방사면역 측정법
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1. 개요
방사면역 측정법은 항원과 항체의 결합 반응을 이용하여 미량의 물질을 정량하는 면역 측정법이다. 1950년대에 솔로몬 버슨과 로절린 서스먼 얄로에 의해 개발되었으며, 얄로는 이 기술 개발로 1977년 노벨 생리학·의학상을 수상했다. 이 방법은 방사성 동위원소로 표지된 항원과 항체의 경쟁 반응을 이용하며, 샌드위치법 등 다양한 변형이 존재한다. 높은 특이성과 감도를 가지지만, 방사성 물질 사용에 따른 안전 관리의 어려움과 비용 문제로 인해 ELISA와 같은 대체 기술로 대체되었다.
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| 방사면역 측정법 | |
|---|---|
| 개요 | |
| 유형 | 면역 분석법 |
| 종류 | 생체외 진단 |
| 사용 물질 | 방사성 표지 분자 |
2. 역사
방사면역 측정법(RIA)은 뉴욕 브롱크스에 위치한 브롱크스 재향군인 병원에서 솔로몬 버슨과 로절린 서스먼 얄로에 의해 개발되었다.[4][5] 이들은 아서 밀스키의 인슐린 분해 효소 가설을 검증하기 위해 방사성 동위원소 131I로 표지된 인슐린을 이용한 실험을 진행하던 중, 인슐린 투여 경험이 있는 환자에게서 인슐린 항체가 생성된다는 사실을 발견하였다.[10][11][12] 이 발견을 바탕으로 극미량의 물질도 정량할 수 있는 방사면역 측정법이 개발되었으며, 이는 특히 내분비학 분야의 발전에 크게 기여했다.
이러한 공로를 인정받아 로절린 얄로는 1977년 노벨 생리학·의학상을 수상했다. 이는 여성으로서는 역대 두 번째 노벨 생리의학상 수상이었으며, "뇌의 펩타이드 호르몬 생산" 연구로 상을 받은 로저 기유맹 및 앤드루 셜리와 공동 수상한 것이다.[6] 얄로 박사는 수상 연설에서 여성의 사회적 기여와 잠재력의 중요성을 강조하기도 했다.[7]
2. 1. 개발 배경
1952년 피츠버그 대학교의 아서 밀스키는 제2형 당뇨병의 원인이 인슐린 분비 문제가 아니라, 인슐린이 분해 효소에 의해 비정상적으로 빠르게 분해되기 때문이라고 주장했다.[8][9] 이 가설을 검증하기 위해, 뉴욕 브롱크스에 있는 재향군인 병원의 솔로몬 버슨과 로절린 서스먼 얄로는 당뇨병 환자의 인슐린 대사를 연구하기 시작했다.[4][5]버슨과 얄로는 당뇨병 환자와 건강한 사람들을 대상으로 반감기가 8.04일인 방사성 동위원소 131I로 표지된 인슐린을 투여하는 실험을 진행했다.[10][11][12] 실험 결과, 과거에 인슐린 치료 경험이 있는 사람들은 당뇨병 발병 여부와 관계없이 인슐린 대사가 느리다는 사실이 밝혀졌다. 연구팀은 이것이 체내에 생성된 인슐린 항체가 131I 표지 인슐린과 결합했기 때문으로 추정했다.[10][11][12] 이러한 발견을 바탕으로 방사면역 측정법(RIA)이 개발되었다.
