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로우리 단백질 정량법

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목차

1. 개요

로우리 단백질 정량법은 단백질 용액의 농도를 측정하는 방법으로, 구리 이온의 펩타이드 결합 반응과 방향족 아미노산 잔기의 산화를 결합한다. 이 방법은 1951년에 처음 제안되었으며, 뷰렛 반응과 Folin-Ciocalteu 시약을 사용한다. 반응 결과 생성되는 heteropolymolybdenum Blue의 흡광도를 측정하여 단백질의 농도를 추정한다. 로우리법은 바이신코닌산 분석법, 하트리-로우리 분석법과 같은 변형된 방법으로도 사용되며, 발표된 논문은 학문적으로 매우 큰 영향을 미쳤다.

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로우리 단백질 정량법

2. 메커니즘

로우리 단백질 정량법은 두 가지 주요 화학 반응을 순차적으로 이용하는 원리에 기반한다. 첫 번째 단계는 알칼리성 조건에서 단백질을 구성하는 펩타이드 결합과 구리 이온(Cu2+)이 반응하는 뷰렛 반응이다. 이 과정에서 구리 이온은 Cu+ 형태로 환원된다.

두 번째 단계에서는 첫 단계에서 생성된 Cu+ 이온과 단백질 내 특정 아미노산 잔기, 주로 방향족 아미노산인 트립토판과 티로신이 Folin-Ciocalteu 시약(인텅스텐산과 인몰리브덴산의 혼합물)과 반응한다. 이 반응은 폴린-시오칼토 반응(Folin-Ciocalteu 반응)으로 알려져 있으며, Folin-Ciocalteu 시약이 환원되는 과정이다. 실험적으로 시스테인 잔기 또한 이 반응에 기여하는 것으로 밝혀졌다.[5] 반응의 정확한 메커니즘은 아직 완전히 밝혀지지 않았다.

이 일련의 반응 결과, '헤테로폴리몰리브데넘 블루'(heteropolymolybdenum Blue)라고 불리는 강렬한 파란색 화합물이 생성된다.[6] 생성된 파란색의 농도는 시료에 포함된 단백질의 양에 비례하며, 이 색의 강도를 특정 파장(일반적으로 660 nm)에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 정량한다.[7]

이 정량법은 1951년 올리버 H. 로우리(Oliver H. Lowry)가 처음 개발하여 발표했으며, 이후 이 원리를 바탕으로 바이신코닌산 분석법(BCA assay)이나 Hartree-Lowry 분석법 등 여러 수정된 단백질 정량법이 개발되었다.

2. 1. 뷰렛 반응

Lowry 단백질 정량법은 구리 이온이 펩타이드 결합과 알칼리성 조건에서 반응하는 것 (뷰렛 반응)과 방향족 단백질 잔기의 산화를 결합한 방법이다. Lowry 방법은 펩타이드 결합의 산화로 생성된 Cu+가 Folin-Ciocalteu 시약(인텅스텐산과 인몰리브덴산의 혼합물로 Folin-Ciocalteu 반응에서 사용됨)과 반응하는 것을 기반으로 한다. 반응 메커니즘은 정확히 밝혀지지 않았지만, Folin-Ciocalteu 시약의 환원과 방향족 잔기 (주로 트립토판, 티로신)의 산화가 관여하는 것으로 알려져 있다.

Folin 시약은 산성 조건에서만 활성을 띠지만, 환원 반응은 염기성 pH 10에서 일어나므로 주의가 필요하다. 시약이 분해되기 전에 환원이 일어나도록 단백질 용액과 Folin 시약을 동시에 혼합해야 한다.[4]

실험 결과 시스테인 잔기도 시약에 반응하여 Lowry 분석에서 관찰되는 흡광도에 기여할 수 있는 것으로 나타났다.[5] 이 반응의 결과로 heteropolymolybdenum Blue라는 강렬한 파란색 분자가 생성된다.[6] 이 환원된 Folin 시약(heteropolymolybdenum Blue)의 농도는 660 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량한다.[7] 결과적으로, Folin-Ciocalteu 시약을 환원시키는 트립토판 및 티로신 잔기의 농도를 통해 시료 내 단백질의 총 농도를 추론할 수 있다.

2. 2. 폴린-시오칼토 반응

로우리 단백질 정량법은 구리 이온(Cu2+)이 펩타이드 결합과 알칼리성 조건에서 반응하는 뷰렛 반응과, 이후 생성된 Cu+ 이온 및 방향족 아미노산 잔기가 Folin-Ciocalteu 시약과 반응하는 것을 결합한 방법이다. 폴린-시오칼토 반응은 바로 이 두 번째 단계에 해당한다.

