CRISPR
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1. 개요
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)는 세균과 고세균의 면역 체계에 사용되는 기술로, DNA를 정확하게 편집할 수 있는 도구이다. 1987년 처음 발견되었으며, 2000년대 초 스페인 연구진에 의해 CRISPR라는 용어가 처음 제안되었다. CRISPR은 Cas(CRISPR-associated) 유전자와 함께 작동하며, Cas9과 같은 단백질은 DNA를 절단하는 데 사용된다. 2012년 제니퍼 다우드나와 에마뉘엘 샤르팡티에는 Cas9을 이용한 게놈 편집 기술을 개발하여 2020년 노벨 화학상을 수상했다. CRISPR 기술은 유전자 치료, 작물 개량, 질병 연구 등 다양한 분야에 응용되고 있으며, Cas12a, Cas13 등 새로운 Cas 단백질의 발견과 함께 COVID-19 진단 기술에도 활용되고 있다. CRISPR 기술은 DNA의 특정 부분을 절단하고, 세포의 복구 기능을 이용하여 유전자를 편집하거나, 유전자 발현을 조절하는 데 사용된다. 이 기술은 한계점과 부작용, 윤리적 문제도 가지고 있다.
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| CRISPR | |
|---|---|
| CRISPR | |
 | |
| 유기체 | Escherichia coli |
| 택소ID | 511145 |
| 상징 | CRISPR |
| 엔트레즈 유전자 | 947229 |
| PDB | 4QYZ |
| 유니프로트 | P38036 |
| 레프세크 단백질 | NP_417241.1 |
| 개요 | |
| 명칭 | 영어: clustered regularly interspaced short palindromic repeat 한국어: 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복 서열 |
| 설명 | CRISPR는 세균과 고세균에서 발견되는 DNA 서열의 한 종류이며, CRISPR-Cas 시스템의 일부로 작용한다. CRISPR 서열은 바이러스와 같은 외부 침입자로부터 세포를 보호하는 데 사용되는 항바이러스 방어 시스템이다. |
| CRISPR-Cas 시스템 | |
| 기능 | CRISPR-Cas 시스템은 박테리아와 고세균에서 발견되는 획득 면역 시스템이다. 이 시스템은 세포가 과거에 침입했던 바이러스나 플라스미드를 기억하고, 다음에 침입할 때 해당 외래 유전자를 파괴하여 세포를 보호한다. |
| 작동 방식 | CRISPR 시스템은 CRISPR RNA (crRNA)를 사용하여 침입 DNA를 인식한다. crRNA는 외래 DNA와 일치하는 짧은 RNA 서열을 포함하며, Cas 단백질과 함께 작용하여 외래 DNA를 절단한다. |
| 유형 | CRISPR-Cas 시스템에는 여러 유형이 있으며, 각각 다른 Cas 단백질과 작동 메커니즘을 가지고 있다. 주요 유형으로는 CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas12a (Cpf1), CRISPR-Cas13 등이 있다. |
| 응용 분야 | |
| 유전자 편집 | CRISPR-Cas9 시스템은 유전자 편집 도구로 널리 사용된다. 이 기술은 동식물의 유전체를 정밀하게 편집할 수 있으며, 질병 치료, 농업 개선 등 다양한 분야에 응용될 수 있다. 관련 기술로는 CRISPRa, CRISPRi, Prime editing, RESCUE, LEAPER 등이 있다. |
| 기타 응용 | 유전자 조절 진단 기술 항생제 개발 |
| 역사 | |
| 발견 | 1987년, 일본 오사카 대학의 나카타 이시노 연구팀이 처음 발견했다. |
| 연구 | 2007년, Rodolphe Barrangou 연구팀은 CRISPR가 박테리아에서 항바이러스 면역 시스템으로 작용함을 밝혀냈다. 2012년, Jennifer Doudna와 Emmanuelle Charpentier 연구팀은 CRISPR-Cas9 시스템을 유전자 편집 도구로 사용하는 방법을 개발했다. |
| 노벨상 | 2020년, Emmanuelle Charpentier와 Jennifer A. Doudna는 CRISPR-Cas9 시스템 개발 공로로 노벨 화학상을 수상했다. |
| 추가 정보 | |
| 관련 기술 | Anti-CRISPR CIRTS CRISPeY CRISPR-Cas10 CRISPR-BEST CRISPR-Disp CRISPR-Gold Easi-CRISPR FACE |
| 관련 효소 | Cas9 FokI EcoRI PstI SmaI HaeIII Cas12a (Cpf1) xCas9 |
| 관련 응용 | CAMERA ICE Genética dirigida |
2. 역사
CRISPR(클러스터드 레귤러리 인터스페이스드 쇼트 팔린드로믹 리피트)는 1987년 이시노 요시즈미(石野良純) 등에 의해 대장균에서 처음으로 발견되었다.[189] 2002년에 CRISPR라는 이름이 붙여졌고,[191] CRISPR 반복 서열 근처에 뉴클레아제(핵산분해효소)와 헬리카제를 암호화하는 ''cas'' 유전자군이 존재한다는 사실이 밝혀졌다.[191]
2005년에는 CRISPR의 스페이서 서열이 파지에서 유래했다는 것이 밝혀졌고,[224][225][226] 2007년에는 CRISPR가 박테리오파지에 대한 내성을 획득하는 기능이 있다는 것이 실험적으로 증명되었다.[187]
2. 1. 반복 서열의 발견
1987년, 일본 오사카 대학교의 이시노 요시즈미(石野良純) 연구팀은 대장균(Escherichia coli)에서 ''iap'' 유전자와 함께 CRISPR 서열의 일부를 우연히 발견했다.[14][15] 이 반복 서열은 특이하게도 중간에 다른 서열이 끼어들어 있었지만, 연구팀은 그 기능을 알지 못했다.[43][15]1993년, 네덜란드의 연구자들은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에서 중단된 직접 반복(DR)의 집합체를 발견하고, 이를 이용해 균주를 타이핑(typing)하는 방법인 스폴리고타이핑을 개발했다.[17][18]
2000년, 스페인 알리칸테 대학교의 프란시스코 모히카(Francisco Mojica) 연구팀은 할로페락스속(Haloferax)과 할로아르쿨라속(Haloarcula)과 같은 고세균에서 반복 서열의 기능을 연구했다. 모히카의 지도교수는 집중된 반복 서열이 세포 분열 중 DNA를 정확하게 분리하는 역할을 한다고 추측했다. 또한, 중단된 반복 서열의 전사가 처음으로 확인되었다.[18][19] 모히카 연구팀은 20종의 미생물에서 중단된 반복 서열을 확인하고, 2001년에 이를 '짧고 규칙적으로 간격을 둔 반복'(SRSR)이라 불렀다가, CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, 클러스터화된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복)라는 용어를 제안했다.[19][22]
2005년, 여러 연구팀이 CRISPR 스페이서 서열이 파지(phage) DNA와 같은 외부 DNA에서 유래한다는 것을 밝혀내면서, CRISPR-Cas 시스템이 세균의 적응 면역에 관여한다는 가설이 제기되었다.[224][225][226]
2007년, 로돌프 바랑구(Rodolphe Barrangou) 연구팀은 써모필루스 락토바실러스(Streptococcus thermophilus)를 이용한 실험을 통해 CRISPR가 박테리오파지(bacteriophage)에 대한 적응 면역 시스템이라는 것을 증명하였다.[187] 바랑구의 고용주였던 다니스코(Danisco)는 이 기술을 이용해 파지 저항성 균주를 개발했고, 이후 듀폰(DuPont)에 인수되어 유제품 배양 시장에 널리 퍼지게 되었다.[26]
2. 2. CRISPR-associated systems (Cas)
루드 얀센(Ruud Jansen)은 원핵생물의 반복 클러스터에 인접한 유전자군(Cas1~4)을 발견하고, 이들이 CRISPR 관련 시스템(Cas)을 구성한다는 것을 확인했다. Cas 단백질은 헬리케이스와 뉴클레아제 모티프를 가지고 있어, CRISPR 유전자좌의 역동적인 구조에 역할을 한다는 것을 시사했다.[27]
유사한 서열을 가진 여러 CRISPR이 단일 게놈에 존재할 수 있으며, 그 중 하나만 Cas 유전자와 연관되어 있다.[30]
2008년, Brouns와 Van der Oost는 Cas 단백질 복합체인 Cascade를 확인했는데, 이는 ''E. coli''에서 반복 내에서 CRISPR RNA 전구체를 성숙한 스페이서 함유 RNA 분자(CRISPR RNA, crRNA)로 절단하며, 이는 단백질 복합체에 결합된 상태로 남아 있었다.[38] 또한, Cascade, crRNA 및 헬리케이스/뉴클레아제(Cas3)가 박테리아 숙주에게 DNA 바이러스 감염에 대한 면역력을 제공하는 데 필요하다는 것을 발견했다. 바이러스에 대항하는 CRISPR을 설계함으로써, 그들은 crRNA(센스/안티센스)의 두 가지 방향이 면역을 제공한다는 것을 보여주었는데, 이는 crRNA 가이드가 dsDNA를 표적으로 한다는 것을 나타낸다. 같은 해 Marraffini와 Sontheimer는 ''S. epidermidis''의 CRISPR 서열이 접합을 방지하기 위해 RNA가 아닌 DNA를 표적으로 한다는 것을 확인했다.[43][103]
''cas'' 유전자군(CRISPR 관련 유전자군)은 반복-간격 서열 근처에서 자주 발견되는 유전자군이며, 현재까지 40개 이상의 패밀리가 발견되었다.[222] 특히 Cas1 패밀리는 CRISPR/Cas 시스템에 공통적으로 존재하는 것으로 보인다. ''cas'' 유전자와 반복 구조의 조합에 따라 8가지의 서브타입(Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern, Mtube)이 정의되어 있으며, 그중 일부 서브타입에는 반복 관련 신비 단백질(repeat-associated mysterious proteins, RAMPs)이라고 불리는 추가 요소가 발견되기도 한다.[222] 또한 하나의 게놈 내에 여러 CRISPR 서브타입이 존재하는 경우도 있다.
Cas 단백질 중에서 스페이서 획득에 관여하는 Cas1과 Cas2는 서브타입 간에 고도로 보존되어 있는 반면, 다른 단백질은 서브타입 간에 큰 차이를 보인다.[229]
2. 3. Cas9
제니퍼 다우드나(Jennifer Doudna)와 엠마뉘엘 샤르팡티에(Emmanuelle Charpentier) 연구팀은 2012년에 Cas9을 이용한 게놈 편집 기술을 개발하여 2020년 노벨 화학상을 수상하였다.[194][195] 같은 해, Jinek 등은 II형 CRISPR-Cas 시스템을 구성하는 Cas9이 RNA 의존성 DNA 핵산분해효소임을 밝히고, Cas9에 의한 표적 DNA 절단이 생화학적으로 가능함을 보였다.[237] 이듬해에는 여러 연구팀이 포유류 세포에서 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 게놈 편집에 성공했다.[238] 이 게놈 편집 기술에 관한 특허 출원은 이후 분쟁으로 이어졌다. 오늘날에는 게놈 편집 기술 외에도 전사 조절, 이미징, 핵산 검출법 등 다양한 응용법이 연구되거나 실용화되고 있다.[192][193]2. 4. Cas12a, Cas13
2015년, *Francisella novicida*라는 박테리아에서 유래한 Cas12a (Cpf1) 계열의 핵산분해효소가 발견되었다.[196] Cas12a는 Cas9과는 다른 특징을 가지는데, 표적을 절단한 후에도 결합한 상태로 남아 다른 ssRNA를 무차별적으로 절단하는 'collateral cleavage' 성질을 가지고 있다. 이러한 특징은 SHERLOCK(고감도 핵산 검출) 등 다양한 진단 기술 개발에 활용된다.[198]2016년에는 RNA를 표적으로 하는 엔도뉴클레아제 Cas13a (C2c2)가 발견되었다.[197] Cas13a는 ''Leptotrichia shahii'' 박테리아에서 유래하였으며, DNA는 절단하지 않고 단일 가닥 RNA(ssRNA)만을 절단한다. Cas13a는 crRNA에 의해 ssRNA 표적에 유도되어 표적에 결합하고 절단하며, Cas12a와 유사하게 부수적인 절단 특성을 보인다.[73] 이러한 특성은 뎅기열 바이러스나 지카 바이러스 판별, 악성 종양 DNA 변이 진단 등 다양한 진단 기술에 응용되고 있다.[193][199] 또한, Cas13의 특정 ssRNA 바이러스(인플루엔자 A 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 림프구성 뇌척수염 바이러스 3종)에 대한 항바이러스 작용을 이용한 CARVER 기술이 개발되어 항 ssRNA 바이러스제로의 응용 가능성도 제시되었다.[200] 더 나아가, Cas13a는 약제 내성균을 표적으로 한 증식 억제에도 사용될 수 있다고 기대된다.[201][202][203][204]
2021년, 양휘(Hui Yang) 박사는 새로운 소형 Cas13 단백질(mCas13) 변이체인 Cas13X와 Cas13Y를 분석, 특성화하였다. mCas13은 SARS-CoV-2 검출에 대한 민감도와 특이성을 보여주었다.[77]
2. 5. COVID-19 진단 기술 응용 (일본의 사례)
COVID-19 팬데믹과 관련하여 Cas12a/Cas13 기반 진단 기술이 적용되고 있다. 2020년 3월, Cas13a를 이용한 SARS-CoV-2 검출 프로토콜이 발표되었다.[205] Cas13을 이용한 검사는 샘플 RNA에 대해 민감도 95% 이상, 특이도 99% 이상의 높은 정확도와 검사당 0.05USD라는 저렴한 비용, 2시간 이내의 신속성이 장점으로, 기존 RT-PCR 검사법보다 우월하여 SARS-CoV-2 mRNA에 적용하는 것도 검토되고 있다.[206]일본에서는 이화학연구소, 도쿄대학교 선단과학기술연구센터 및 대학원 이학계연구과, 교토대학교 바이러스·재생의과학연구소 연구팀이 SARS-CoV-2 유래 바이러스 RNA를 분자 수준에서 5분 이내에 신속하고 높은 특이도로 검출하는 SATORI법(CRISPR-based Amplification-free Digital RNA Detection영어)을 개발했다.[207][208] 이 방법은 CRISPR-Cas13a 검사법에 마이크로칩 기술(마이크로 챔버 어레이)을 결합한 것으로, 타액과 같은 혼입 물질에 대해 강건(로버스트)하여 RNA 정제 작업이 필요 없고, PCR 검사보다 신속하며, 항원 검사보다 검출 감도와 특이도가 높다고 연구팀은 주장한다.[209][210][207]
또한, 도쿄대학교 의과학연구소 연구팀은 오프타겟 변이가 적다고 알려진 1형 Cas3을 이용한 CONAN법(Cas3-operated Nucleic Acid Detection영어)을 발표했다.[211][212][213] 이 검사 기법은 40분 이내의 신속한 검사가 가능하고, Cas12(Cas12a를 이용한 DETECTR법)나 rRT-PCR을 이용한 검사와 비슷한 속도와 감도이며, 특이도는 더 높고 저렴하며 숙련된 검사 인력이나 장비가 필요 없고, SARS-CoV-2 외에도 A형 인플루엔자 바이러스(H1N1pdm09·H3N2) 검사 등에도 응용 가능하다고 주장한다.