RIA는 극미량의 호르몬도 정량할 수 있게 하여, 특히 내분비학 분야에 획기적인 발전을 가져왔다. 이 공로로 얄로 박사는 1977년 노벨 생리학·의학상을 수상했다. 이는 "뇌의 펩타이드 호르몬 생산" 연구로 함께 수상한 로저 기유맹 및 앤드루 셜리와의 공동 수상이자, 역대 두 번째 여성 노벨 생리의학상 수상이었다.[6] 얄로 박사는 수상 연설에서 "우리가 겪고 있는 많은 문제들을 해결하려면, 세상은 인구의 절반의 재능을 잃는 것을 감당할 수 없다"고 말하며 여성의 역할과 기여의 중요성을 강조했다.[7]
2. 2. 노벨상 수상
이 방법은 뉴욕 브롱크스에 있는 브롱크스 재향군인 병원에서 솔로몬 버슨과 로절린 서스먼 얄로에 의해 개발되었다.[4][5] 아주 미량의 호르몬을 정량할 수 있게 된 이 방법은 특히 내분비학에 획기적인 발전을 가져왔으며, 얄로는 인슐린에 대한 방사면역 측정법(RIA) 개발 공로로 1977년 노벨 생리의학상을 수상했다. 이는 역대 두 번째 여성 노벨 생리의학상 수상이었다.[6] 얄로는 "뇌의 펩타이드 호르몬 생산" 연구로 함께 상을 받은 로저 기유맹 및 앤드루 셜리와 노벨상을 공동 수상했다.[6]얄로 박사는 수상 연설에서 "우리가 겪고 있는 많은 문제들을 해결하려면, 세상은 인구의 절반의 재능을 잃는 것을 감당할 수 없다"라고 말하며 여성의 기여를 강조했다.[7]
3. 원리
방사면역 측정법(Radioimmunoassay, RIA)은 특정 물질, 주로 항원의 농도를 측정하기 위해 개발된 매우 민감한 체외 검사 기법이다.[1][2] 이 방법의 핵심 원리는 항원-항체 반응의 특이성과 방사성 동위원소 표지를 이용하는 것이다.
기본적으로 측정하고자 하는 항원과 동일한 종류의 항원에 방사능 표지를 한다. 흔히 125I와 같은 감마선 방출 동위원소나 트리튬(3H) 같은 베타선 방출 동위원소가 사용된다.[1][2]
가장 일반적인 방식인 '''경쟁법'''에서는, 이렇게 방사성 표지된 항원과 샘플 속의 표지되지 않은 항원(측정 대상)이 제한된 양의 특정 항체에 결합하기 위해 서로 경쟁한다.[2] 샘플에 측정 대상 항원이 많을수록, 더 많은 비표지 항원이 항체에 결합하고 방사성 표지 항원의 결합은 줄어든다. 반응 후 항체에 결합한 항원과 결합하지 않고 유리된 항원을 분리하고, 결합한 또는 유리된 방사성 표지 항원의 방사능을 감마 계수기 등으로 측정한다. 이 측정값을 이미 알려진 농도의 표준 물질로 만든 표준 검량선(standard curve)과 비교하여 샘플 내 항원의 농도를 정확하게 계산할 수 있다.[2]
다른 방식으로는 항원을 두 종류의 항체 사이에 끼우는 형태의 '''샌드위치법'''도 사용된다. 이는 항원이 여러 항체 결합 부위(에피토프)를 가질 때 적용 가능하다.[3]
방사면역 측정법은 매우 민감하여 극미량(피코그램 수준)의 물질도 검출할 수 있으며,[1] 혈청 속 항원뿐만 아니라 다양한 생물학적 분자를 측정하는 데 널리 활용된다.[3]
3. 1. 경쟁법 (길항법)
방사면역 측정법(RIA)에서 가장 널리 사용되는 방식은 '''경쟁법''' 또는 '''길항법'''이다.[2] 이 방법의 기본적인 원리는 동위원소 희석법과 유사하다.측정을 시작하기 위해, 먼저 양을 알고 있는 항원에 방사능 표지를 한다. 주로 감마선을 방출하는 아이오딘 동위 원소, 예를 들어 125I나 베타선을 방출하는 트리튬(3H)을 항원의 티로신 잔기에 부착하는 방식이 사용된다.[1][2] 이렇게 방사성 표지된 항원("열" 항원)을 특정 항체(양이 알려져 있음)와 혼합하면 서로 특이적으로 결합한다.
다음 단계로, 측정하고자 하는 항원이 포함된 샘플(예: 환자의 혈청)을 첨가한다. 이 샘플 속에는 표지되지 않은 항원("냉" 항원)이 미지의 양만큼 들어있다. 샘플이 첨가되면, 표지되지 않은 항원은 기존에 항체에 결합해 있던 표지된 항원과 항체 결합 부위를 두고 경쟁하게 된다. 샘플 속 비표지 항원의 농도가 높을수록 더 많은 비표지 항원이 항체에 결합하고, 그 결과 기존에 결합해 있던 표지 항원은 항체로부터 떨어져 나오게(유리) 된다.[2] 즉, 비표지 항원의 양이 많아질수록 항체에 결합하는 표지 항원의 양은 줄어들고, 유리되는 표지 항원의 양은 늘어난다.
