코스미드
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1. 개요
코스미드는 세균의 복제 기점, 항생제 선택 마커, 클로닝 부위를 갖춘 플라스미드에 박테리오파지 람다에서 유래된 cos 부위를 추가한 벡터이다. 코스미드는 다양한 숙주 범위, 셔틀 코스미드, 포유류 코스미드 등으로 활용되며, 일반적으로 40~45kb의 DNA를 클로닝할 수 있다. 클로닝은 두 개의 벡터 암을 생성하여 외래 DNA와 연결하는 방식으로 진행되며, ''in vitro'' 패키징 기술을 통해 대장균 숙주로 옮겨진다.
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| 코스미드 | |
|---|---|
| 코스미드 정보 | |
| 유형 | 하이브리드 플라스미드 |
| 설명 | 생체외 패키징 박테리오파지 입자 |
| 특징 | 플라스미드와 박테리오파지 람다의 cos 부위 함유 큰 DNA 조각 클로닝 가능 |
2. Cos 서열
''Cos'' 염기서열은 약 200개의 염기쌍 길이이며 패키징에 필수적이다. 이 서열에는 ''cosN'', ''cosB'', ''cosQ'' 부위가 있다. 구르기 원형 복제가 종종 선형 컨카테머를 생성하므로 다음 코스미드의 ''cosQ'' 부위는 이전 코스미드가 패키징된 후 터미네이스에 의해 유지되어 세포 DNase에 의한 분해를 방지한다.
2. 1. CosN 부위
''Cos'' 염기서열은 약 200개의 염기쌍 길이이며 패키징에 필수적이다. 이 서열에는 DNA가 각 가닥에서 12bp 간격으로 터미네이스에 의해 절단되는 ''cosN'' 부위가 포함되어 있다. 이로 인해 원형 코스미드가 12bp의 두 개의 "점착성" 또는 "끈적한 말단"으로 선형화된다. (DNA는 파지 헤드에 맞게 선형이어야 한다.)[1]2. 2. CosB 부위
''Cos'' 염기서열은 약 200개의 염기쌍 길이이며 패키징에 필수적이다. ''cosB'' 부위는 터미네이스가 가닥을 절단하고 분리하는 동안 터미네이스를 유지한다.[1]2. 3. CosQ 부위
''Cos'' 염기서열은 약 200개의 염기쌍 길이이며 패키징에 필수적이다. 이 서열에는 DNA가 각 가닥에서 12bp 간격으로 터미네이스에 의해 절단되는 ''cosN'' 부위가 포함되어 있다. 이로 인해 원형 코스미드가 12bp의 두 개의 "점착성" 또는 "끈적한 말단"으로 선형화된다. (DNA는 파지 헤드에 맞게 선형이어야 한다.) ''cosB'' 부위는 터미네이스가 가닥을 절단하고 분리하는 동안 터미네이스를 유지한다. 구르기 원형 복제가 종종 선형 컨카테머를 생성하므로, 다음 코스미드의 ''cosQ'' 부위는 이전 코스미드가 패키징된 후 터미네이스에 의해 유지되어 세포 DNase에 의한 분해를 방지한다.3. 코스미드의 특징 및 활용
코스미드는 클로닝 절차를 거쳐 두 개의 벡터 암을 생성하고 외래 DNA와 연결된다. 야생형 코스미드 DNA는 크기 배제를 통해 선택되므로, 코스미드는 항상 플라크가 아닌 콜로니를 형성한다. 또한, 리게이션된 DNA 1 μg당 약 105 ~ 106 CFU로 클론 밀도가 낮다.[1]
재조합 람다 또는 코스미드 라이브러리를 구축한 후에는 ''인 비트로''(in vitro) 패키징 기술을 통해 총 DNA를 ''대장균'' 숙주로 옮긴다. 패키징 추출물은 ''대장균'' cI857 용원체에서 추출되며, 재조합 분자를 ''인 비트로''에서 인식하고 패키징하여 성숙한 파지 입자나 파지 껍질에 포함된 재조합 플라스미드를 생성한다. 람다 대체 벡터는 감염 빈도가 높아 로딩 용량이 낮은 점을 보완하며, 파지 라이브러리는 코스미드 라이브러리보다 저장 및 스크리닝이 용이하다.[1]
클로닝할 유전체 DNA는 적절한 크기의 제한 효소 절편으로 절단해야 한다. 이는 부분적인 제한 효소 절단 후 크기 분획 또는 탈인산화(송아지 소장 인산분해효소를 사용)를 통해 수행하여, 물리적으로 연결되지 않은 절편의 연결, 즉 염색체 스크램블링을 방지한다.[1]
3. 1. 코스미드의 구조