이 반응은 뷰렛 반응에서 펩타이드 결합의 산화로 생성된 Cu+ 이온과, 단백질 내 방향족 아미노산 잔기(주로 트립토판과 티로신)가 Folin-Ciocalteu 시약(인텅스텐산과 인몰리브덴산의 혼합물)을 환원시키는 과정이다. 반응의 정확한 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았지만, Folin-Ciocalteu 시약의 환원과 방향족 아미노산 잔기의 산화가 핵심이다.

Folin 시약을 사용할 때는 주의가 필요하다. 이 시약은 산성 조건에서 안정하지만, 단백질과의 환원 반응은 염기성 조건(pH 10)에서만 효과적으로 일어난다. 따라서 시약이 염기성 조건에서 분해되기 전에 환원 반응이 완료되어야 하므로, 단백질 용액과 Folin 시약을 신속하게 혼합하는 것이 중요하다.[4]

실험 결과에 따르면 시스테인 잔기 또한 Folin-Ciocalteu 시약과 반응하여 색 변화에 기여할 수 있다.[5] 이 반응의 최종 결과물은 '헤테로폴리몰리브데넘 블루'(heteropolymolybdenum Blue)라고 불리는 강렬한 파란색 화합물이다.[6] 생성된 파란색 물질의 농도는 빛의 흡광도를 이용하여 측정하는데, 일반적으로 660 nm 파장의 빛을 사용한다.[7]

결론적으로, 트립토판, 티로신, 그리고 일부 시스테인 잔기에 의해 환원된 Folin-Ciocalteu 시약의 양(즉, 파란색의 강도)을 측정함으로써 시료 내 전체 단백질의 농도를 추정할 수 있다.

이 방법은 1951년 로우리(Lowry)에 의해 처음 제안되었으며, 이후 바이신코닌산 분석법이나 Hartree-Lowry 분석법과 같이 이 원리를 응용하거나 개선한 여러 단백질 정량법이 개발되었다.

2. 3. 반응 시 주의사항

Folin-Ciocalteu 시약을 다룰 때는 적절한 주의가 필요하다. 이 시약은 산성 조건에서만 활성을 띠지만, 환원 반응은 pH 10의 염기성 조건에서만 일어난다. 따라서 시약이 분해되기 전에 환원이 일어나야 하며, 이를 위해 단백질 용액과 Folin 시약을 동시에 혼합하는 것이 중요하다.[4]

또한 실험 결과에 따르면, 아미노산의 일종인 시스테인 역시 Folin 시약과 반응하는 것으로 나타났다. 따라서 단백질 내에 시스테인이 존재할 경우, 이것이 흡광도 측정 결과에 영향을 미칠 수 있다는 점을 고려해야 한다.[5]

3. 변형된 방법

(내용 없음)

3. 1. 하트리-로우리 분석법 (Hartree-Lowry assay)

로우리법을 발표한 논문[8]은 "세계에서 가장 많이 인용된 논문"으로 알려져 있으며, 30만 회 이상 인용되었다.[9] 또한, 인용 횟수 2위 논문 역시 단백질 연구와 관련된 울리히 렘리의 논문이며, 3위 논문도 유사한 주제인 단백질 정량 분석법 브래드포드법에 관한 것이다.[9]

4. 로우리법 논문의 학문적 의의

로우리법을 발표한 논문[8]은 '세계에서 가장 많이 인용된 논문'으로 알려져 있으며, 30만 회 이상 인용되었다.[9] 인용 횟수 2위 역시 단백질에 관한 울리히 렘리의 논문이며, 3위도 유사한 주제인 단백질 정량 분석법 브래드포드법에 관한 논문이다.[9]

참조

[1] 논문 The top 100 papers
[2] 논문 The Most Highly Cited Paper in Publishing History: Protein Determination by Oliver H. Lowry http://www.jbc.org/c[...]
[3] 논문 The Most-Cited Papers of All Time, ''SCI'' 1945-1988. Part 1A. The ''SCI'' Top 100—Will the Lowry Method Ever Be Obliterated? http://www.garfield.[...]
[4] 서적 Biotechnology: a laboratory course Academic Pr 1990
[5] 논문 Thorough Study of Reactivity of Various Compound Classes toward the Folin−Ciocalteu Reagent 2010-07-28
[6] 서적 Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology John Wiley & Sons, INC.
[7] 논문 Protein measurement with the Folin phenol reagent http://www.jbc.org/c[...]
[8] 논문 Protein measurement with the Folin phenol reagent https://pubmed.ncbi.[...] 1951-11
[9] 웹사이트 ノーベル賞受賞者の論文ですらランクインしない「世界で最も引用された論文トップ100」 https://gigazine.net[...] 2022-01-28


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