀을 함께 사용하여 이러한 측면 로브를 줄일 수 있다.[15]4. 특징
4Pi 현미경은 마주보는 대물렌즈를 사용하여 레이저를 시료에 조사하고, 형광 염료를 들뜨게 하여 방출된 빛을 간섭시켜 고분해능 영상을 얻는 현미경이다. 기존 광학 현미경으로는 불가능했던 100nm 이하의 분해능을 얻을 수 있지만, 시료를 얇게 슬라이스해야 하고 촬영 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다.
4. 1. 장점
슈테판 헬이 개발한 4Pi 현미경은 마주보는 대물렌즈로부터 레이저를 조사하여 시료의 형광 염료를 들뜨게 하고 방출된 빛을 간섭시켜 고분해능 영상을 얻는다.[15] 4Pi 현미경은 기존 광학 현미경으로는 불가능했던 회절 한계 이하인 100nm 이하의 분해능을 얻을 수 있다는 장점이 있다. 또한, 시료 스테이지의 XY 주사(走査)가 필요하므로 촬영에 다소 시간이 걸리지만, 인공물을 제거할 수 있다.[15]4. 2. 단점
5. 응용
4Pi 현미경은 초기에는 효모 세포의 미토콘드리아 역학 연구 등에 활용되었다.[15] 최근에는 STED, RESOLFT 등 다른 초고해상도 현미경 기술과 결합하여 살아있는 세포 내 구조를 40nm 미만의 등방성 해상도로 관찰하는 데 사용되고 있다.
참조
[1]
간행물
4Pi-Confocal Microscopy is Coming of Age
http://www3.mpibpc.m[...]
2004
[2]
문서
Cremer C., Cremer T. (1971) Punkthologramme: Physikalische Grundlagen und mögliche Anwendungen. Enclosure to Patent application DE 2116521 „Verfahren zur Darstellung bzw. Modifikation von Objekt-Details, deren Abmessungen außerhalb der sichtbaren Wellenlängen liegen" (Procedure for the imaging and modification of object details with dimensions beyond the visible wavelengths). Filed April 5, 1971; publication date October 12, 1972. Deutsches Patentamt, Berlin. http://depatisnet.dpma.de/DepatisNet/depatisnet?action=pdf&docid=DE000002116521A
[3]
웹사이트
Considerations on a laser-scanning-microscope with high resolution and depth of field: C. Cremer and T. Cremer in MICROSCOPICA ACTA VOL. 81 NUMBER 1 September, p. 31–44 (1978).
http://www.kip.uni-h[...]
2016-03-04
[4]
문서
C. Cremer and T. Cremer (1978): Considerations on a laser-scanning-microscope with high resolution and depth of field Microscopica Acta VOL. 81 NUMBER 1 September, pp. 31—44 (1978)
[5]
웹사이트
The Nobel Prize in Chemistry 2014
https://www.nobelpri[...]
[6]
웹사이트
European patent
http://v3.espacenet.[...]
[7]
간행물
Confocal microscopy with an increased detection aperture: type-B 4Pi confocal microscopy
http://www.opticsinf[...]
1994
[8]
간행물
Fast 100-nm resolution three-dimensional microscope reveals structural plasticity of mitochondria in live yeast
http://www.pnas.org/[...]
2002
[9]
웹사이트
Review article
http://www.kompetenz[...]
[10]
간행물
Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells
2008
[11]
간행물
4Pi-RESOLFT nanoscopy
[12]
간행물
新しい顕微鏡の技術(III.観察技法の基礎と新たな展開)
https://hama-med.rep[...]
日本組織細胞化学会
2003-07
[13]
간행물
Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index
https://doi.org/10.1[...]
Wiley
1993-03
[14]
웹사이트
Beyond the diffraction limit : far-field fluorescence imaging with ultrahigh resolution
https://pdfs.semanti[...]
[15]
웹사이트
Comparison of I5M and 4Pi‐microscopy.
https://onlinelibrar[...]
2006
[16]
웹사이트
ライカマイクロシステムズ 超解像顕微鏡
https://www.leica-mi[...]
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