3. 형태와 특징
크리스퍼 캐스9는 크게 두 가지 요소로 이루어져 있다. RNA로 만들어진 '가이드 RNA'와 DNA를 절단하는 효소인 '캐스9'(Cas9)이다. (캐스12a도 존재한다.)[237]
원리적으로 모든 생물에 적용이 가능하다. 크리스퍼 캐스9를 수정란에 삽입하는 작업은 크게 어렵지 않다. 하지만 식물의 경우에는 세포벽이 있기 때문에 세포 안으로 캐스9를 삽입하는데 어려움이 있다. 그래서 식물에는 세균(벡터, 즉 유전자를 전달하는 운반자)을 세포 안으로 집어넣는 방법을 사용한다.[238]
4. 작동 방식
가이드 RNA는 DNA 중 특정 부분을 절단하도록 안내하는 역할을 한다. RNA는 DNA 서열에 상보적 결합이 가능하며, 이러한 특성을 이용하여 가이드 RNA는 자신과 정확하게 결합하는 DNA 서열을 찾아 결합한다.
이 가이드 RNA는 DNA 이중 나선을 절단하는 효소인 캐스9(Cas9)과 복합체를 형성한다. 유전자를 조작하고 싶은 부분에 이 효소를 넣으면 가이드 RNA가 목표한 DNA 서열을 찾아내고, 캐스9이 DNA를 절단한다.[237]
세포는 DNA가 절단되었을 때 복구하는 기능을 가지고 있다. 원래 서열로 복구되면 크리스퍼 캐스9가 다시 작동하여 절단하고, 이 과정이 반복되는 중에 복구 오류가 발생하여 원래 서열과 몇몇 염기에서 차이를 보인다. 변화가 나타나면 크리스퍼는 작동을 멈추고, 복구 오류로 변화된 서열은 원래의 기능을 발휘하지 못하게 된다. 이런 식으로 절단하고자 하는 유전자를 정확하게 찾아내 파괴(녹아웃)할 수 있다.
또한, 크리스퍼 캐스9과 함께 새로운 DNA 서열을 넣으면, 세포가 절단된 부분을 복구하는 과정에서 추가된 DNA 서열을 흡수하여 유전자를 편집할 수 있다.[238]
CRISPR의 DNA 절단 기전은 유전자 공학적 응용에도 사용된다. 2012년 Jinek 등은 II형 CRISPR-Cas 시스템을 구성하는 Cas9이 RNA 의존성 DNA 핵산분해효소임을 밝히고, Cas9에 의한 표적 DNA 절단이 가능함을 보였다.[237] 그 이듬해에는 여러 연구팀이 포유류 세포의 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 게놈 편집에 성공했다.[238] 오늘날에는 게놈 편집 기술 외에도 전사 조절, 이미징, 핵산 검출법 등 다양한 응용법이 연구되거나 실용화되고 있다.[192][193]
5. 한계점과 부작용
크리스퍼 기술은 난치병 치료에 사용될 수 있는 정교한 유전자 치료술로 평가받지만, 아직 임상 적용에는 여러 한계점과 부작용이 존재한다.
먼저, 연구 목적과 임상 적용 사이에는 차이가 있다는 것이 학계의 입장이다. 미국의 노비타스 생명의학연구소는 유전자 가위와 암의 상관관계를 우려하며, DNA 손상을 복구하는 p53 유전자를 언급했다. p53 유전자는 유전자 가위 작동을 방해하므로, 유전자 가위는 p53 유전자가 없는 비정상 세포에서 더 잘 작동한다. 그러나 p53 유전자는 암 발생 억제 역할도 수행하기 때문에, 임상 실험에서는 p53 유전자가 결실된 세포를 사용하지 않지만, 노비타스 연구소의 연구 결과는 임상 적용 시 더 면밀한 검사가 필요함을 시사한다.
또한, 유전자 가위의 표적이탈 문제는 어느 정도 해결되었지만, 세포가 손상된 DNA를 복구하는 과정에서 예상치 못한 염기서열 결실, 삽입, 재배열이 발생할 수 있다. 이를 해결하기 위해서는 DNA 복제 메커니즘을 정확하게 이해하고, 표적지점 변이 관련 연구가 필요하다.
6. Locus structure
CRISPR 유전자좌는 AT가 풍부한 리더 서열과 고유한 스페이서로 분리된 짧은 반복 서열로 구성된다.[78] CRISPR 반복 서열의 크기는 보통 28~37 염기쌍(bp)이지만, 23bp에서 55bp까지 다양하다.[79] 일부는 이중 대칭을 보여 RNA에서 스템-루프('헤어핀') 같은 이차 구조 형성을 암시하는 반면, 다른 일부는 비구조적으로 설계되었다. 스페이서의 크기는 보통 32~38bp (범위 21~72bp)이다.[79] 파지 감염에 대한 면역 반응으로 새로운 스페이서가 빠르게 나타날 수 있다.[131] CRISPR 배열에는 일반적으로 50개 미만의 반복-스페이서 서열이 존재한다.[79]
대부분의 CRISPR 자리에는 ''cas'' 유전자군, 선행 서열, 반복-스페이서 서열의 세 가지 요소가 존재한다.[220][230] Cas 단백질군의 종류와 작용 기전의 차이에 따라 CRISPR-Cas 시스템은 크게 I형, II형, III형으로 분류되며, 각 시스템은 여러 하위 유형으로 나뉜다.[221]
6. 1. Repeats and spacers (반복 서열과 스페이서)
집중된 DNA 반복 서열의 발견은 세계 세 곳에서 독립적으로 이루어졌다. 나중에 CRISPR로 불리게 될 것의 최초 기술은 1987년 오사카 대학교의 이시노 요시즈미 연구원과 그의 동료들에 의해 이루어졌다. 그들은 표적 게놈인 ''대장균''에서 ''iap'' 유전자와 함께 CRISPR 서열의 일부를 우연히 클로닝했다.[14][15] 반복 서열의 구성은 특이했는데, 이 반복 서열은 일반적으로 다른 서열을 끼워 넣지 않고 연속적으로 배열되었다.[43][15]1993년, 네덜란드의 ''결핵균'' 연구자들은 ''결핵균''의 다양한 균주에서 직접 반복 사이에 개입하는 서열의 다양성을 인식했고,[16] 이 특성을 이용하여 오늘날에도 여전히 사용되는 ''스폴리고타이핑''이라는 타이핑 방법을 고안했다.[17][18]
스페인 알리칸테 대학교의 프란시스코 모히카는 고세균 종인 ''할로페락스속''과 ''할로아르쿨라속''에서 반복 서열의 기능을 연구했다. 중단된 반복 서열의 전사도 처음으로 확인되었는데, 이는 CRISPR의 최초의 완전한 특성 분석이었다.[18][19] 2001년, 모히카와 루드 얀센은 이러한 서열을 설명하는 데 사용되는 수많은 약어를 통합하기 위해 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, 클러스터화된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복)라는 약어를 제안했다.[19][22] 2002년, Tang 등은 ''아케아글로부스 풀기두스''의 게놈에서 CRISPR 반복 영역이 긴 RNA 분자로 전사된 후 단위 길이의 작은 RNA와 2, 3개 이상의 스페이서-반복 단위의 더 긴 형태로 처리된다는 증거를 제시했다.[23][24]
2005년, 요구르트 연구자인 로돌프 바랑구는 반복적인 파지 감염 도전 후 ''써모필루스 락토바실러스''가 추가적인 CRISPR 스페이서 서열의 통합으로 인해 파지 저항성이 증가한다는 것을 발견했다.[25]
CRISPR 배열은 AT가 풍부한 리더 서열에 이어 고유한 스페이서로 분리된 짧은 반복 서열로 구성된다.[78] CRISPR 반복 서열의 크기는 일반적으로 28~37 염기쌍(bp)이지만, 23bp만큼 짧거나 55bp만큼 긴 경우도 있다.[79] 일부는 이중 대칭을 보이는데, 이는 RNA에서 이차 구조(예: 스템-루프('헤어핀'))의 형성을 암시하는 반면, 다른 일부는 비구조적으로 설계된다. 서로 다른 CRISPR 배열에서 스페이서의 크기는 일반적으로 32~38 bp(범위 21~72 bp)이다.[79] CRISPR 배열에는 일반적으로 반복-스페이서 서열이 50개 미만 있다.[79]
대부분의 CRISPR 자리에는 ''cas'' 유전자군, 선행 서열, 반복-스페이서 서열의 세 가지 요소가 존재한다.[220][230] CRISPR 반복 서열 요소는 24~48개의 염기쌍으로 구성되며[222] 일반적으로 회문 서열을 포함하여 stem-loop 헤어핀 구조를 형성한다.[223] 이 반복 서열 요소 사이에는 비슷한 길이의 스페이서가 삽입되어 있다.[222] 스페이서의 서열은 플라스미드나 파지가 가지는 서열과 동일하거나[224][225][226] 자신의 게놈 내 서열과 동일(self-targeting spacers)한 경우도 있다.[227] 파지가 감염되면 새로운 스페이서가 빠르게 추가된다.[228]
6. 2. CRISPR RNA structures
CRISPR 배열은 AT가 풍부한 리더 서열에 이어 고유한 스페이서로 분리된 짧은 반복 서열로 구성된다.[78] CRISPR 반복 서열의 크기는 일반적으로 28~37 염기쌍(bp)이지만, 23bp만큼 짧거나 55bp만큼 긴 경우도 있다.[79] 일부는 이중 대칭을 보이는데, 이는 RNA에서 이차 구조(예: 스템-루프('헤어핀'))의 형성을 암시하는 반면, 다른 일부는 비구조적으로 설계된다. 서로 다른 CRISPR 배열에서 스페이서의 크기는 일반적으로 32~38 bp(범위 21~72 bp)이다.[79] 새로운 스페이서는 파지 감염에 대한 면역 반응의 일부로 빠르게 나타날 수 있다.[131] CRISPR 배열에는 일반적으로 반복-스페이서 서열이 50개 미만 있다.[79]대부분의 CRISPR 자리에는 ''cas'' 유전자군, 선행 서열, 반복-스페이서 서열의 세 가지 요소가 존재한다.[220][230] CRISPR-Cas 시스템을 구성하는 Cas 단백질군의 종류와 작용 기전의 차이에 따라 I형, II형, III형으로 크게 분류되며, 각 CRISPR-Cas 시스템은 각각 여러 하위 유형으로 분류된다.[221] CRISPR 반복 서열 요소는 24~48개의 염기쌍으로 구성되며[222] 일반적으로 회문 서열을 포함하여 stem-loop 헤어핀 구조를 형성한다.[223] 이 반복 서열 요소 사이에는 비슷한 길이의 스페이서가 삽입되어 있다.[222] 스페이서의 서열은 플라스미드나 파지가 가지는 서열과 동일하거나[224][225][226] 자신의 게놈 내 서열과 동일(self-targeting spacers)한 경우도 있다.[227] 파지가 감염되면 새로운 스페이서가 빠르게 추가된다.[228]
: [http://rfam.xfam.org Rfam] 데이터베이스에서 가져온 2차 구조. 패밀리 [http://rfam.xfam.org/family/RF01332 RF01332].