이 경쟁 반응이 평형에 도달한 후, 항체에 결합한 항원과 유리된 항원을 분리한다. 초기 분리 방법으로는 1차 항체에 결합하는 2차 항체를 사용하여 항원-항체 복합체를 침전시킨 후 원심 분리하는 방식이 사용되었다. 이후 활성탄이나 멤브레인 필터를 이용하여 항체를 흡착시켜 분리하는 방법도 개발되었다.[2]
분리 후에는 유리된 상태의 표지 항원(상층액에 존재) 또는 항체에 결합된 상태의 표지 항원의 방사능을 감마 계수기 등으로 측정한다. 이 측정값을 미리 작성된 표준 검량선(known standards curve)과 비교하여 샘플 속에 들어있던 비표지 항원의 정확한 농도를 계산할 수 있다.[2] 이 방법은 매우 민감하여, 친화도가 높은 항체를 사용하면 실험 튜브 내에서 피코그램(1조 분의 1 그램) 수준의 극미량 분석물도 검출할 수 있다.[1]
3. 2. 샌드위치법
'''샌드위치법'''은 방사면역 측정법의 한 종류이다. 이 방법은 측정하려는 항원이 두 개 이상의 항체 결합 부위(에피토프)를 가지고 있어 여러 항체와 동시에 결합할 수 있는 경우, 예를 들어 단백질과 같이 분자 크기가 충분히 큰 경우에 사용된다.[3]측정 과정은 다음과 같다.
# 먼저, 표지되지 않은 항체(1차 항체)를 반응 용기 벽이나 아가로스 비드와 같은 고체 표면에 고정시킨다.[3]
# 그 다음, 측정하고자 하는 항원이 포함된 샘플을 첨가하여 고정된 1차 항체와 결합시킨다.[3]
# 이어서 방사성 동위원소로 표지된 다른 항체(2차 항체)를 첨가한다. 이 2차 항체는 항원의 다른 부위에 결합하여 '1차 항체-항원-2차 항체' 형태의 샌드위치 구조를 형성한다.[3]
# 충분히 반응시킨 후, 결합하지 않은 물질들을 세척하여 제거한다. 고체 표면에 결합된 방사성 표지 2차 항체의 양, 즉 방사능을 측정한다. 이 측정값은 샘플 내 항원의 양에 정비례한다.[3]
# 표준 물질을 이용한 검량선과 비교하여 샘플 내 항원의 농도를 정량적으로 계산할 수 있다.[3]
이 방식은 방사성 물질 대신 효소를 사용하는 샌드위치 ELISA와 원리가 유사하다.[3]
3. 3. 분리 방법
방사면역 측정법에서는 항체에 결합한 항원과 결합하지 않은 유리 항원을 분리하여 방사능을 측정하는 과정이 필수적이다. 사용되는 주요 분리 방법은 다음과 같다.'''경합법'''에서는 방사성 표지 항원과 비표지 항원이 항체 결합 부위를 두고 경쟁한 후, 결합된 항원과 유리된 항원을 분리해야 한다.[2] 초기에는 2차 항체, 즉 분석에 사용된 1차 항체에 결합하는 또 다른 항체를 사용하여 항원-항체 복합체를 침전시킨 뒤 원심 분리하는 방법이 사용되었다. 이후 활성탄이나 멤브레인 필터를 이용하여 항체 또는 항원-항체 복합체를 흡착시켜 분리하는 방법도 개발되었다. 이렇게 분리된 후, 유리된 표지 항원의 양이나 결합된 표지 항원의 양을 측정하여 샘플 내 항원의 농도를 계산한다.
'''샌드위치법'''은 항원이 두 개 이상의 항체 결합 부위(에피토프)를 가질 때 사용된다.[3] 이 방법에서는 먼저 특정 항체를 용기 벽이나 비즈와 같은 고체 표면(고상)에 고정시킨다. 그 다음, 측정하고자 하는 항원이 포함된 샘플을 첨가하여 고정된 항체에 결합시킨다. 결합하지 않은 물질은 세척하여 제거한다. 이후 방사성 동위원소로 표지된 다른 항체를 첨가하여 항원에 결합시킨다. 다시 한번 세척 과정을 통해 결합하지 않은 표지 항체를 제거하고, 고상에 결합된 방사능의 양을 측정하여 항원의 양을 정량화한다.[3] 이 과정에서 고상화와 세척 단계가 중요한 분리 과정에 해당한다.
