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터치다운 중합효소 연쇄 반응

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1. 개요

터치다운 중합효소 연쇄 반응(Touchdown PCR)은 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 변형된 방법으로, 반응의 특이성과 효율성을 향상시킨다. 초기 단계에서 높은 어닐링 온도를 사용하여 프라이머의 비특이적 결합을 최소화하고, 매 사이클마다 어닐링 온도를 점차 낮추어 특정 DNA 서열의 증폭 효율을 높인다. 이 방법은 초기 단계에서 높은 특이성을 확보하고, 후반부의 효율성을 극대화하는 방식으로 작동한다.

터치다운 중합효소 연쇄 반응
일반 정보
명칭터치다운 중합효소 연쇄 반응
다른 이름터치다운 PCR, 터치다운 스타일 중합효소 연쇄 반응
영어 명칭touchdown polymerase chain reaction, touchdown PCR
상세 정보
유형중합효소 연쇄 반응의 유형
설명스퓨리어스 프라이밍을 피하기 위한 방법
고안자
개발자Don R, Cox P, Wainwright B, Baker K, Mattick J
발표 연도1991년
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목차

2. 방법

터치다운 중합효소 연쇄 반응의 개략도. 프라이머와 DNA 간의 첫 번째 어닐링은 초기 온도에서 발생하고, 두 번째 어닐링은 온도가 일정 값만큼 낮아진 후에 발생한다.
터치다운 중합효소 연쇄 반응의 개략도. 프라이머와 DNA 간의 첫 번째 어닐링은 초기 온도에서 발생하고, 두 번째 어닐링은 온도가 일정 값만큼 낮아진 후에 발생한다.

터치다운 중합효소 연쇄 반응 사이클의 초기 단계는 높은 어닐링 온도를 갖는다. 어닐링 온도는 매 사이클마다 증가분만큼 감소한다. 프라이머는 비특이적 결합을 가장 덜 허용하는 가장 높은 온도에서 어닐링된다. 따라서 처음 증폭되는 염기 서열은 프라이머 특이성이 가장 큰 영역 사이의 서열이다. 즉, 관심 있는 서열일 가능성이 가장 높다. 이러한 단편들은 이후 낮은 온도에서 추가 라운드를 거쳐 증폭되며, 이러한 낮은 온도에서 프라이머가 결합할 수 있는 비특이적 서열과 경쟁하게 된다. 프라이머가 처음에 (더 높은 온도 단계에서) 관심 서열에 결합하면, 중합효소 연쇄 반응의 후속 라운드를 생성물에 대해 수행하여 해당 단편을 추가로 증폭할 수 있다. 터치다운은 더 높은 온도에서 반응의 특이성을 높이고, 어닐링 온도를 낮춤으로써 종반부의 효율성을 높인다.

수학적 관점에서 볼 때, 낮은 온도에서 어닐링된 생성물은 i 사이클에서의 첫 번째 어닐링과 j 사이클에서의 두 번째 어닐링에 대해 2^{i-j} 만큼 불리하며, i,j\in \mathbb N , i\geq j 이다.

2.1. 1차 반복

1차 반복에서는 프라이머 결합 온도를 프라이머의 Tm보다 10도 정도 높게 시작하여 1도씩 내려가며 10-15회 반복한다.

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단계과정온도시간
1.변성95도3분
2.변성95도30초
3.프라이머 결합Tm + 10도 (매 반복마다 1도씩 낮춤)45초
4.신장72도60초

2-4 단계를 10-15회 반복한다.

터치다운 중합효소 연쇄 반응의 개략도. 프라이머와 DNA 간의 첫 번째 어닐링은 초기 온도에서 발생하고, 두 번째 어닐링은 온도가 일정 값만큼 낮아진 후에 발생한다.
터치다운 중합효소 연쇄 반응의 개략도. 프라이머와 DNA 간의 첫 번째 어닐링은 초기 온도에서 발생하고, 두 번째 어닐링은 온도가 일정 값만큼 낮아진 후에 발생한다.


터치다운 중합효소 연쇄 반응 사이클의 초기 단계는 높은 어닐링 온도를 갖는다. 어닐링 온도는 매 사이클마다 감소한다. 프라이머는 비특이적 결합을 가장 덜 허용하는 가장 높은 온도에서 결합한다. 따라서 처음 증폭되는 염기 서열은 프라이머 특이성이 가장 큰 영역 사이의 서열, 즉 관심 있는 서열일 가능성이 가장 높다.