6. 3. Cas genes and CRISPR subtypes (Cas 유전자와 CRISPR 하위 유형)
CRISPR에 대한 이해는 얀선(Jansen)의 관찰에서 비롯되었다. 그는 원핵생물의 반복 클러스터가 CRISPR 관련 시스템(Cas) 1~4를 구성하는 네 개의 상동 유전자와 함께 존재한다는 것을 발견했다. Cas 단백질은 헬리케이스와 뉴클레아제 모티프를 보여주어 CRISPR 유전자좌의 역동적인 구조에 역할을 한다는 것을 시사했다.[27] 이 논문에서 CRISPR라는 약어가 이 패턴의 보편적인 이름으로 사용되었지만, 그 기능은 여전히 불분명했다.또한, 유사한 서열을 가진 여러 CRISPR이 단일 게놈에 존재할 수 있으며, 그 중 하나만 Cas 유전자와 연관되어 있다.[30]
2005년, 세 개의 독립적인 연구팀은 일부 CRISPR 스페이서가 파지 DNA와 플라스미드와 같은 염색체 외 DNA에서 유래한다는 것을 보여주었다.[31][33] 스페이서는 이전에 세포를 공격했던 바이러스에서 수집된 DNA 조각이다. 스페이서의 근원은 CRISPR-Cas 시스템이 세균의 적응 면역에 역할을 할 수 있다는 신호였다.[28][34]
알리칸테 대학교(University of Alicante)의 Mojica와 공동 연구자들이 발표한 최초의 논문[32]은 미생물 면역에서 CRISPR-Cas의 역할을 제안하며, 진핵 세포가 사용하는 RNA 간섭 시스템과 유사한 메커니즘에서 표적 인식에 대한 스페이서의 RNA 전사체의 역할을 예측했다. Koonin과 동료들은 그들의 단백질의 예측된 기능에 따라 다양한 CRISPR-Cas 하위 유형의 작용 메커니즘을 제안함으로써 이 RNA 간섭 가설을 확장했다.[36]
여러 연구팀의 실험적 연구는 CRISPR-Cas 면역의 기본 메커니즘을 밝혀냈다. 2007년, CRISPR이 적응 면역 시스템이라는 최초의 실험적 증거가 발표되었다.[5][43] ''Streptococcus thermophilus''의 CRISPR 영역은 감염된 박테리오파지의 DNA에서 스페이서를 획득했다. 연구원들은 시험된 파지에서 발견된 것과 일치하는 스페이서를 추가하고 삭제함으로써 다양한 유형의 파지에 대한 ''S. thermophilus''의 저항성을 조작했다.[37][103] 2008년, Brouns와 Van der Oost는 Cas 단백질 복합체인 Cascade를 확인했는데, 이는 ''대장균''에서 반복 내에서 CRISPR RNA 전구체를 성숙한 스페이서 함유 RNA 분자(crRNA)로 절단하며, 이는 단백질 복합체에 결합된 상태로 남아 있었다.[38] 또한, Cascade, crRNA 및 헬리케이스/뉴클레아제(Cas3)가 박테리아 숙주에게 DNA 바이러스 감염에 대한 면역력을 제공하는 데 필요하다는 것을 발견했다. 바이러스에 대항하는 CRISPR을 설계함으로써, 그들은 crRNA(센스/안티센스)의 두 가지 방향이 면역을 제공한다는 것을 보여주었는데, 이는 crRNA 가이드가 dsDNA를 표적으로 한다는 것을 나타낸다. 같은 해 Marraffini와 Sontheimer는 ''S. epidermidis''의 CRISPR 서열이 접합을 방지하기 위해 RNA가 아닌 DNA를 표적으로 한다는 것을 확인했다. 이 발견은 CRISPR-Cas 면역의 제안된 RNA 간섭 유사 메커니즘과 상충되었지만, 나중에 ''Pyrococcus furiosus''에서 외래 RNA를 표적으로 하는 CRISPR-Cas 시스템이 발견되었다.[43][103] 2010년 연구는 CRISPR-Cas가 ''S. thermophilus''에서 파지와 플라스미드 DNA 가닥 모두를 절단한다는 것을 보여주었다.[39]
슈도모나스균( ''Streptococcus pyogenes'')에서 유래한 간단한 CRISPR 시스템은 Cas9 단백질에 의존한다. Cas9 핵산내부절단효소는 crRNA와 tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)라는 두 개의 작은 분자를 포함하는 4가지 구성 요소 시스템이다.[40][41] 2012년, 제니퍼 다우드나와 에마뉘엘 샤르팡티에는 두 개의 RNA 분자를 "단일 가이드 RNA"로 융합하여 Cas9 핵산내부절단효소를 더욱 관리하기 쉬운 두 가지 구성 요소 시스템으로 재설계했으며, 이는 Cas9와 결합하여 가이드 RNA가 지정한 DNA 표적을 찾아 절단할 수 있게 한다.[42] 이러한 공헌은 2020년 노벨 화학상 수상으로 이어질 만큼 중요했다. 가이드 RNA의 뉴클레오티드 서열을 조작함으로써, 인공 Cas9 시스템은 분리할 DNA 서열을 표적으로 지정하도록 프로그래밍될 수 있다.[42] 비르기니우스 시크슈니스 등이 참여한 또 다른 공동 연구는 ''S. thermophilus'' CRISPR 시스템의 Cas9도 crRNA 서열을 변경하여 원하는 부위를 표적으로 삼도록 재프로그래밍할 수 있음을 보여주었다. 이러한 발전은 수정된 CRISPR-Cas9 시스템으로 게놈을 편집하려는 노력에 박차를 가했다.[18]
펑 장과 조지 처치가 이끄는 연구팀은 CRISPR-Cas9을 이용하여 인간 세포 배양에서 게놈 편집을 최초로 동시에 발표했다.[43][44][45] 그 이후로 제빵 효모( ''Saccharomyces cerevisiae'')[46][47][48], 기회감염균 ''Candida albicans''[49][50], 제브라피쉬( ''Danio rerio'')[51], 초파리( ''Drosophila melanogaster'')[52][53], 개미( ''Harpegnathos saltator''[54] 및 ''Ooceraea biroi''[55]), 모기( ''Aedes aegypti''[56]), 선충( ''Caenorhabditis elegans'')[57], 식물[58], 생쥐( ''Mus musculus domesticus'')[59][60], 원숭이[61], 인간 배아[62] 등 광범위한 유기체에서 사용되었다.
CRISPR은 프로그래밍 가능한 전사인자를 만들어 표적 유전자의 활성화 또는 침묵을 가능하게 하도록 수정되었다.[63]
CRISPR-Cas9 시스템은 2015년 중국 과학자 P. Liang과 Y. Xu의 논문에서 처음으로 기술된 바와 같이 인간 삼핵배에서 효과적인 유전자 편집을 하는 것으로 나타났다.
2015년, 뉴클레아제 Cas12a가 박테리아 ''프란시셀라 노비시다''의 CRISPR-Cpf1 시스템에서 특징 지어졌다.[66][67] Cas12a는 Cas9과 몇 가지 주요 차이점을 보였는데, 여기에는 Cas9이 생성하는 '평활' 절단과는 대조적으로 이중 가닥 DNA에서 '엇갈린' 절단을 일으키는 것, 'T가 풍부한' PAM에 의존하는 것(Cas9에 대한 대안적인 표적 부위 제공), 그리고 성공적인 표적화를 위해 CRISPR RNA(crRNA)만 필요로 하는 것이 포함된다. 반대로 Cas9은 crRNA와 전사 활성화 crRNA(tracrRNA) 모두를 필요로 한다.
이러한 차이점은 Cas12a에 Cas9보다 몇 가지 장점을 제공할 수 있다. 예를 들어, Cas12a의 작은 crRNA는 다중화 유전체 편집에 이상적이다. Cas9의 sgRNA보다 더 많은 crRNA를 하나의 벡터에 담을 수 있기 때문이다. Cas12a가 남기는 끈적끈적한 5′ 돌출부는 기존 제한 효소 클로닝보다 훨씬 더 표적 특이적인 DNA 조립에도 사용할 수 있다.[68] 마지막으로, Cas12a는 PAM 부위에서 18-23개의 염기쌍 하류의 DNA를 절단한다. 이는 복구 후 인식 서열이 손상되지 않음을 의미하므로 Cas12a는 여러 라운드의 DNA 절단을 가능하게 한다. 반대로, Cas9은 PAM 부위의 상류 3개 염기쌍만 절단하므로 NHEJ 경로는 인식 서열을 파괴하는 인델 돌연변이를 초래하여 추가적인 절단 라운드를 방지한다. 이론적으로 반복적인 DNA 절단 라운드는 원하는 유전체 편집이 일어날 기회를 증가시켜야 한다.[69] Cas9과 비교하여 Cas12a의 독특한 특징은 표적을 절단한 후 Cas12a가 표적에 결합된 상태로 남아 다른 ssDNA 분자를 무차별적으로 절단한다는 것이다.[70] 이러한 특성을 "콜래터럴 절단" 또는 "전좌 절단" 활동이라고 하며 다양한 진단 기술 개발에 활용되었다.[71][72]
2016년, ''Leptotrichia shahii'' 박테리아에서 유래한 뉴클레아제가 특성 분석되었다. Cas13은 RNA-유도 RNA 엔도뉴클레아제로, DNA가 아닌 단일 가닥 RNA만 절단한다는 것을 의미한다. Cas13은 crRNA에 의해 ssRNA 표적에 유도되어 표적에 결합하고 절단한다. Cas12a와 유사하게, Cas13은 표적에 결합한 상태로 남아 다른 ssRNA 분자들을 무차별적으로 절단한다.[73] 이러한 부수적 절단 특성은 다양한 진단 기술 개발에 활용되어 왔다.[74][75][76]
2021년, 양휘(Hui Yang) 박사는 새로운 소형 Cas13 단백질(mCas13) 변이체인 Cas13X와 Cas13Y를 특성 분석하였다. mCas13의 특성 분석에서 SARS-CoV-2의 N 유전자 서열의 일부를 표적으로 사용하여, RT-LAMP와 결합된 mCas13이 합성 및 임상 샘플 모두에서 RT-qPCR(1 copy/μL)과 같은 다른 표준 검사보다 SARS-CoV-2 검출에 대한 민감도와 특이성을 보여주었다.[77]
CRISPR 배열은 AT가 풍부한 리더 서열에 이어 고유한 스페이서로 분리된 짧은 반복 서열로 구성된다.[78] CRISPR 반복 서열의 크기는 일반적으로 28~37 염기쌍(bp)이지만, 23bp만큼 짧거나 55bp만큼 긴 경우도 있다.[79] 일부는 이중 대칭을 보이는데, 이는 RNA에서 이차 구조(예: 스템-루프('헤어핀'))의 형성을 암시하는 반면, 다른 일부는 비구조적으로 설계된다. 서로 다른 CRISPR 배열에서 스페이서의 크기는 일반적으로 32~38 bp(범위 21~72 bp)이다.[79] 새로운 스페이서는 파지 감염에 대한 면역 반응의 일부로 빠르게 나타날 수 있다.[131] CRISPR 배열에는 일반적으로 반복-스페이서 서열이 50개 미만 있다.[79]
작은 ''cas'' 유전자 군집은 종종 CRISPR 반복-간격 배열체 근처에 위치한다. 총 93개의 ''cas'' 유전자는 암호화된 단백질의 서열 유사성을 기반으로 35개의 패밀리로 그룹화된다. 35개 패밀리 중 11개가 Cas1부터 Cas9까지의 단백질 패밀리를 포함하는 ''cas'' 코어를 형성한다. 완전한 CRISPR-Cas 로커스는 적어도 ''cas'' 코어에 속하는 하나의 유전자를 가지고 있다.
CRISPR-Cas 시스템은 두 가지 종류로 분류된다. 1종 시스템은 외래 핵산을 분해하기 위해 여러 Cas 단백질의 복합체를 사용한다. 2종 시스템은 동일한 목적으로 단일 대형 Cas 단백질을 사용한다. 1종은 I, III, IV형으로 나뉘며, 2종은 II, V, VI형으로 나뉜다. 6가지 시스템 유형은 33가지 하위 유형으로 나뉜다. 각 유형과 대부분의 하위 유형은 해당 범주에서 거의 독점적으로 발견되는 "시그니처 유전자"를 특징으로 한다. 분류는 또한 존재하는 ''cas'' 유전자의 보체를 기반으로 한다. 대부분의 CRISPR-Cas 시스템은 Cas1 단백질을 가지고 있다. Cas1 단백질의 계통 발생은 일반적으로 분류 시스템과 일치하지만, 모듈 셔플링으로 인해 예외가 존재한다. 많은 유기체는 여러 CRISPR-Cas 시스템을 포함하고 있어서 이들이 호환 가능하며 구성 요소를 공유할 수 있음을 시사한다. CRISPR-Cas 하위 유형의 산발적인 분포는 CRISPR-Cas 시스템이 미생물 진화 동안 수평적 유전자 전달의 영향을 받는다는 것을 시사한다.
