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고성능 액체 크로마토그래피

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목차

1. 개요

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 고정상 충진제와 장치 개선을 통해 고속, 고성능 분리가 가능해진 크로마토그래피 기술이다. 고압으로 용액을 보내야 하므로 고압 액체 크로마토그래피라고도 불리며, 분리 속도가 빨라 고속 액체 크로마토그래피라고도 한다. 분석물 주입부터 검출 및 정량까지 자동화하여 재현성 높은 분석을 수행한다. 분석화학, 생화학 분야에서 널리 사용되며, 각 물질이 날카로운 피크로 검출되어 분리 및 검출 능력이 향상된다. 이동상으로는 물, 알코올, 아세토니트릴 등 다양한 용매가 사용되며, 용매 조성에 기울기를 주는 그래디언트 분석과 일정한 조성을 유지하는 아이소크라틱 분석이 있다. HPLC는 분배, 정상, 역상, 크기 배제, 이온 교환, 생체 친화성, 수성 정상 크로마토그래피 등 다양한 종류가 있으며, 제약, 불법 약물 탐지, 연구, 의료 분야 등 폭넓게 활용된다.

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고성능 액체 크로마토그래피
개요
고성능 액체 크로마토그래피의 모식도.
고성능 액체 크로마토그래피의 모식도
유형액체 크로마토그래피
분석 유형분리
검출UV-Vis,
형광,
전기화학,
질량 분석,
굴절률
관련 기법기체 크로마토그래피
초고성능 액체 크로마토그래피
고성능 액체 크로마토그래피
작동 원리
작동 원리고압 하에서 액체 이동상을 사용하여 분석물을 분리하는 크로마토그래피 기술
고정상실리카
고분자 모노리스 컬럼
이동상용매 혼합물
응용 분야
응용 분야제약
환경 모니터링
식품 화학
법의학
임상 진단
추가 정보
추가 정보다양한 검출 방법과 결합 가능 (MS, UV, 등)
분석 물질의 분리 및 정량화에 사용

2. 정의

HPLC


고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)는 컬럼에 채우는 고정상 충진제와 장치의 개선 및 개량을 통해 고속, 고성능 분리가 가능해진 크로마토그래피이다.[97] 충진제를 미세하고 입도가 고른 형태로 만들어 분리 능력을 높였기 때문에 흐름에 대한 저항이 커져, 분리할 용액을 고압으로 보내야 한다. 그래서 '고압 액체 크로마토그래피(high pressure liquid chromatography)'라고도 불린다. 분리 속도가 빠르기 때문에 '고속 액체 크로마토그래피(high speed liquid chromatography)'라고도 한다.

HPLC의 이동상으로는 컬럼이나 장치에 악영향을 주지 않는 범위 내에서 다양한 용매가 사용된다. 물, 염류 수용액, 알코올류, 아세토니트릴, 디클로로메탄, 트리플루오로아세트산 등이 사용되며, 서로 섞이는 용매들을 혼합하여 사용하는 경우가 많다. 용매 조성에 기울기를 주어 (즉, 조성을 연속적으로 변화시켜) 용출을 하는 경우도 많은데, 이를 '''그래디언트 분석'''이라고 한다. 예를 들어, 역상 크로마토그래피에서 물/메탄올 기울기를 사용하는 경우, 먼저 메탄올이 적은 조건에서 극성이 높은 물질이 용출되고, 이후 메탄올 비율을 높여감에 따라 극성이 낮은 물질이 순차적으로 용출된다. 반면, 일정한 조성의 용매로 분석물을 용출시키는 분석법은 '''아이소크라틱 분석'''이라고 한다.

2. 1. 크로마토그래피의 원리

크로마토그래피는 적절한 정지상과 이동상을 사용하여 시료들이 섞여 있는 혼합물을 이동 속도 차이를 이용하여 분리하는 방법이다.[98] 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 이론은 기본적으로 일반적인 크로마토그래피 이론과 동일하다.[41]

종이 크로마토그래피 분리의 유지 인자 계산과 유사하게, HPLC는 혼합물을 크로마토그램에서 피크(밴드)로 감지되는 둘 이상의 성분으로 얼마나 잘 분리하는지 설명한다. HPLC 매개변수는 효율 인자(''N''), 유지 인자(카파 프라임), 분리 인자(알파)이다. 이러한 인자는 함께 분해능 방정식의 변수이며, 두 성분 피크가 얼마나 잘 분리되거나 서로 겹치는지 설명한다.

  • '''유지 인자'''(k'): 정규화된 무차원 단위로, 용량비의 실험적 측정값이다. tR은 특정 성분의 유지 시간이고, t0은 비유지 물질이 유지 없이 시스템을 통해 용출되는 데 걸리는 시간으로, 공극 시간이라고 한다.
  • '''선택성 인자'''(α): 크로마토그램에서 인접한 두 피크의 유지 인자 k'의 비율은 두 피크 사이의 분리 정도를 평가하는 데 사용된다.
  • '''피크 용량'''(Pc): 시스템 효율성의 척도로, 등용매 조건이 아닌 구배 조건에서 사용된다.[43] 특정 분해능 인자에 대해 유지 창 내에서 분리할 수 있는 피크의 수이다.