2.2. 2차 반복

5-7 단계를 20-25회 반복한다. 터치다운 중합효소 연쇄 반응 사이클의 초기 단계는 높은 어닐링 온도를 가지며, 어닐링 온도는 매 사이클마다 일정량 감소한다. 프라이머는 비특이적 결합을 가장 덜 허용하는 가장 높은 온도에서 결합한다. 따라서 처음 증폭되는 염기 서열은 프라이머 특이성이 가장 큰 영역, 즉 관심 있는 서열일 가능성이 가장 높다. 이러한 단편들은 이후 낮은 온도에서 추가 라운드를 거쳐 증폭되며, 낮은 온도에서 프라이머가 결합할 수 있는 비특이적 서열과 경쟁한다. 프라이머가 처음에 (더 높은 온도 단계에서) 관심 서열에 결합하면, 중합효소 연쇄 반응의 후속 라운드를 통해 해당 단편을 추가로 증폭할 수 있다. 터치다운은 더 높은 온도에서 반응의 특이성을 높이고, 어닐링 온도를 낮춤으로써 종반부의 효율성을 높인다.

터치다운 중합효소 연쇄 반응의 개략도. 프라이머와 DNA 간의 첫 번째 어닐링은 초기 온도에서 발생하고, 두 번째 어닐링은 온도가 \Delta T만큼 낮아진 후에 발생합니다. 따라서 두 번째 어닐링의 생성물은 2^{-1}만큼 불리합니다.
터치다운 중합효소 연쇄 반응의 개략도. 프라이머와 DNA 간의 첫 번째 어닐링은 초기 온도에서 발생하고, 두 번째 어닐링은 온도가 \Delta T만큼 낮아진 후에 발생합니다. 따라서 두 번째 어닐링의 생성물은 2^{-1}만큼 불리합니다.


수학적 관점에서, 낮은 온도에서 어닐링된 생성물은 i 사이클에서의 첫 번째 어닐링과 j 사이클에서의 두 번째 어닐링에 대해 2^{i-j} 만큼 불리하다. ( i,j\in \mathbb N , i\geq j )

2.3. 반응 종료

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8.신장72도5분
9.반응 중단4도15분
10.유지23도 (상온)영원히


터치다운 중합효소 연쇄 반응의 개략도. 프라이머와 DNA 간의 첫 번째 어닐링은 초기 온도에서 발생하고, 두 번째 어닐링은 온도가 \Delta T만큼 낮아진 후에 발생합니다. 따라서 두 번째 어닐링의 생성물은 2^{-1}만큼 불리합니다.
터치다운 중합효소 연쇄 반응의 개략도. 프라이머와 DNA 간의 첫 번째 어닐링은 초기 온도에서 발생하고, 두 번째 어닐링은 온도가 \Delta T만큼 낮아진 후에 발생합니다. 따라서 두 번째 어닐링의 생성물은 2^{-1}만큼 불리합니다.

터치다운 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 초기 단계에서 높은 어닐링 온도를 가진다. 어닐링 온도는 매 사이클마다 일정량 감소한다. 프라이머는 비특이적 결합을 가장 덜 허용하는 가장 높은 온도에서 어닐링된다. 따라서 처음 증폭되는 염기 서열은 프라이머 특이성이 가장 큰 영역, 즉 관심 있는 서열일 가능성이 가장 높다. 이 단편들은 이후 낮은 온도에서 추가 증폭되며, 이 과정에서 프라이머가 결합할 수 있는 다른 비특이적 서열과 경쟁한다. 높은 온도 단계에서 프라이머가 관심 서열에 먼저 결합하면, 이후 낮은 온도 단계에서 해당 단편이 추가로 증폭된다. 터치다운 PCR은 온도를 조절하여 반응 초기에는 특이성을 높이고, 후반부에는 효율성을 높인다.

수학적 관점에서, 낮은 온도에서 어닐링된 생성물은 i 사이클에서의 첫 번째 어닐링과 j 사이클에서의 두 번째 어닐링에 대해 2^{i-j} 만큼 불리하다 ( i,j\in \mathbb N , i\geq j ).

3. 원리

4. 활용