CRISPR-Cas 면역은 세균과 고세균의 자연적인 과정이다.[102] CRISPR-Cas는 세포에 들어오는 외래 핵산을 분해함으로써 박테리오파지 감염, 접합 및 자연적 형질전환을 방지한다.[103]
CRISPR(클러스터드 레귤러리 인터스페이스드 쇼트 팔린드로믹 리피트)라고 불리는 반복 클러스터는 이시노 요시아키(石野良純) 등에 의해 1987년에 대장균에서 처음으로 기술되었다.[189] 2000년에 이르러 유사한 반복 클러스터가 다른 진정세균과 고세균에서 발견되었고, 이때는 short regularly spaced repeats (SRSR)이라고 명명되었으나,[190] 2002년에 CRISPR로 명명되었다.[191] 또한 CRISPR 반복 근처에는 뉴클레아제와 헬리카제를 암호화하는 CRISPR-associated (''cas'') 유전자군이 존재하는 것이 밝혀졌다.[191] 이 단계에서는 CRISPR의 기능과 역할은 불명확했지만, 그 후 2005년에 여러 그룹이 CRISPR의 스페이서 서열이 파지에서 유래한 것임을 발견했다.[224][225][226] 최종적으로 Barrangou 등에 의해 CRISPR의 역할로 알려진 박테리오파지에 대한 내성 획득 기능이 실험적으로 증명된 것은 2007년이었다.[187]
대부분의 CRISPR 자리에는 ''cas'' 유전자군, 선행 서열, 반복-스페이서 서열의 세 가지 요소가 존재한다. 하지만 그 순서는 여기에 제시된 것과 같지 않을 수 있다.[220][230] 또한, CRISPR-Cas 시스템을 구성하는 Cas 단백질군의 종류와 작용 기전의 차이에 따라 I형, II형, III형으로 크게 분류되며, 각 CRISPR-Cas 시스템은 각각 여러 하위 유형으로 분류된다.[221]
''cas'' 유전자군(CRISPR 관련 유전자군)은 반복-간격 서열 근처에서 자주 발견되는 유전자군이며, 현재까지 40개 이상의 패밀리가 발견되었다.[222] 특히 Cas1 패밀리는 CRISPR/Cas 시스템에 공통적으로 존재하는 것으로 보인다. ''cas'' 유전자와 반복 구조의 조합에 따라 8가지의 서브타입(Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern, Mtube)이 정의되어 있으며, 그중 일부 서브타입에는 반복 관련 신비 단백질(repeat-associated mysterious proteins, RAMPs)이라고 불리는 추가 요소가 발견되기도 한다.[222] 또한 하나의 게놈 내에 여러 CRISPR 서브타입이 존재하는 경우도 있다.
Cas 단백질 중에서 스페이서 획득에 관여하는 Cas1과 Cas2는 서브타입 간에 고도로 보존되어 있는 반면, 다른 단백질은 서브타입 간에 큰 차이를 보인다.[229]
7. Mechanism (메커니즘)
CRISPR-Cas 면역은 세균과 고세균에서 발견되는 자연적인 방어 기작이다.[102] 이 시스템은 세포 안으로 들어오는 외부 핵산(DNA 또는 RNA)을 분해하여 박테리오파지 감염, 접합, 자연적 형질전환과 같은 현상을 막는다.[103]
CRISPR 시스템의 작동 방식은 크게 스페이서 획득, crRNA 생성, 간섭의 세 단계로 나뉜다.
- 스페이서 획득 (Spacer acquisition): 외부 DNA가 세포 내로 침입하면, Cas 단백질(주로 Cas1, Cas2)이 이 DNA 조각을 잘라 CRISPR 유전자좌 내의 스페이서(spacer)로 삽입한다. 이 스페이서는 나중에 동일한 DNA가 다시 침입했을 때 인식하는 일종의 '기억' 역할을 한다.
- crRNA 생성 (Biogenesis): CRISPR 유전자좌는 긴 RNA 전사체로 전사된 후, Cas 단백질에 의해 짧은 crRNA(CRISPR RNA)로 잘린다. 각 crRNA는 특정 스페이서 서열과 반복 서열의 일부를 포함한다.
- 간섭 (Interference): crRNA는 Cas 단백질과 결합하여 복합체를 형성하고, 이 복합체가 외부 DNA 또는 RNA에 결합하여 분해한다. 이 과정은 crRNA의 스페이서 서열과 일치하는 염기서열을 가진 핵산만을 표적으로 한다.
CRISPR-Cas 시스템은 구성 요소와 작동 방식에 따라 여러 유형으로 분류된다. 주요 유형은 다음과 같다.
- I형 시스템: Cascade라는 복합체를 형성하여 crRNA를 생성하고, Cas3 단백질을 이용하여 표적 DNA를 분해한다.
- II형 시스템: Cas9 단백질이 crRNA 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)와 함께 작동하여 표적 DNA를 자른다. 이 시스템은 유전자 편집 기술에 널리 활용된다.
- III형 시스템: Cas 단백질 복합체가 crRNA와 결합하여 표적 DNA 또는 RNA를 분해한다. III형 시스템은 RNA를 표적으로 하는 독특한 능력을 가진다.
각 시스템은 crRNA 생성 방식, 표적 핵산의 종류(DNA 또는 RNA), 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열의 필요성 등에서 차이를 보인다. PAM 서열은 I형 및 II형 시스템에서 중요하지만, III형 시스템에서는 필요하지 않다.
CRISPR-Cas 시스템은 자기 자신의 DNA와 외부 DNA를 구별하는 능력을 가지고 있다. 이는 crRNA에 포함된 반복 서열의 일부가 자기 DNA와의 결합을 막아주기 때문이다.
7. 1. Spacer acquisition (스페이서 획득)
CRISPR 시스템의 핵심 발전은 얀선(Jansen)의 연구에서 비롯되었다. 얀선은 원핵생물에서 반복되는 클러스터가 CRISPR 관련 시스템(Cas) 유전자와 함께 존재하며, 이 Cas 단백질이 헬리케이스 및 뉴클레아제 모티프를 통해 CRISPR 유전자좌의 역동적인 구조에 기여한다는 것을 발견했다.[27] 이 발견으로 CRISPR라는 용어가 널리 사용되기 시작했지만, 그 기능은 명확하지 않았다.2005년, 여러 연구팀은 CRISPR 스페이서 중 일부가 파지 DNA 및 플라스미드와 같은 염색체 외 DNA에서 유래한다는 것을 밝혀냈다.[31][33] 이 스페이서들은 이전에 세포를 공격했던 바이러스 DNA 조각으로, CRISPR-Cas 시스템이 세균의 적응 면역에 관여할 수 있음을 시사했다.[28][34]
알리칸테 대학교의 모지카(Mojica) 연구팀은 CRISPR-Cas가 미생물 면역에 중요한 역할을 하며, 진핵 세포의 RNA 간섭 시스템과 유사하게 스페이서 RNA 전사체가 표적 인식에 관여할 것이라고 예측했다.[32] Koonin 연구팀은 이 가설을 확장하여 다양한 CRISPR-Cas 하위 유형의 작동 메커니즘을 제안했다.[36]
2007년, CRISPR이 적응 면역 시스템이라는 실험적 증거가 처음으로 발표되었다.[5][43] ''스트렙토코커스 써모필러스''(Streptococcus thermophilus)의 CRISPR 영역은 감염된 박테리오파지의 DNA에서 스페이서를 획득했다. 연구자들은 파지 DNA와 일치하는 스페이서를 추가하거나 제거하여 파지에 대한 ''S. thermophilus''의 저항성을 조절했다.[37][103]
미생물이 박테리오파지에 감염되면, 면역 반응의 첫 단계는 파지 DNA를 포획하여 스페이서 형태로 CRISPR 위치에 삽입하는 것이다. Cas1과 Cas2는 스페이서 획득에 관여하는 핵심 효소이다. 이들은 CRISPR-Cas 면역 시스템에서 발견되며, 돌연변이 연구를 통해 Cas1 또는 Cas2가 제거되면 스페이서 획득이 중단되지만 CRISPR 면역 반응에는 영향을 미치지 않는다는 것이 확인되었다.[104][105][106][107][108]
Cas1 단백질은 다양한 아미노산 서열을 가지지만, 결정 구조는 유사하며 금속 의존성 뉴클레아제/인테그라제로서 DNA에 결합한다.[84] Cas2 단백질은 (단일 가닥) ssRNA-[112] 또는 (이중 가닥) dsDNA-[113][114] 특이적 엔도리보뉴클레아제 활성을 가진다.
''대장균''(E. coli)의 I-E 시스템에서 Cas1과 Cas2는 복합체를 형성하여 침입 DNA의 이중 가닥 조각에 결합하고, Cas1은 DNA의 단일 가닥 플랭크에 결합하여 CRISPR 배열로의 통합을 촉매한다.[116][117][118] 새로운 스페이서는 리더 서열 옆 CRISPR의 시작 부분에 추가되어 바이러스 감염의 기록을 만든다.[119] ''대장균''에서 통합 숙주 인자(IHF)는 이 통합의 정확성을 담당한다.[120]
''술폴로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)''의 CRISPR 분석 결과는 스페이서 삽입이 리더 서열에 가장 가까운 곳이 아닌, CRISPR 어레이 전체에 걸쳐 무작위로 삽입될 수 있음을 보여준다.[129]
여러 CRISPR에는 동일한 파지에 대한 많은 스페이서가 포함될 수 있다. ''대장균''의 I-E형 시스템에서는 스페이서가 이미 파지를 표적으로 하는 경우, 프로토스페이서와의 불일치가 있더라도 스페이서 획득이 크게 향상되는 '프라이밍' 현상이 나타난다. 이는 획득과 간섭에 관여하는 Cas 단백질의 상호 작용을 통해 이루어지며, 새로 획득된 스페이서는 항상 프라이밍 스페이서와 같은 가닥에 위치하게 된다.[108][134][135]
7. 1. 1. Protospacer adjacent motifs (PAM)
파지 유전체 영역에서 스페이서(프로토스페이서)로 절단된 부분에 대한 생물정보학적 분석 결과, 이들은 무작위로 선택되지 않았으며, 대신 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)라 불리는 짧은(3~5bp) DNA 서열에 인접해 있는 것으로 나타났다.[33] CRISPR-Cas 시스템 분석 결과, PAM은 획득 과정에서 I형 및 II형 시스템에는 중요하지만 III형 시스템에는 중요하지 않은 것으로 나타났다.[33][123][124][125][126][127] I형 및 II형 시스템에서 프로토스페이서는 PAM 서열에 인접한 위치에서 절단되며, 스페이서의 다른 끝은 자(ruler) 메커니즘을 사용하여 절단되어 CRISPR 배열에서 스페이서 크기의 규칙성이 유지된다.[128][129] PAM 서열의 보존은 CRISPR-Cas 시스템 간에 다르며, Cas1 및 리더 서열과 진화적으로 연결되어 있는 것으로 보인다.[127][130]새로운 스페이서는 CRISPR 배열에 방향성 있는 방식으로 추가되며,[31] 리더 서열에 인접하여[126][129] 우선적으로[131][123][124][132][133] 발생하지만, 배타적이지는 않다. '''대장균'''의 I-E형 시스템 분석 결과, 리더 서열에 인접한 첫 번째 직접 반복 서열이 복사되고, 새로 획득한 스페이서가 첫 번째와 두 번째 직접 반복 서열 사이에 삽입된다는 것을 보여주었다.[107][128]
PAM 서열은 I-E형 시스템에서 스페이서 삽입 과정에 중요한 것으로 보인다. 해당 서열에는 프로토스페이서의 첫 번째 뉴클레오타이드(nt)에 인접한 강하게 보존된 최종 뉴클레오타이드(nt)가 포함되어 있다. 이 nt는 첫 번째 직접 반복 서열의 최종 염기가 된다.[108][134][135] 이는 스페이서 획득 기구가 스페이서 삽입 과정에서 직접 반복 서열의 마지막에서 두 번째 위치와 PAM에서 단일 가닥 돌출부를 생성한다는 것을 시사한다. 그러나 다른 생물체의 PAM은 최종 위치에서 동일한 수준의 보존을 보이지 않으므로 모든 CRISPR-Cas 시스템이 이 메커니즘을 공유하는 것은 아닌 것으로 보인다.[130] 이러한 시스템에서는 획득 과정에서 직접 반복 서열과 프로토스페이서의 맨 끝에 평활 말단이 생성될 가능성이 높다.
7. 2. Biogenesis (생성)
CRISPR에 대한 이해는 얀선(Jansen)의 관찰에서 비롯되었는데, 그는 원핵생물의 반복 클러스터가 CRISPR 관련 시스템(Cas) 유전자와 함께 존재한다는 것을 발견했다.[27] Cas 단백질은 헬리케이스와 뉴클레아제 모티프를 가지고 있어 CRISPR 유전자좌의 역동적인 구조에 역할을 한다는 것을 보여주었다.[27] 이 패턴의 보편적인 이름으로 CRISPR라는 약어가 사용되었지만, 그 기능은 여전히 불분명했다.또한, 유사한 서열을 가진 여러 CRISPR이 단일 게놈에 존재할 수 있으며, 그 중 하나만 Cas 유전자와 연관되어 있다.[30]
2005년, 세 개의 독립적인 연구팀은 일부 CRISPR 스페이서가 파지 DNA와 플라스미드와 같은 염색체 외 DNA에서 유래한다는 것을 보여주었다.[31][32][33] 스페이서는 이전에 세포를 공격했던 바이러스에서 수집된 DNA 조각이었다. 스페이서의 근원은 CRISPR-Cas 시스템이 세균의 적응 면역에 역할을 할 수 있다는 신호였다.[28][34]
알리칸테 대학교(University of Alicante)의 모지카(Mojica)와 공동 연구자들은 미생물 면역에서 CRISPR-Cas의 역할을 제안하며, 진핵 세포가 사용하는 RNA 간섭 시스템과 유사한 메커니즘에서 표적 인식에 대한 스페이서의 RNA 전사체의 역할을 예측했다.[32]
여러 연구팀의 실험적 연구는 CRISPR-Cas 면역의 기본 메커니즘을 밝혀냈다. 2007년, CRISPR이 적응 면역 시스템이라는 최초의 실험적 증거가 발표되었다.[5][43] ''스트렙토코커스 써모필루스''(Streptococcus thermophilus)의 CRISPR 영역은 감염된 박테리오파지의 DNA에서 스페이서를 획득했다. 연구원들은 시험된 파지에서 발견된 것과 일치하는 스페이서를 추가하고 삭제함으로써 다양한 유형의 파지에 대한 ''S. thermophilus''의 저항성을 조작했다.[37][103] 2008년, 브라운스(Brouns)와 반 데르 오스트(Van der Oost)는 Cas 단백질 복합체인 Cascade를 확인했는데, 이는 ''대장균''에서 반복 내에서 CRISPR RNA 전구체를 성숙한 스페이서 함유 RNA 분자(CRISPR RNA, crRNA)로 절단하며, 이는 단백질 복합체에 결합된 상태로 남아 있었다.[38]
CRISPR-Cas 면역은 세균과 고세균의 자연적인 과정이다.[102] CRISPR-Cas는 세포에 들어오는 외래 핵산을 분해함으로써 박테리오파지 감염, 접합 및 자연적 형질전환을 방지한다.[103]
CRISPR-RNA(crRNA)는 간섭 단계에서 Cas 뉴클레아제를 표적에 안내하는 역할을 하며, CRISPR 서열로부터 생성되어야 한다. crRNA는 처음에는 CRISPR 배열의 대부분을 포함하는 하나의 긴 전사체의 일부로 전사된다.[29] 이 전사체는 그 후 Cas 단백질에 의해 절단되어 crRNA를 형성한다. crRNA를 생성하는 메커니즘은 CRISPR-Cas 시스템에 따라 다르다. I-E형 및 I-F형 시스템에서는 각각 Cas6e 및 Cas6f 단백질이 crRNA를 둘러싸는 동일한 반복 서열의 쌍으로 생성된 스템-루프를 인식한다.[136][137][138] 이러한 Cas 단백질은 쌍을 이룬 영역의 가장자리에서 더 긴 전사체를 절단하여, 작은 쌍을 이룬 반복 영역의 잔해와 함께 단일 crRNA를 남긴다.