크로마토그래피 시스템의 성능 범위를 결정하는 정량적 매개변수 및 방정식


매개변수는 주로 플레이트 이론(부분 분배 크로마토그래피)과 크로마토그래피 속도 이론/''반 데엠터 방정식''의 두 가지 크로마토그래피 이론에서 파생된다.

공극 부피는 용매가 차지하는 컬럼 내 공간의 양이다. 이는 컬럼의 내부 충전재 외부에 있는 컬럼 내 공간이다.

효율 인자(''N'')는 실제로 크로마토그램의 성분 피크가 얼마나 날카로운지를 피크의 가장 넓은 지점(기준선에서)에서의 폭에 대한 성분 피크의 면적("유지 시간")의 비율로 측정한다. 효율은 사용된 HPLC 컬럼과 HPLC 방법에 따라 크게 달라진다. 효율 인자는 플레이트 수, 즉 '이론 플레이트 수'와 동의어이다.

유지 인자(카파 프라임)는 혼합물의 성분이 컬럼에 얼마나 오랫동안 부착되었는지 크로마토그램에서 피크 아래 면적을 측정하여 측정한다(HPLC 크로마토그램은 시간의 함수이므로).

분리 인자(알파)는 혼합물의 인접한 두 성분이 얼마나 잘 분리되었는지에 대한 상대적인 비교이다. 분리 인자 값이 1.0보다 클수록 분리가 잘 되며, 약 2.0 이상이면 HPLC 방법이 분리에 필요하지 않을 수 있다.

2. 2. HPLC의 특징



칼럼에 채우는 고정상의 충진제 및 장치의 개선, 개량에 의해, 고속 고성능 분리가 가능해진 크로마토그래피이다.[97] 충진제를 미세하고도 입도가 고른 수형으로 하여 고도의 분리가 가능하기 때문에 흐름에 대한 저항이 높아져 분리할 용액을 고압으로 보낼 필요가 있다. 그래서 '고압 액체크로마토그래피(high pressure liquid chromatography)'라고 한다. 또한 분리가 빠르기 때문에 '고속 액체크로마토그래피(high speed liquid chromatography)'라고도 한다.

고속액체 크로마토그래피(HPLC)는 휘발성이 문제가 되지 않으므로 분자량이 큰 물질의 분석에도 사용될 수 있다.[101] 얼마 전까지만 해도 GC가 LC에 비하여 이동상의 차이 때문에 신속한 분석법이었으나, 근래에는 HPLC가 분리 능력이나 응용 범위 면에서 신속하고 정확한 방법으로 각광받고 있다.

  • GC의 경우 일반적인 사용 온도 범위(약 350°C) 이하에서 기화되지 않는 비휘발성 물질이며 열변성이나 열분해를 쉽게 받는 시료는 일반적으로 직접 분리할 수 없다. 하지만 HPLC는 시료가 상온에서 용해 불가능하여 가온할 필요가 없는 경우를 제외하면 온도와 관계없이 용매에 용해되는 시료는 모두 분리 가능하다.

  • 요약: 이동상 속도 GC > LC / 분리 능력, 응용 범위 GC < LC


기계적으로 높은 압력을 가하여 이동상 용매를 고유속으로 칼럼에 통과시켜 분석물이 고정상에 머무는 시간을 단축시켜 분리능과 검출 감도를 높이는 것을 특징으로 한다.

현재는 분석물 주입부터 검출 및 정량까지를 일체화하여 자동으로 수행할 수 있는 장치를 사용하여 재현성이 높은 분석을 비교적 간단하게 수행할 수 있다. 분석화학이나 생화학에서 빈번하게 사용되며, 속칭 "액크로"(액체 크로마토그래피의 약칭)라고 하면 이것을 가리키는 경우가 많다.

고속 액체 크로마토그래피에서는 각 물질이 비교적 날카로운 피크로 검출되어 분리(다른 물질의 피크와 명확하게 구분됨) 및 검출(날카로운 피크로 인해 높은 감도를 얻을 수 있음) 능력이 기존 액체 크로마토그래피보다 향상된다.

측정 시간은 측정 물질 및 측정 파라미터에 따라 크게 변동하지만, 일반적으로 수 분에서 수십 분/회 정도이다.