코스미드는 주로 세균의 ''oriV''(복제 기점), 항생제 선택 마커 및 클로닝 부위를 갖춘 플라스미드이지만, 박테리오파지 람다에서 유래된 하나 이상의, 또는 최근에는 두 개의 cos 부위를 가지고 있다.[1] 실험의 특정 목표에 따라 광범위한 숙주 범위를 갖는 코스미드, 셔틀 코스미드 또는 '포유류' 코스미드(SV40 oriV 및 포유류 선택 마커에 연결됨)를 사용할 수 있다.[1] 코스미드의 로딩 용량은 벡터 자체의 크기에 따라 다르지만 일반적으로 40~45kb 정도이다.[1]
3. 2. 다양한 종류의 코스미드
코스미드는 주로 세균의 ''oriV''(복제 기점), 항생제 선택 마커 및 클로닝 부위를 갖춘 플라스미드이지만, 박테리오파지 람다에서 유래된 하나 이상, 또는 최근에는 두 개의 cos 부위를 가지고 있다. 실험의 특정 목표에 따라 광범위한 숙주 범위를 갖는 코스미드, 셔틀 코스미드 또는 '포유류' 코스미드(SV40 oriV 및 포유류 선택 마커에 연결됨)를 사용할 수 있다. 코스미드의 로딩 용량은 벡터 자체의 크기에 따라 다르지만 일반적으로 40kb~45kb 정도이다. 클로닝 절차는 두 개의 벡터 암을 생성한 다음 이들을 외래 DNA에 연결하는 방식으로 진행된다. 야생형 코스미드 DNA에 대한 선택은 크기 배제를 통해 간단하게 수행된다. 따라서 코스미드는 항상 플라크가 아닌 콜로니를 형성한다. 또한, 리게이션된 DNA 1 μg당 약 105 ~ 106 CFU로 클론 밀도가 훨씬 낮다.
재조합 람다 또는 코스미드 라이브러리를 구축한 후, 총 DNA는 ''in vitro'' 패키징이라는 기술을 통해 적절한 ''대장균'' 숙주로 옮겨진다. 필요한 패키징 추출물은 ''대장균'' cI857 용원체(각각 red- gam- Sam 및 Dam (헤드 조립) 및 Eam (테일 조립))에서 추출된다. 이 추출물은 재조합 분자를 ''in vitro''에서 인식하고 패키징하여 성숙한 파지 입자(람다 기반 벡터) 또는 파지 껍질에 포함된 재조합 플라스미드(코스미드)를 생성한다. 이러한 차이는 람다 대체 벡터를 선호하는 감염 빈도의 차이로 나타난다. 이는 로딩 용량이 약간 낮은 점을 보완한다. 파지 라이브러리는 또한 코스미드 라이브러리보다 더 쉽게 저장하고 스크리닝할 수 있다.
타겟 DNA: 클로닝할 유전체 DNA는 적절한 크기 범위의 제한 효소 절편으로 절단해야 한다. 이는 일반적으로 부분적인 제한 효소 절단 후 크기 분획 또는 탈인산화(송아지 소장 인산분해효소 사용)를 통해 수행하여 염색체 스크램블링, 즉 물리적으로 연결되지 않은 절편의 연결을 방지한다.
3. 3. 클로닝 용량
코스미드는 주로 세균의 ''oriV''(복제 기점), 항생제 선택 마커 및 클로닝 부위를 갖춘 플라스미드이지만, 박테리오파지 람다에서 유래된 하나 이상의, 또는 최근에는 두 개의 cos 부위를 가지고 있다.[1] 실험의 특정 목표에 따라 광범위한 숙주 범위를 갖는 코스미드, 셔틀 코스미드 또는 '포유류' 코스미드(SV40 oriV 및 포유류 선택 마커에 연결됨)를 사용할 수 있다.[1] 코스미드의 로딩 용량은 벡터 자체의 크기에 따라 다르지만 일반적으로 40~45kb 정도이다.[1] 클로닝 절차는 두 개의 벡터 암을 생성한 다음 이들을 외래 DNA에 연결하는 방식으로 진행된다.[1] 야생형 코스미드 DNA에 대한 선택은 크기 배제를 통해 간단하게 수행된다.[1] 따라서 코스미드는 항상 플라크가 아닌 콜로니를 형성한다.[1] 또한, 리게이션된 DNA 1μg당 약 105 ~ 106 CFU로 클론 밀도가 훨씬 낮다.[1]3. 4. 클로닝 과정