III형 시스템은 Cas6를 사용하지만, 반복 서열은 스템-루프를 생성하지 않는다. 대신 더 긴 전사체가 Cas6 주위를 감싸서 반복 서열 바로 상류에서 절단이 일어난다.[140][141][142]
II형 시스템은 Cas6 유전자가 없고 대신 RNaseIII를 절단에 이용한다. 기능적인 II형 시스템은 반복 서열에 상보적인 추가적인 작은 RNA를 암호화하는데, 이는 tracrRNA(trans-activating crRNA)로 알려져 있다.[40] tracrRNA와 주요 CRISPR 전사체의 전사는 염기쌍 형성과 반복 서열에서 dsRNA의 형성을 초래하며, 이는 그 후 RNaseIII에 의해 표적으로 삼아져 crRNA를 생성한다. 다른 두 시스템과 달리, crRNA는 전체 스페이서를 포함하지 않고 한쪽 끝이 잘린다.[93]
CrRNA는 Cas 단백질과 결합하여 외래 핵산을 인식하는 리보뉴클레오티드 복합체를 형성한다. I-E형 복합체(일반적으로 Cascade라고 함)는 단일 crRNA에 결합된 5개의 Cas 단백질을 필요로 한다.[146][147]
7. 3. Interference (간섭)
2005년, 세 독립적인 연구팀이 CRISPR 스페이서 중 일부가 파지 DNA 및 플라스미드와 같은 염색체 외 DNA에서 유래한다는 것을 밝혀냈다.[31][33] 이 스페이서는 이전에 세포를 공격했던 바이러스에서 수집된 DNA 조각으로, CRISPR-Cas 시스템이 세균의 적응 면역에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사했다.[28][34]알리칸테 대학교의 Mojica와 공동 연구자들은 미생물 면역에서 CRISPR-Cas의 역할을 제안하며, 진핵 세포가 사용하는 RNA 간섭 시스템과 유사한 메커니즘에서 표적 인식에 대한 스페이서의 RNA 전사체의 역할을 예측했다.[32] Koonin과 동료들은 다양한 CRISPR-Cas 하위 유형의 작용 메커니즘을 제안함으로써 이 RNA 간섭 가설을 확장했다.[36]
2007년, CRISPR이 적응 면역 시스템이라는 최초의 실험적 증거가 발표되었다.[5][43] 스트렙토코커스 써모필루스의 CRISPR 영역은 감염된 박테리오파지의 DNA에서 스페이서를 획득했으며, 연구원들은 파지에서 발견된 것과 일치하는 스페이서를 추가 및 삭제함으로써 파지에 대한 ''S. thermophilus''의 저항성을 조작했다.[37][103]
2008년, Brouns와 Van der Oost는 대장균에서 CRISPR RNA 전구체를 성숙한 스페이서 함유 RNA 분자(crRNA)로 절단하는 Cas 단백질 복합체인 Cascade를 확인했으며, 이는 단백질 복합체에 결합된 상태로 남아 있었다.[38] 또한, Cascade, crRNA 및 헬리케이스/뉴클레아제(Cas3)가 DNA 바이러스 감염에 대한 면역력을 제공하는 데 필요하며, crRNA 가이드가 dsDNA를 표적으로 한다는 것을 발견했다. 같은 해 Marraffini와 Sontheimer는 표피포도상구균의 CRISPR 서열이 접합을 방지하기 위해 RNA가 아닌 DNA를 표적으로 한다는 것을 확인했다.[43][103] 2010년 연구는 CRISPR-Cas가 ''S. thermophilus''에서 파지와 플라스미드 DNA 가닥 모두를 절단한다는 것을 보여주었다.[39]
Streptococcus pyogenes에서 유래한 CRISPR 시스템은 Cas9 핵산내부절단효소에 의존하며, crRNA와 tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)라는 두 개의 작은 분자를 포함하는 4가지 구성 요소 시스템이다.[40][41] 제니퍼 다우드나와 에마뉘엘 샤르팡티에는 두 개의 RNA 분자를 "단일 가이드 RNA"로 융합하여 Cas9 핵산내부절단효소를 더욱 관리하기 쉬운 두 가지 구성 요소 시스템으로 재설계했으며, 이는 Cas9와 결합하여 가이드 RNA가 지정한 DNA 표적을 찾아 절단할 수 있게 한다.[42] 이 공헌은 2020년 노벨 화학상 수상으로 이어졌다. 가이드 RNA의 뉴클레오티드 서열을 조작함으로써, 인공 Cas9 시스템은 DNA 서열을 표적으로 지정하도록 프로그래밍될 수 있다.[42] 비르기니우스 시크슈니스 연구팀은 ''S. thermophilus'' CRISPR 시스템의 Cas9도 crRNA 서열을 변경하여 원하는 부위를 표적으로 삼도록 재프로그래밍할 수 있음을 보여주었다. 이러한 발전은 수정된 CRISPR-Cas9 시스템으로 게놈을 편집하려는 노력에 박차를 가했다.[18]
펑 장과 조지 처치가 이끄는 연구팀은 CRISPR-Cas9을 이용하여 인간 세포 배양에서 게놈 편집을 최초로 동시에 발표했다.[43][44][45] 그 이후로 빵효모, 칸디다 알비칸스, 제브라피쉬, 초파리, 개미 (''Harpegnathos saltator'' 및 ''Ooceraea biroi''), 모기 (''Aedes aegypti''), 예쁜꼬마선충, 식물, 생쥐 (''Mus musculus domesticus''), 원숭이, 인간 배아 등 광범위한 유기체에서 사용되었다.[46][47][48][49][50][51][52][53][54][55][56][57][58][59][60][61][62]
CRISPR은 프로그래밍 가능한 전사인자를 만들어 표적 유전자의 활성화 또는 침묵을 가능하게 하도록 수정되었다.[63]
CRISPR-Cas9 시스템은 2015년 중국 과학자 P. Liang과 Y. Xu의 논문에서 처음으로 기술된 바와 같이 인간 삼핵배에서 효과적인 유전자 편집을 하는 것으로 나타났다. 이 시스템은 54개의 배아 중 28개에서 돌연변이 베타-헤모글로빈(HBB)을 성공적으로 절단했다. 28개의 배아 중 4개는 도너 템플릿을 사용하여 성공적으로 재조합되었다. 과학자들은 절단된 가닥의 DNA 재조합 과정에서 상동성 내인성 서열 HBD가 외인성 도너 템플릿과 경쟁한다는 것을 보여주었다. 인간 배아의 DNA 복구는 유래 줄기 세포보다 훨씬 더 복잡하고 특이하다.[64]
2015년, 뉴클레아제 Cas12a가 박테리아 ''프란시셀라 노비시다''의 CRISPR-Cpf1 시스템에서 특징 지어졌다.[66][67] Cas12a는 Cas9과 몇 가지 주요 차이점을 보였는데, 여기에는 Cas9이 생성하는 '평활' 절단과는 대조적으로 이중 가닥 DNA에서 '엇갈린' 절단을 일으키는 것, 'T가 풍부한' PAM에 의존하는 것(Cas9에 대한 대안적인 표적 부위 제공), 그리고 성공적인 표적화를 위해 CRISPR RNA(crRNA)만 필요로 하는 것이 포함된다. 반대로 Cas9은 crRNA와 전사 활성화 crRNA(tracrRNA) 모두를 필요로 한다.
이러한 차이점은 Cas12a에 Cas9보다 몇 가지 장점을 제공할 수 있다. 예를 들어, Cas12a의 작은 crRNA는 다중화 유전체 편집에 이상적이다. Cas9의 sgRNA보다 더 많은 crRNA를 하나의 벡터에 담을 수 있기 때문이다. Cas12a가 남기는 끈적끈적한 5′ 돌출부는 기존 제한 효소 클로닝보다 훨씬 더 표적 특이적인 DNA 조립에도 사용할 수 있다.[68] 마지막으로, Cas12a는 PAM 부위에서 18-23개의 염기쌍 하류의 DNA를 절단한다. 이는 복구 후 인식 서열이 손상되지 않음을 의미하므로 Cas12a는 여러 라운드의 DNA 절단을 가능하게 한다. 반대로, Cas9은 PAM 부위의 상류 3개 염기쌍만 절단하므로 NHEJ 경로는 인식 서열을 파괴하는 인델 돌연변이를 초래하여 추가적인 절단 라운드를 방지한다. 이론적으로 반복적인 DNA 절단 라운드는 원하는 유전체 편집이 일어날 기회를 증가시켜야 한다.[69] Cas9과 비교하여 Cas12a의 독특한 특징은 표적을 절단한 후 Cas12a가 표적에 결합된 상태로 남아 다른 ssDNA 분자를 무차별적으로 절단한다는 것이다.[70] 이러한 특성을 "콜래터럴 절단" 또는 "전좌 절단" 활동이라고 하며 다양한 진단 기술 개발에 활용되었다.[71][72]
2016년, ''Leptotrichia shahii'' 박테리아에서 유래한 뉴클레아제가 특성 분석되었다. Cas13은 RNA-유도 RNA 엔도뉴클레아제로, DNA가 아닌 단일 가닥 RNA만 절단한다는 것을 의미한다. Cas13은 crRNA에 의해 ssRNA 표적에 유도되어 표적에 결합하고 절단한다. Cas12a와 유사하게, Cas13은 표적에 결합한 상태로 남아 다른 ssRNA 분자들을 무차별적으로 절단한다.[73] 이러한 부수적 절단 특성은 다양한 진단 기술 개발에 활용되어 왔다.[74][75][76]
2021년, 양휘(Hui Yang) 박사는 새로운 소형 Cas13 단백질(mCas13) 변이체인 Cas13X와 Cas13Y를 특성 분석하였다. mCas13의 특성 분석에서 SARS-CoV-2의 N 유전자 서열의 일부를 표적으로 사용하여, RT-LAMP와 결합된 mCas13이 합성 및 임상 샘플 모두에서 RT-qPCR(1 copy/μL)과 같은 다른 표준 검사보다 SARS-CoV-2 검출에 대한 민감도와 특이성을 보여주었다.[77]
(1) 획득은 Cas1과 Cas2에 의한 침입 DNA 인식과 프로토스페이서 절단으로 시작된다.
(2) 프로토스페이서는 리더 서열에 인접한 직접 반복 서열에 연결되고
(3) 단일 가닥 신장이 CRISPR를 복구하고 직접 반복 서열을 복제한다. crRNA 처리 및 간섭 단계는 세 가지 주요 CRISPR 시스템 각각에서 다르게 발생한다.
(4) 주요 CRISPR 전사체는 cas 유전자에 의해 절단되어 crRNA를 생성한다.
(5) I형 시스템에서는 Cas6e/Cas6f가 직접 반복 서열의 헤어핀 루프에 의해 형성된 ssRNA와 dsRNA의 접합부에서 절단한다. II형 시스템은 trans-활성화(tracr) RNA를 사용하여 dsRNA를 형성하며, 이는 Cas9과 RNaseIII에 의해 절단된다. III형 시스템은 절단에 직접 반복 서열의 헤어핀 루프가 필요 없는 Cas6 상동체를 사용한다.
(6) II형 및 III형 시스템에서는 5' 또는 3' 말단에서 2차 트리밍이 수행되어 성숙한 crRNA가 생성된다.
(7) 성숙한 crRNA는 Cas 단백질과 결합하여 간섭 복합체를 형성한다.
(8) I형 및 II형 시스템에서는 단백질과 PAM 서열 간의 상호 작용이 침입 DNA의 분해에 필요하다. III형 시스템은 성공적인 분해에 PAM이 필요하지 않으며, III-A형 시스템에서는 crRNA와 mRNA 간의 염기쌍 형성이 III-B형 시스템에 의해 표적으로 되는 DNA가 아닌 mRNA에서 발생한다.