4. 특징
방사면역 측정법(RIA)은 분석 대상 물질에 대한 높은 특이성과 뛰어난 검출 감도를 지닌 분석 방법이다.[1]
4. 1. 한계
방사면역 측정법(RIA)은 높은 특이성과 검출 감도를 지녀 효과적인 분석 방법으로 평가받는다. 그러나 방사성 물질을 사용하므로 안전 관리에 세심한 주의가 필요하고, 고가의 특수 장비와 엄격한 관리 절차가 요구된다는 단점이 있다. 이러한 제약 때문에 이후 개발된 형광 항체법이나 ELISA 등 보다 안전하고 간편한 방법들이 널리 사용되면서 RIA의 활용은 점차 감소하였다.5. 사용되는 방사성 동위원소
방사면역 측정법(RIA)에서는 항원을 식별하기 위해 방사능 표지가 필요하며, 이를 위해 특정 방사성 동위원소가 사용된다. 가장 흔하게 사용되는 동위원소는 감마선을 방출하는 아이오딘 동위 원소, 특히 ¹²⁵I이며, 트리튬(³H)도 사용된다.[1] 항원의 티로신 잔기에 방사성 아이오딘을 부착하는 방식이 일반적이다.
초기에는 ¹³¹I이 사용되기도 했으나, 현재는 반감기가 더 긴 ¹²⁵I가 주로 활용된다. 각 동위원소의 특징은 다음과 같다.
| 동위원소 | 특징 | 비고 |
|---|---|---|
| ¹³¹I | 반감기 8.04일 | 초기에 사용되었으나 짧은 반감기로 인해 현재는 잘 사용되지 않음. |
| ¹²⁵I | 반감기 59.6일 | 반감기가 길어 시약의 유효 기간 확보에 유리하여 현재 널리 사용됨. |
5. 1. 아이오딘-131 (¹³¹I)
131I는 방사면역 측정법 초기에 사용되었으나, 반감기가 8.04일로 짧다는 단점 때문에 점차 사용 빈도가 줄어들었다.5. 2. 아이오딘-125 (¹²⁵I)
방사면역 측정법(RIA)에서 항원을 방사능으로 표지할 때 아이오딘 동위 원소가 흔히 사용된다. 예를 들어 항원의 티로신 잔기에 ¹²⁵I를 부착하는 방식이다.[1]초기에는 ¹³¹I이 사용되기도 했으나, 반감기가 8.04일로 짧다는 단점이 있어 현재는 잘 쓰이지 않는다.
대신 ¹²⁵I가 주로 사용되는데, ¹²⁵I는 반감기가 59.6일로 상대적으로 길다. 이는 방사성 표지된 화합물을 사용하는 실험에서 방사성 동위원소 시약의 유효 기간 문제를 완화해주는 장점이 있다.
6. 현대적 의의 및 대체 기술
방사면역 측정법(RIA)은 과거 높은 특이성과 검출 감도를 바탕으로 다양한 미량 물질 분석에 기여하며 중요한 진단 및 연구 도구로 활용되었다. 그러나 방사성 물질을 사용하는 데 따르는 안전 문제, 관리의 어려움, 그리고 비용적 부담 등의 한계점으로 인해 현재 그 사용 빈도는 점차 감소하는 추세이다. 이러한 단점들을 극복하기 위한 노력의 일환으로 방사성 동위원소를 사용하지 않는 새로운 방식의 면역측정법들이 개발되었으며, 이 기술들이 RIA를 상당 부분 대체하고 있다.
6. 1. 대체 기술
방사면역 측정법(RIA)은 높은 특이성과 검출 감도를 가진 훌륭한 방법이다. 그러나 방사성 물질을 사용하기 때문에 이를 다루는 데 세심한 주의가 필요하며, 비용이 많이 들고 관리가 엄격한 특수 설비도 요구된다는 단점이 있다. 이러한 이유로 방사면역 측정법은 이후에 개발된 형광 항체법이나 ELISA와 같은 다른 면역 측정법으로 상당 부분 대체되었다.참조
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Cytiva
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