코스미드는 주로 세균의 ''oriV''(복제 기점), 항생제 선택 마커 및 클로닝 부위를 갖춘 플라스미드이지만, 박테리오파지 람다에서 유래된 하나 이상의, 또는 최근에는 두 개의 cos 부위를 가지고 있다.[1] 실험의 특정 목표에 따라 광범위한 숙주 범위를 갖는 코스미드, 셔틀 코스미드 또는 '포유류' 코스미드(SV40 oriV 및 포유류 선택 마커에 연결됨)를 사용할 수 있다.[1] 코스미드의 로딩 용량은 벡터 자체의 크기에 따라 다르지만 일반적으로 40~45kb 정도이다.[1]클로닝 절차는 두 개의 벡터 암을 생성한 다음 이들을 외래 DNA에 연결하는 방식으로 진행된다.[1] 야생형 코스미드 DNA에 대한 선택은 크기 배제를 통해 간단하게 수행된다.[1] 따라서 코스미드는 항상 플라크가 아닌 콜로니를 형성한다.[1] 또한, 리게이션된 DNA 1μg당 약 105 ~ 106 CFU로 클론 밀도가 훨씬 낮다.[1]
재조합 람다 또는 코스미드 라이브러리를 구축한 후, 총 DNA는 ''in vitro'' 패키징이라는 기술을 통해 적절한 ''대장균'' 숙주로 옮겨진다.[1] 필요한 패키징 추출물은 ''대장균'' cI857 용원체(각각 red- gam- Sam 및 Dam (헤드 조립) 및 Eam (테일 조립))에서 추출된다.[1] 이 추출물은 재조합 분자를 ''in vitro''에서 인식하고 패키징하여 성숙한 파지 입자(람다 기반 벡터) 또는 파지 껍질에 포함된 재조합 플라스미드(코스미드)를 생성한다.[1] 이러한 차이는 람다 대체 벡터를 선호하는 감염 빈도의 차이로 나타난다.[1] 이는 로딩 용량이 약간 낮은 점을 보완한다.[1] 파지 라이브러리는 또한 코스미드 라이브러리보다 더 쉽게 저장하고 스크리닝할 수 있다.[1]
타겟 DNA: 클로닝할 유전체 DNA는 적절한 크기 범위의 제한 효소 절편으로 절단해야 한다.[1] 이는 일반적으로 부분적인 제한 효소 절단 후 크기 분획 또는 탈인산화(송아지 소장 인산분해효소 사용)를 통해 수행하여 염색체 스크램블링, 즉 물리적으로 연결되지 않은 절편의 연결을 방지한다.[1]
3. 5. In vitro 패키징
재조합 람다 또는 코스미드 라이브러리를 구축한 후, 총 DNA는 ''in vitro'' 패키징이라는 기술을 통해 적절한 ''대장균'' 숙주로 옮겨진다. 필요한 패키징 추출물은 ''대장균'' cI857 용원체(각각 red- gam- Sam 및 Dam (헤드 조립) 및 Eam (테일 조립))에서 추출된다.[1] 이 추출물은 재조합 분자를 ''in vitro''에서 인식하고 패키징하여 성숙한 파지 입자(람다 기반 벡터) 또는 파지 껍질에 포함된 재조합 플라스미드(코스미드)를 생성한다. 이러한 차이는 람다 대체 벡터를 선호하는 감염 빈도의 차이로 나타나며, 이는 로딩 용량이 약간 낮은 점을 보완한다. 파지 라이브러리는 코스미드 라이브러리보다 더 쉽게 저장하고 스크리닝할 수 있다.[1]타겟 DNA: 클로닝할 유전체 DNA는 적절한 크기 범위의 제한 효소 절편으로 절단해야 한다. 이는 일반적으로 부분적인 제한 효소 절단 후 크기 분획 또는 탈인산화(송아지 소장 인산분해효소 사용)를 통해 수행하여 염색체 스크램블링, 즉 물리적으로 연결되지 않은 절편의 연결을 방지한다.[1]
3. 6. 타겟 DNA 준비
클로닝할 유전체 DNA는 적절한 크기 범위의 제한 효소 절편으로 절단해야 한다. 이는 일반적으로 부분적인 제한 효소 절단 후 크기 분획 또는 탈인산화(송아지 소장 인산분해효소를 사용)를 통해 수행하여 염색체 스크램블링, 즉 물리적으로 연결되지 않은 절편의 연결을 방지한다.[1]4. 대표적인 코스미드 벡터
가장 흔하게 사용되는 벡터로는 "SuperCos 1"이 있다.
참조
[1]
논문
Packaging recombinant DNA molecules into bacteriophage particles in vitro
1977-08
[2]
논문
Cosmids: a type of plasmid gene-cloning vector that is packageable in vitro in bacteriophage lambda heads
1978-09
[3]
웹사이트
Cosmids
http://www.ndsu.edu/[...]
Phillip McClean
2014-04-04
[4]
논문
Instability of palindromic DNA in Escherichia coli
1981
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