CRISPR-Cas 면역은 세균과 고세균의 자연적인 과정이다.[102] CRISPR-Cas는 세포에 들어오는 외래 핵산을 분해함으로써 박테리오파지 감염, 접합 및 자연적 형질전환을 방지한다.[103]
I형 시스템의 교란 단계에서 PAM 서열은 crRNA 상보 가닥에서 인식되며 crRNA 어닐링과 함께 필요하다. I형 시스템에서 crRNA와 프로토스페이서 사이의 정확한 염기쌍 형성은 카스케이드(Cascade)의 구조 변화를 일으켜 Cas3을 모집하여 DNA 분해를 유도한다.
II형 시스템은 교란 단계에 단일 다기능 단백질인 Cas9에 의존한다.[93] Cas9는 기능을 수행하고 이중 HNH 및 RuvC/RNaseH 유사 엔도뉴클레아제 도메인을 사용하여 DNA를 절단하기 위해 crRNA와 tracrRNA 모두를 필요로 한다. II형 시스템에서는 PAM과 파지 유전체 사이의 염기쌍 형성이 필요하다. 그러나 PAM은 crRNA와 같은 가닥(I형 시스템과 반대 가닥)에서 인식된다.
III형 시스템은 I형 시스템과 마찬가지로 crRNA에 결합하는 6개 또는 7개의 Cas 단백질을 필요로 한다.[148][149] ''S. solfataricus''와 ''P. furiosus''에서 분석된 III형 시스템은 모두 파지 DNA 유전체가 아닌 파지의 mRNA를 표적으로 한다.[85][149] 이는 이러한 시스템이 RNA 기반 파지 유전체를 표적으로 하는 데 독특한 능력을 갖도록 할 수 있다.[84] III형 시스템은 또한 복합체 내 다른 Cas 단백질인 Cas10을 사용하여 RNA 외에 DNA도 표적으로 하는 것으로 밝혀졌다.[150] DNA 절단은 전사 의존적인 것으로 나타났다.[151]
교란 중 자기 DNA와 외래 DNA를 구별하는 메커니즘은 crRNA에 내장되어 있으며 따라서 세 가지 시스템 모두에 공통적일 가능성이 높다. 각 주요 유형의 독특한 성숙 과정 전반에 걸쳐 모든 crRNA는 스페이서 서열과 한쪽 또는 양쪽 끝에 반복 서열의 일부를 포함한다. 스페이서 서열을 넘어서는 염기쌍 형성이 자기 신호를 보내고 DNA 절단을 방지하기 때문에 부분적인 반복 서열은 CRISPR-Cas 시스템이 염색체를 표적으로 하는 것을 방지한다.[152] RNA 유도 CRISPR 효소는 V형 제한효소로 분류된다.
8. Evolution (진화)
CRISPR-Cas 시스템의 cas 유전자는 두 가지 다른 조상 모듈에서 진화한 것으로 추정된다. 카스포손(casposon)이라고 하는 전위인자(transposon) 유사 요소가 독립적인 선천 면역 시스템으로 기능했을 가능성이 높은 조상 효과기 모듈 옆에 삽입되었는데, 이 요소는 Cas1 유사 인테그라제와 적응 모듈의 다른 구성 요소들을 암호화한다.[153] 적응 모듈의 고도로 보존된 cas1 및 cas2 유전자는 조상 모듈에서 진화한 반면, 다양한 1종 효과기 cas 유전자는 조상 효과기 모듈에서 진화했다.[154] 이러한 다양한 1종 효과기 모듈 cas 유전자의 진화는 중복 사건과 같은 다양한 메커니즘에 의해 이루어졌다.[155] 반면, 각 유형의 2종 효과기 모듈은 이동성 유전 요소의 후속 독립적 삽입에서 발생했다.[156] 이러한 이동성 유전 요소는 여러 유전자 효과기 모듈을 대체하여 효과기 모듈의 모든 필요한 작업을 수행하는 큰 단백질을 생성하는 단일 유전자 효과기 모듈을 생성했다.[166]
CRISPR-Cas 시스템의 스페이서 영역은 외래 이동성 유전 요소에서 직접 가져오기 때문에 장기적인 진화를 추적하기는 어렵다.[157] 이러한 스페이서 영역의 비무작위 진화는 환경과 특정 외래 이동성 유전 요소에 크게 의존하는 것으로 밝혀졌다.[158]
CRISPR-Cas는 박테리아를 특정 파지로부터 면역시켜 전파를 중단시킬 수 있다. 쿠닌은 CRISPR-Cas를 라마르크적 상속 메커니즘으로 설명했다.[159] 그러나 이는 "라마르크가 과학에 기여한 공로를 기억해야지, 그의 이론과 표면적으로만 유사한 것들에 대해서는 기억해서는 안 된다. 실제로 CRISPR 및 기타 현상을 라마르크적이라고 생각하는 것은 진화가 실제로 작동하는 단순하고 우아한 방식을 가리는 것뿐이다"라는 비판을 받았다.[160] 하지만 최근 연구에 따르면 CRISPR-Cas 시스템의 획득된 스페이서 영역이 실제로 획득되어 전달되는 유전적 돌연변이이기 때문에 라마르크적 진화의 한 형태라는 것이 분명해졌다.[161] 반면, 시스템을 촉진하는 Cas 유전자 기계의 진화는 고전적인 다윈적 진화를 통해 진화한다.[161]
CRISPR 서브타입은 원핵생물 계통에서 혼재하고 있으므로, 이 시스템은 수평적 전이에 의해 전파되어 온 것으로 생각된다. 원핵생물은 CRISPR/Cas 시스템에 의해 특정 파지에 대한 면역을 획득하고, 파지의 전파를 저지할 수 있다. 이 면역은 이후 유전되므로, 이것은 라마르크 진화라고 주장하는 연구자도 있다.[234]
8. 1. Coevolution (공진화)
CRISPR 진화의 기본 모델은 새롭게 통합된 스페이서가 파지를 유도하여 박테리아 면역 반응을 피하기 위해 게놈을 변이시키고, 파지와 숙주 집단 모두에서 다양성을 만드는 것이다.[162] 파지 감염에 저항하려면 CRISPR 스페이서의 서열이 표적 파지 유전자의 서열과 완벽하게 일치해야 한다. 스페이서에 점 돌연변이가 있으면 파지는 숙주를 계속 감염시킬 수 있다.[152] PAM에서도 유사한 엄격성이 필요하거나 박테리아 균주는 파지에 민감하게 남는다.[124][152]8. 2. Rates (진화 속도)
CRISPR 유전자좌의 스페이서 획득률은 다양하며, 일부 유전자좌는 다른 유전자좌보다 빠르게 진화한다.[123] 비교 유전체 분석에 따르면, *E. coli*와 *S. enterica*는 *S. thermophilus*보다 훨씬 느리게 진화하는 것으로 나타났다. 25만 년 전에 분기된 *S. thermophilus* 균주들은 여전히 동일한 스페이서 구성을 유지하고 있었다.[163]두 개의 산성 광산 배수 생물막에 대한 메타유전체 분석 결과, 분석된 CRISPR 중 하나는 다른 생물막에 비해 광범위한 결손과 스페이서 추가가 있는 것으로 나타났는데, 이는 한 군집에서 다른 군집보다 파지 활동이나 유병률이 더 높음을 시사한다.[131]
구강 내에서 시간 경과에 따른 연구에 따르면, 17개월 동안 개인 내에서는 7~22%의 스페이서가 공유되었지만, 개인 간에는 2% 미만이 공유되었다.[133] 같은 환경에서, 해당 CRISPR 시스템에 특이적인 PCR 프라이머를 사용하여 단일 균주를 추적했을 때, 스페이서 존재 유무에 대한 광범위한 결과는 상당한 다양성을 보여주었다. 그러나 이 CRISPR은 17개월 동안 세 개의 스페이서를 추가했다.[133] 이는 상당한 CRISPR 다양성을 가진 환경에서도 일부 유전자좌는 느리게 진화한다는 것을 시사한다.
인간 마이크로바이옴 프로젝트를 위해 생성된 메타유전체에서 CRISPR이 분석되었다.[164] 대부분은 신체 부위 특이적이었지만, 신체 부위 내 일부는 개인 간에 널리 공유되었다. 이러한 유전자좌 중 하나는 연쇄상구균 종에서 유래했으며, 약 15,000개의 스페이서를 포함하고 있었는데, 그중 50%가 고유했다. 구강 내 표적 연구와 마찬가지로, 일부는 시간이 지남에 따라 거의 진화하지 않았다.[164]
케모스타트를 사용하여 *S. thermophilus*에서 CRISPR 진화를 연구하여 스페이서 획득률을 직접 조사했다. 일주일 만에 *S. thermophilus* 균주는 단일 파지에 노출되었을 때 최대 세 개의 스페이서를 획득했다.[165] 같은 기간 동안 파지는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)을 획득했고, 이는 개체군에서 고정되었는데, 이는 표적화가 이러한 돌연변이가 없으면 파지 복제를 방지했음을 시사한다.
또 다른 *S. thermophilus* 실험에 따르면, 파지는 표적 스페이서가 하나뿐인 숙주에도 감염되어 복제될 수 있다. 또 다른 실험에서는 파지 역가가 높은 환경에서도 민감한 숙주가 존재할 수 있음을 보여주었다.[166] 케모스타트 및 관찰 연구는 CRISPR와 파지의 (공동) 진화에 대한 많은 뉘앙스를 시사한다.
9. Identification (식별)
CRISPR는 세균과 고세균에 널리 분포하며, 일정 부분 서열 유사성을 보인다.[27] 가장 주목할 만한 특징은 반복되는 스페이서와 직접 반복 서열이다. 이러한 특징 때문에 CRISPR는 DNA의 긴 서열에서 쉽게 식별할 수 있다. 반복 서열의 수가 많을수록 오류로 인한 일치 가능성이 줄어들기 때문이다.[27]
메타게놈 데이터에서 CRISPR 분석은 더욱 어렵다. CRISPR 유전자좌는 반복적인 특성이나 균주 변이로 인해 일반적으로 어셈블리되지 않기 때문에 어셈블리 알고리즘에 혼란을 야기한다. 많은 참조 유전체가 있는 경우, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 CRISPR 어레이를 증폭하고 스페이서 내용을 분석할 수 있다.[27] 그러나 이 방법은 특정 CRISPR을 대상으로 하고, 공개 데이터베이스에 충분한 정보가 있어 신뢰할 수 있는 PCR 프라이머를 설계할 수 있는 유기체에 대해서만 정보를 제공한다. 퇴화된 반복 서열 특이적 프라이머를 사용하여 환경 샘플에서 CRISPR 스페이서를 직접 증폭할 수도 있다. 두 개 또는 세 개의 스페이서가 포함된 증폭산물은 계산적으로 조립하여 긴 CRISPR 어레이를 재구성할 수 있다.[27]
또 다른 방법은 샷건 메타게놈 데이터에서 CRISPR 어레이를 추출하고 재구성하는 것이다. 특히 2세대 시퀀싱 기술(예: 454, Illumina)을 사용하는 경우, 짧은 판독 길이 때문에 단일 판독에 두 개 또는 세 개 이상의 반복 단위가 나타나는 것을 방지하기 때문에 계산적으로 더 어렵다. 원시 판독값에서 CRISPR 식별은 순수하게 ''de novo'' 식별을 사용하거나, 컨티그(서로 겹치는 DNA 세그먼트로 DNA의 합의 영역을 나타냄)에서 부분적으로 조립된 CRISPR 어레이의 직접 반복 서열과 공개된 유전체의 직접 반복 서열을 사용하여 개별 판독값에서 직접 반복 서열을 식별하는 방법을 사용하여 달성되었다.
10. Use by phages (파지에 의한 이용)
일부 세균은 파지 감염으로부터 방어하기 위해 염색체 섬을 가지며, 파지 유도 염색체 섬(PICI)은 파지 복제를 억제한다.[174] PICI는 특정 포도상구균 온화 파지에 의해 유도, 절단, 복제되고 최종적으로 작은 캡시드에 포장된다. PICI는 파지 복제를 차단하기 위해 여러 가지 메커니즘을 사용한다.[175]
한 연구에 따르면, ''콜레라균'' 혈청군 O1을 표적으로 하는 용균성 ICP1 파지는 ''V. cholerae'' PICI 유사 요소를 표적으로 하는 CRISPR-Cas 시스템을 획득했다. 이 시스템은 CRISPR 로커스 2개와 Cas 유전자 9개를 가지고 있다. 이것은 ''페스트균''에서 발견되는 I-F 시스템과 상동성이 있는 것으로 보인다. 세균 CRISPR-Cas 시스템과 마찬가지로, ICP1 CRISPR-Cas는 새로운 서열을 획득할 수 있으며, 이를 통해 파지와 숙주가 공진화할 수 있다.[177][178]
특정 고세균 바이러스는 스페이서 한두 개를 포함하는 미니 CRISPR 어레이를 가지고 있는 것으로 나타났다. 바이러스 매개 CRISPR 어레이 내의 스페이서는 다른 바이러스와 플라스미드를 표적으로 한다는 것이 밝혀졌으며, 이는 미니 CRISPR 어레이가 이형 감염 배제 메커니즘을 나타내고 바이러스 간 갈등에 참여한다는 것을 시사한다.[171]
11. Applications (응용)
CRISPR 유전자 편집은 살아있는 유기체의 DNA를 정확하고 표적에 맞게 수정할 수 있는 혁신적인 기술이다. 이 기술은 유전학, 의학,[179][180] 농업[181][182] 분야를 변화시키고 있다. 유전 질환에 대한 잠재적인 치료법을 제시하고, 작물 공학의 발전을 가져오며, 생명의 근본적인 작용에 대한 연구를 가능하게 한다.
CRISPR의 DNA 절단 기전은 유전자 공학적 응용에도 사용된다. 2012년, II형 CRISPR-Cas 시스템을 구성하는 Cas9이 RNA 의존성 DNA 핵산분해효소임을 밝혀졌다.[237] 이듬해에는 포유류 세포의 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 게놈 편집에 성공했다.[238] 오늘날에는 게놈 편집 기술 외에도 전사 조절, 이미징, 핵산 검출법 등 다양한 응용법이 연구되거나 실용화되고 있다.[192][193]
엠마뉘엘 샤르팡티에와 제니퍼 다우드나는 CRISPR-Cas9 시스템을 발표하여 기존보다 정확하고 사용하기 쉬운 게놈 편집 방법 개발을 평가받아 2020년 노벨 화학상을 수상했다.[194][195]
2015년에는 Cas12a(구명 Cpf1)가,[196] 2016년에는 RNA를 표적으로 하는 Cas13a(구명 C2c2)가 발견되었다.[197] Cas13은 RNA 유도형 RNA 엔도뉴클레아제이며, DNA는 절단하지 않고 단일 가닥 RNA(ssRNA)만을 절단한다. Cas13의 특징은 표적을 절단한 후에도 표적에 결합한 상태로 남아 다른 ssRNA를 무차별적으로 절단하는 것이다. 이러한 성질은 collateral cleavage라고 불리며, SHERLOCK법(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking, 한국어: 고감도 핵산 검출) 또는 Cas12a와 Cas13을 병용한 SHERLOCK v2[198]로 다양한 진단 기술 개발에 이용되고 있다.
이러한 진단 기술은 뎅기열 바이러스, 지카 바이러스 판별, 환자로부터 얻은 뎅기열 바이러스의 신속 검사, 무세포를 이용한 악성 종양의 DNA 변이 진단 등에 응용된다.[193][199] 나아가 Cas13의 특정 ssRNA 바이러스(인플루엔자 A 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 림프구성 뇌척수염 바이러스)에 대한 항바이러스 작용에 주목하여 CARVER(Cas13-assisted Restriction of Viral Expression and Readout)가 개발되었고, 항 ssRNA 바이러스제로의 응용 가능성도 제시되었다.[200]
COVID-19 팬데믹과 관련하여 Cas12a/Cas13 기반 진단 기술이 적용되었으며, Cas13a를 이용한 액체생검(리퀴드 바이옵시)을 통한 암 변이 유전자 특정 기술에 이어 2020년 3월에는 Cas13a를 이용한 SARS-CoV-2 검출 프로토콜이 발표되었다.[205] Cas13을 이용한 검사는 높은 정확도, 저렴한 비용, 신속성이 장점으로 제시되며, 기존 RT-PCR 검사법에 비해 우월하여 SARS-CoV-2 mRNA에 적용하는 것도 검토되고 있다.[206]
이화학연구소, 도쿄대학교, 교토대학교 연구팀은 SARS-CoV-2 유래 바이러스 RNA를 5분 이내에 신속하고 높은 특이도로 검출하는 COVID-19를 포함한 감염병의 초고감도 검사 기술을 개발했다.[207][208] 이는 SATORI법(CRISPR-based Amplification-free Digital RNA Detection)이며, 기존 PCR 검사보다 신속하고, 항원 검사보다 검출 감도와 특이도가 높다고 주장한다.[209][210][207]
도쿄대학교 의과학연구소 연구팀은 1형 Cas3을 이용한 CONAN법(Cas3-operated Nucleic Acid Detection)이라는 COVID-19 검사법을 발표했으며, 40분 이내의 신속한 검사가 가능하고, Cas12나 rRT-PCR을 이용한 검사와 비슷한 속도와 감도이며, 특이도는 더 높고 저렴하며 숙련된 검사 인력이나 장비가 필요 없고, SARS-CoV-2 외에도 A형 인플루엔자 바이러스 검사 등에도 응용 가능하다고 주장한다.[211][212][213]
미국 식품의약국(FDA)으로부터 실제 코로나바이러스 진단제로 긴급 사용 승인(EUA)을 받은 것도 있으며, SHERLOCK법을 이용한 "CRISPR SARS-CoV-2 키트"와 DETECTR법을 이용한 "SARS-CoV-2 DETECTR Reagent Kit"가 승인되었다.[214][215][216][217][218][219]
CRISPR/Cas 시스템은 다음과 같은 다양한 분야에 응용되고 있다.[235]
참조
[1]
논문
Crystal structure of a CRISPR RNA–guided surveillance complex bound to a ssDNA target
[2]
논문
The CRISPR-Cas immune system: Biology, mechanisms and applications
2015-10-01
[3]
논문
The roles of CRISPR-Cas systems in adaptive immunity and beyond
[4]
논문
What is CRISPR/Cas9?
2016-08-01
[5]
논문
CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes
2007-03-01
[6]
논문
CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA
2008-12-01
[7]
논문
The Biology of CRISPR-Cas: Backward and Forward
2018-03-01
[8]
논문
CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea
2010-01-01
[9]
논문
Gene Editing on Center Stage
2018-08-01
[10]
논문
CRISPR/Cas9 for genome editing: progress, implications and challenges
[11]
웹사이트
CRISPR-CAS9, TALENS and ZFNS – the battle in gene editing
https://www.ptglab.c[...]
[12]
웹사이트
Press release: The Nobel Prize in Chemistry 2020
https://www.nobelpri[...]
Nobel Foundation
2020-10-07
[13]
뉴스
Nobel Prize in Chemistry Awarded to 2 Scientists for Work on Genome Editing – Emmanuelle Charpentier and Jennifer A. Doudna developed the Crispr tool, which can alter the DNA of animals, plants and microorganisms with high precision.
https://www.nytimes.[...]
2020-10-07
[14]
논문
Cysteine proteases: Battling pathogenic parasitic protozoans with omnipresent enzymes
2021-08-01
[15]
논문
Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product
1987-12-01
[16]
논문
Comparison of various repetitive DNA elements as genetic markers for strain differentiation and epidemiology of Mycobacterium tuberculosis
1993-08-01
[17]
논문
Nature of DNA polymorphism in the direct repeat cluster of Mycobacterium tuberculosis; application for strain differentiation by a novel typing method
1993-12-01
[18]
논문
On the Origin of CRISPR-Cas Technology: From Prokaryotes to Mammals
[19]
논문
The discovery of CRISPR in archaea and bacteria
[20]
논문
Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria
2000-04-01
[21]
서적
The Code Breaker: Jennifer Doudna, Gene Editing, and the Future of the Human Race
https://books.google[...]
Simon & Schuster
2021-10-20
[22]
서적
CRISPR-Cas Systems: RNA-mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea
Springer
2013-01-01
[23]
논문
Identification of 86 candidates for small non-messenger RNAs from the archaeon Archaeoglobus fulgidus
2002-05-01
[24]
논문
Biogenesis pathways of RNA guides in archaeal and bacterial CRISPR-Cas adaptive immunity
2015-05-01
[25]
논문
Dairy lactococcal and streptococcal phage-host interactions: an industrial perspective in an evolving phage landscape
2020-11-01
[26]
뉴스
The WIRED Guide to Crispr
https://www.wired.co[...]
Condé Nast
2020-08-01
[27]
논문
Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes
2002-03-01
[28]
논문
CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea
2010-01-01
[29]
논문
CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea
2010-03-01
[30]
논문
The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats
2007-05-01
[31]
논문
CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies
2005-03-01
[32]
논문
Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements
2005-02-01
[33]
논문
Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin
2005-08-01
[34]
논문
What history tells us XXXVII. CRISPR-Cas: The discovery of an immune system in prokaryotes
2015-06-01
[35]
논문
The Heroes of CRISPR
2016-01-01
[36]
논문
A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action
2006-03-00
[37]
논문
The CRISPR craze
2013-08-00
[38]
논문
Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes
2008-08-00
[39]
논문
The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA
2010-11-00
[40]
논문
CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III
2011-03-00
[41]
논문
Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines
2015-11-00
[42]
논문
A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity
2012-08-00
[43]
논문
Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering
2014-06-00
[44]
논문
Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems
2013-02-00
[45]
논문
RNA-guided human genome engineering via Cas9
2013-02-00
[46]
논문
Genome engineering in ''Saccharomyces cerevisiae'' using CRISPR-Cas systems
2013-04-00
[47]
논문
Construction of a quadruple auxotrophic mutant of an industrial polyploid ''saccharomyces cerevisiae'' strain by using RNA-guided Cas9 nuclease
2014-12-00
[48]
논문
Metabolic Engineering of Probiotic ''Saccharomyces boulardii''
2016-04-00
[49]
논문
''Candida albicans'' CRISPR system permits genetic engineering of essential genes and gene families
2015-00-00
[50]
논문
''Candida albicans'' by Increased Single Guide RNA Expression
[51]
논문
Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system
2013-03-00
[52]
논문
Genome engineering of ''Drosophila'' with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease
2013-08-00
[53]
논문
Highly efficient targeted mutagenesis of ''Drosophila'' with the CRISPR/Cas9 system
2013-07-00
[54]
논문
An Engineered orco Mutation Produces Aberrant Social Behavior and Defective Neural Development in Ants
2017-08-00
[55]
논문
orco Mutagenesis Causes Loss of Antennal Lobe Glomeruli and Impaired Social Behavior in Ants
2017-08-00
[56]
논문
Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti
2015-04-00
[57]
논문
Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system
2013-08-00
[58]
논문
Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice
2013-11-00
[59]
논문
One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering
2013-05-00
[60]
논문
Deubiquitinase function of A20 maintains and repairs endothelial barrier after lung vascular injury
2018-05-00
[61]
논문
Targeted genome editing in primate embryos
2015-07-00
[62]
논문
Biotechnology. A prudent path forward for genomic engineering and germline gene modification
2015-04-00
[63]
논문
CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression
2013-11-00
[64]
논문
CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes
2015-05-00
[65]
논문
CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria
2017-09-00
[66]
논문
Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system
2015-10-00
[67]
논문
The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA
2016-04-00
[68]
논문
CRISPR/Cpf1-mediated DNA-free plant genome editing
2017-02-00
[69]
웹사이트
Cpf1 Nuclease
https://www.abmgood.[...]
2017-12-14
[70]
논문
CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity
2018-04-00
[71]
논문
CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2
2020-07-01
[72]
논문
Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection
2020-09-01
[73]
논문
C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector
2016-08-01
[74]
논문
Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2
2017-04-01
[75]
논문
Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6
2018-04-01
[76]
논문
SPRINT: a Cas13a-based platform for detection of small molecules
2020-09-01
[77]
논문
A Novel Miniature CRISPR-Cas13 System for SARS-CoV-2 Diagnostics
2021-10-01
[78]
논문
CRISPR-Cas: biology, mechanisms and relevance
2016-11-01
[79]
논문
CRISPR-Cas systems: Prokaryotes upgrade to adaptive immunity
2014-04-01
[80]
논문
Origins and evolution of CRISPR-Cas systems
2019-05-01
[81]
논문
Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering
2016-01-01
[82]
논문
Evolutionary classification of CRISPR–Cas systems: a burst of class 2 and derived variants
2019-12-01
[83]
논문
An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems
2015-11-01
[84]
논문
RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea
2012-02-01
[85]
논문
A novel interference mechanism by a type IIIB CRISPR-Cmr module in Sulfolobus
2013-03-01
[86]
논문
Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system
2011-04-01
[87]
논문
Structures of CRISPR Cas3 offer mechanistic insights into Cascade-activated DNA unwinding and degradation
2014-09-01
[88]
논문
A complex of Cas proteins 5, 6, and 7 is required for the biogenesis and stability of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (crispr)-derived rnas (crrnas) in Haloferax volcanii
2014-03-01
[89]
논문
Classification and evolution of type II CRISPR-Cas systems
2014-06-01
[90]
논문
Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems
2011-07-01
[91]
논문
Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants
2020-02-01
[92]
논문
Genetic Dissection of the Type III-A CRISPR-Cas System Csm Complex Reveals Roles of Individual Subunits
2019-03-01
[93]
논문
Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria
2012-09-01
[94]
논문
Cas9 specifies functional viral targets during CRISPR-Cas adaptation
2015-03-01
[95]
논문
Crystal structure of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated Csn2 protein revealed Ca2+-dependent double-stranded DNA binding activity
2011-09-01
[96]
논문
The Cas4-Cas1-Cas2 complex mediates precise prespacer processing during CRISPR adaptation
2019-04-01
[97]
논문
The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems
2013-05-01
[98]
논문
SnapShot: Class 2 CRISPR-Cas Systems
2017-01-01
[99]
논문
CRISPR-Cas12a: Functional overview and applications
2020-02-01
[100]
논문
RNA editing with CRISPR-Cas13
2017-11-01
[101]
논문
Programmable RNA editing with compact CRISPR-Cas13 systems from uncultivated microbes
2021-05-01
[102]
논문
CRISPR/Cas: From Tumor Gene Editing to T Cell-Based Immunotherapy of Cancer
2020-01-01
[103]
논문
CRISPR-Cas immunity in prokaryotes
2015-10-01
[104]
논문
RNA-based viral immunity initiated by the Dicer family of host immune receptors
2009-01-01
[105]
논문
High-resolution transcriptome maps reveal strain-specific regulatory features of multiple Campylobacter jejuni isolates
2013-05-01
[106]
논문
Mature clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats RNA (crRNA) length is measured by a ruler mechanism anchored at the precursor processing site
2011-12-01
[107]
논문
Proteins and DNA elements essential for the CRISPR adaptation process in ''Escherichia coli''
2012-07-01
[108]
논문
CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition
[109]
논문
A dual function of the CRISPR-Cas system in bacterial antivirus immunity and DNA repair
2011-01-01
[110]
논문
SSO1450—a CAS1 protein from Sulfolobus solfataricus P2 with high affinity for RNA and DNA
2009-06-01
[111]
논문
Structural basis for DNase activity of a conserved protein implicated in CRISPR-mediated genome defense
2009-06-01
[112]
논문
A novel family of sequence-specific endoribonucleases associated with the clustered regularly interspaced short palindromic repeats
2008-07-01
[113]
논문
Structure of a CRISPR-associated protein Cas2 from Desulfovibrio vulgaris
2010-12-01
[114]
논문
Double-stranded endonuclease activity in Bacillus halodurans clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated Cas2 protein
2012-10-01
[115]
논문
Cas1-Cas2 complex formation mediates spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity
2014-06-01
[116]
논문
Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity
2015-03-01
[117]
논문
Structural and Mechanistic Basis of PAM-Dependent Spacer Acquisition in CRISPR-Cas Systems
2015-11-01
[118]
논문
Foreign DNA capture during CRISPR-Cas adaptive immunity
2015-11-01
[119]
논문
CRISPR-mediated adaptive immune systems in bacteria and archaea
[120]
논문
CRISPR Immunological Memory Requires a Host Factor for Specificity
2016-06-01
[121]
논문
Spacer capture and integration by a type I-F Cas1-Cas2–3 CRISPR adaptation complex
2017-06-01
[122]
논문
Prespacer processing and specific integration in a Type I-A CRISPR system
2018-02-01
[123]
논문
Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in ''Streptococcus thermophilus''
2008-02-01
[124]
논문
Phage response to CRISPR-encoded resistance in ''Streptococcus thermophilus''
2008-02-01
[125]
논문
Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system
2009-03-01
[126]
논문
CRISPR families of the crenarchaeal genus Sulfolobus: bidirectional transcription and dynamic properties
2009-04-01
[127]
논문
Distribution of CRISPR spacer matches in viruses and plasmids of crenarchaeal acidothermophiles and implications for their inhibitory mechanism
2009-02-01
[128]
논문
CRISPR-spacer integration reporter plasmids reveal distinct genuine acquisition specificities among CRISPR-Cas I-E variants of ''Escherichia coli''
2013-05-01
[129]
논문
Selective and hyperactive uptake of foreign DNA by adaptive immune systems of an archaeon via two distinct mechanisms
2012-09-01
[130]
논문
Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity
2013-05-01
[131]
논문
Rapidly evolving CRISPRs implicated in acquired resistance of microorganisms to viruses
2008-01-01
[132]
논문
Virus population dynamics and acquired virus resistance in natural microbial communities
2008-05-01
[133]
논문
Analysis of streptococcal CRISPRs from human saliva reveals substantial sequence diversity within and between subjects over time
2011-01-01
[134]
논문
Experimental definition of a clustered regularly interspaced short palindromic duplicon in ''Escherichia coli''
2012-10-01
[135]
논문
Molecular memory of prior infections activates the CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system
2012-07-01
[136]
논문
Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway
2011-06-01
[137]
논문
An RNA-induced conformational change required for CRISPR RNA cleavage by the endoribonuclease Cse3
2011-06-01
[138]
논문
Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease
2010-09-01
[139]
논문
Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats
[140]
논문
Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes
2008-12-01
[141]
논문
Interaction of the Cas6 riboendonuclease with CRISPR RNAs: recognition and cleavage
2011-02-01
[142]
논문
Evolution of CRISPR RNA recognition and processing by Cas6 endonucleases
2014-01-01
[143]
논문
Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence
2011-06-01
[144]
논문
Dynamic properties of the Sulfolobus CRISPR/Cas and CRISPR/Cmr systems when challenged with vector-borne viral and plasmid genes and protospacers
2011-01-01
[145]
논문
In vivo activity of CRISPR-mediated virus defence in a hyperthermophilic archaeon
2011-04-01
[146]
논문
Structural basis for CRISPR RNA-guided DNA recognition by Cascade
2011-05-01
[147]
논문
Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system
2011-09-01
[148]
논문
Structure and mechanism of the CMR complex for CRISPR-mediated antiviral immunity
2012-02-01
[149]
논문
RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex
2009-11-01
[150]
논문
RNA-activated DNA cleavage by the Type III-B CRISPR–Cas effector complex
[151]
논문
Co-transcriptional DNA and RNA Cleavage during Type III CRISPR-Cas Immunity
[152]
논문
Self versus non-self discrimination during CRISPR RNA-directed immunity
2010-01-01
[153]
논문
Casposons: mobile genetic elements that gave rise to the CRISPR-Cas adaptation machinery
2017-08-01
[154]
논문
CRISPR-Cas: evolution of an RNA-based adaptive immunity system in prokaryotes
2013-05-01
[155]
논문
Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems
2017-06-01
[156]
논문
Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems
2017-03-01
[157]
논문
Probabilistic models for CRISPR spacer content evolution
2013-02-01
[158]
논문
Adaptation in CRISPR-Cas Systems
2016-03-01
[159]
논문
Is evolution Darwinian or/and Lamarckian?
2009-11-01
[160]
논문
Lamarckian Illusions
2015-10-01
[161]
논문
Just how Lamarckian is CRISPR-Cas immunity: the continuum of evolvability mechanisms
2016-02-01
[162]
논문
Germ warfare in a microbial mat community: CRISPRs provide insights into the co-evolution of host and viral genomes
[163]
논문
The small, slow and specialized CRISPR and anti-CRISPR of Escherichia and Salmonella
2010-06-01
[164]
논문
Diverse CRISPRs evolving in human microbiomes
[165]
논문
Phage mutations in response to CRISPR diversification in a bacterial population
2013-02-01
[166]
논문
Diversification of CRISPR within coexisting genotypes in a natural population of the bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa
2014-05-01
[167]
논문
CRISPR—a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea
2008-03-01
[168]
논문
Comparisons of clustered regularly interspaced short palindromic repeats and viromes in human saliva reveal bacterial adaptations to salivary viruses
2012-09-01
[169]
논문
Reassortment of CRISPR repeat-spacer loci in Sulfolobus islandicus
2013-11-01
[170]
논문
CRISPR associated diversity within a population of Sulfolobus islandicus
2010-09-01
[171]
논문
Virus-borne mini-CRISPR arrays are involved in interviral conflicts
2019-11-01
[172]
논문
Crass: identification and reconstruction of CRISPR from unassembled metagenomic data
2013-05-01
[173]
논문
CRISPR targeting reveals a reservoir of common phages associated with the human gut microbiome
2012-10-01
[174]
논문
The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria
2010-08-01
[175]
논문
Staphylococcal pathogenicity island interference with helper phage reproduction is a paradigm of molecular parasitism
2012-10-01
[176]
논문
Precisely modulated pathogenicity island interference with late phage gene transcription
2014-10-00
[177]
논문
A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity
2013-02-00
[178]
논문
Bacteriophage ICP1: A Persistent Predator of ''Vibrio cholerae''
2021-09-00
[179]
논문
CRISPR technology in human diseases
2024-08-00
[180]
논문
Harnessing the evolving CRISPR/Cas9 for precision oncology
2024-08-00
[181]
논문
CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering in Plants: Application and Prospectives
2024-07-00
[182]
논문
Harnessing the power of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) based microfluidics for next-generation molecular diagnostics
2024-08-00
[183]
논문
Ethical Issues Regarding CRISPR Mediated Genome Editing
2018-00-00
[184]
논문
Is It Ever Wise to Edit Wild-Type Alleles? Engineered CRISPR Alleles Versus Millions of Years of Human Evolution
2024-02-00
[185]
웹사이트
CRISPRdb
http://crispr.u-psud[...]
2010-06-19
[186]
논문
The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats
[187]
논문
CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes
[188]
논문
CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA
[189]
논문
Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product
[190]
논문
Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria
[191]
논문
Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes
[192]
논문
The CRISPR tool kit for genome editing and beyond
[193]
논문
Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2
[194]
웹사이트
ノーベル化学賞に米仏の女性2氏 ゲノム編集技術を開発：朝日新聞デジタル
https://www.asahi.co[...]
2021-11-06
[195]
웹사이트
2020年ノーベル化学賞、仏米の女性研究者2氏に ゲノム編集技術研究
https://www.afpbb.co[...]
2021-11-06
[196]
논문
Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System
https://www.scienced[...]
2015-10-22
[197]
논문
C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector
https://science.scie[...]
2016-08-05
[198]
웹사이트
CRISPRフリーのゲノム編集時代の幕開け ―ゲノム編集技術の展開―
https://www.mitsui.c[...]
三井物産戦略研究所
2020-11-00
[199]
논문
Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13
https://pubmed.ncbi.[...]
2018-04-27
[200]
논문
Programmable Inhibition and Detection of RNA Viruses Using Cas13
https://pubmed.ncbi.[...]
2019-12-05
[201]
웹사이트
【演題 4】バクテリオファージを用いた疾患治療法の開発
http://www.senri-lif[...]
公益財団法人千里ライフサイエンス振興財団
2021-11-07
[202]
웹사이트
狙った細菌を選択的に殺菌できる遺伝子標的型抗菌薬を創出―薬剤耐性菌問題の解決へ― 国立研究開発法人日本医療研究開発機構
https://www.amed.go.[...]
2021-11-06
[203]
논문
Development of CRISPR-Cas13a-based antimicrobials capable of sequence-specific killing of target bacteria
https://www.nature.c[...]
2020-06-10
[204]
논문
Phagemid-based capsid system for CRISPR-Cas13a antimicrobials targeting methicillin-resistant Staphylococcus aureus
https://www.nature.c[...]
2024-09-13
[205]
웹사이트
令和元年度学術研究動向等に関する調査研究 報告概要（医歯薬学専門調査班）
https://www.jsps.go.[...]
日本学術振興会
2021-11-07
[206]
논문
Development and application of sensitive, specific, and rapid CRISPR-Cas13-based diagnosis
https://pubmed.ncbi.[...]
2021-07-00
[207]
논문
Amplification-free RNA detection with CRISPR–Cas13
https://www.nature.c[...]
2021-04-19
[208]
웹사이트
新型コロナウイルスの超高感度・世界最速検出技術を開発
https://www.riken.jp[...]
2021-11-06
[209]
웹사이트
【新型コロナ】新型コロナウイルスを5分以内に検出 超高感度・世界最速で検出する革新的技術を開発 理研・東京大・京都大
https://dm-rg.net/ne[...]
2021-11-06
[210]
웹사이트
新型コロナウイルスの超高感度・世界最速検出技術を開発－汎用的な感染症診断技術としての応用展開に期待－
https://www.jst.go.j[...]
科学技術振興機構
2021-11-07
[211]
논문
Rapid and accurate detection of novel coronavirus SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas3
https://www.medrxiv.[...]
2020-06-02
[212]
웹사이트
東大医科研、国産ゲノム編集技術で迅速安価なコロナ検出法を開発
https://bio.nikkeibp[...]
2021-11-06
[213]
웹사이트
ゲノム編集治療とCRISPR診断薬の開発研究
https://fnkprddata.b[...]
フナコシ株式会社
2021-11-07
[214]
웹사이트
米Sherlock社、ゲノム編集技術用いた新型コロナの診断薬が緊急使用許可
https://bio.nikkeibp[...]
2021-11-06
[215]
웹사이트
米Mammoth社と英GSK社、CRISPR技術用いた新型コロナの迅速診断検査を共同開発
https://bio.nikkeibp[...]
2021-11-06
[216]
웹사이트
SARS-CoV-2 DETECTR Reagent Kit - Letter of Authorization
https://www.fda.gov/[...]
FDA
2020-08-31
[217]
웹사이트
ACCELERATED EMERGENCY USE AUTHORIZATION (EUA) SUMMARY
https://www.fda.gov/[...]
FDA
2021-11-07
[218]
웹사이트
FDA Grants EUAs for MiraDx, Mammoth Biosciences, BayCare Laboratories Molecular Coronavirus Tests
https://www.genomewe[...]
2020-09-02
[219]
웹사이트
FDA Grants EUAs for Mammoth Biosciences Coronavirus Tests
https://ipira.berkel[...]
2021-11-06
[220]
논문
CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea
[221]
논문
CRISPR-Casシステムの構造と機能
https://doi.org/10.2[...]
2014
[222]
논문
A Guild of 45 CRISPR-Associated (Cas) Protein Families and Multiple CRISPR/Cas Subtypes Exist in Prokaryotic Genomes
[223]
논문
Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats
[224]
논문
Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements
[225]
논문
Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin
[226]
논문
CRISPR elements in ''Yersinia pestis'' acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies
[227]
논문
Self-targeting by CRISPR: gene regulation or autoimmunity?
[228]
논문
Rapidly evolving CRISPRs implicated in acquired resistance of microorganisms to viruses
[229]
논문
Evolution and classification of the CRISPR–Cas systems
http://www.nature.co[...]
2011-06
[230]
논문
CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea
[231]
논문
A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action
[232]
논문
Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes
[233]
논문
A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence
[234]
논문
Is evolution Darwinian or/and Lamarckian?
[235]
논문
CRISPR--a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea
[236]
웹사이트
TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いた効率的な遺伝子改変ラットの作製技術
http://www.kyoto-u.a[...]
2013-06-29
[237]
논문
A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity
[238]
논문
Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.
[239]
논문
RNA-guided human genome engineering via Cas9.
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