3. 작동 원리

HPLC는 작동 압력이 훨씬 높다는 점(약 50–1400 bar)에서 전통적인 ("저압") 액체 크로마토그래피와 구별된다.[13] 일반적인 액체 크로마토그래피는 중력에 의존하여 이동상을 충전된 컬럼을 통과시킨다. HPLC는 분리되는 시료의 양이 적기 때문에, 일반적인 컬럼 치수는 지름 2.1–4.6 mm, 길이 30–250 mm이다. 또한 HPLC 컬럼은 더 작은 흡착 입자(평균 입자 크기 1.5–50 μm)로 만들어진다. 이는 HPLC가 혼합물을 분리할 때 뛰어난 분해능을 제공한다.[13]

분리 및 분석할 시료 혼합물은 컬럼을 통해 침투하는 이동상 흐름에 개별적인 소량(일반적으로 마이크로리터)으로 도입된다. 시료의 성분은 컬럼을 통과하며 각각 고정상인 흡착제와의 특정 물리적 상호 작용에 따라 다른 속도로 이동한다. 각 성분의 속도는 화학적 특성, 고정상의 특성 및 이동상의 조성에 따라 달라진다. 특정 분석물이 용출되는 시간을 머무름 시간이라고 하며, 주어진 분석물의 식별 특성이다.[13]

입자 크기, 다공성 및 표면 화학이 다양한 흡착제로 채워진 많은 다른 유형의 컬럼을 사용할 수 있다. 더 작은 입자 크기의 충전 재료를 사용하면 더 높은 작동 압력을 사용해야 하며 일반적으로 크로마토그래피 분해능이 향상된다. 흡착 입자는 이온성, 소수성 또는 극성일 수 있다.[13]

액체 크로마토그래피의 가장 일반적인 방식은 역상 크로마토그래피이며, 사용되는 이동상은 물 또는 완충액과 유기 용매(주로 아세토니트릴과 메탄올)의 혼합 가능한 조합을 포함한다. 일부 HPLC 기술은 무수 이동상을 사용하기도 한다(아래 정상상 크로마토그래피 참조).[13] 이동상의 수성 성분에는 시료 성분의 분리를 돕기 위해 산(예: 폼산, 인산 또는 트리플루오로아세트산) 또는 염이 포함될 수 있다.

이동상의 조성은 크로마토그래피 분석 중에 일정하게 유지하거나("등용매 용리 모드") 변경할("구배 용리 모드") 수 있다. 등용매 용리는 단순 혼합물의 분리에 효과적이다. 구배 용리는 고정상 및 이동상과의 다양한 상호 작용을 가진 복잡한 혼합물에 필요하다. 구배 용리에서 이동상의 조성은 일반적으로 낮은 용출 강도에서 높은 용출 강도로 변경되며, 높은 용출 강도는 용출 속도를 높여 머무름 시간을 단축시킨다. 예를 들어, 역상 크로마토그래피에서 일반적인 구배 프로파일은 5% 아세토니트릴(물 또는 수성 완충액)에서 시작하여 5–25분 동안 95% 아세토니트릴로 선형적으로 진행될 수 있다.[13]

이동상 성분, 첨가제(예: 염 또는 산) 및 구배 조건의 선택은 컬럼 및 시료 성분의 특성에 따라 달라진다. 역상 HPLC에서 물/아세토니트릴 구배를 사용하는 경우, 더 소수성인 성분은 나중에 용출되고, 이동상이 아세토니트릴이 더 풍부해지면 용출 속도가 빨라진다.[13]

3. 1. 구성 요소

HPLC 기기의 개략도는 일반적으로 용매 저장조, 하나 이상의 펌프, 용매-탈기기, 시료 주입기, 컬럼 및 검출기를 포함한다.[14] 펌프는 컬럼 내부의 고정상을 통해 원하는 이동상의 흐름 및 조성을 검출기 내부의 유동 셀로 직접 전달한다. 검출기는 컬럼에서 나오는 시료 성분의 양에 비례하는 신호를 생성하므로 시료 성분의 정량 분석이 가능하다. 검출기는 또한 성분의 초기 식별에 사용되는 머무름 시간, 즉 용출 시간을 표시한다. 더 발전된 검출기는 UV-VIS 스펙트럼 또는 질량 스펙트럼과 같이 분석물의 특성에 따른 추가 정보를 제공하여 구조적 특징에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 이러한 검출기는 UV/Vis, 포토다이오드 어레이 (PDA) / 다이오드 어레이 검출기 및 질량 분석법 검출기와 같이 일반적으로 사용된다. 디지털 마이크로프로세서와 사용자 소프트웨어는 HPLC 기기를 제어하고 데이터 분석을 제공한다. HPLC 기기의 일부 기계식 펌프 모델은 시간에 따라 비율이 변하는 여러 용매를 함께 혼합하여 이동상에서 조성 구배를 생성할 수 있다. 대부분의 HPLC 기기에는 분리가 수행되는 온도를 조절할 수 있는 컬럼 오븐도 있다.

고성능 액체 크로마토그래피 구성


; 펌프

펌프는 압력 용량이 다르지만, 성능은 일관되고 재현 가능한 부피 유량을 얼마나 잘 제공하는지를 기준으로 측정한다. 압력은 60 MPa(6,000 lbf/in2) 또는 약 600 기압까지 이를 수 있다. 현대 HPLC 시스템은 훨씬 높은 압력에서 작동하도록 개선되었으며, 따라서 컬럼에서 훨씬 작은 입자 크기(<2 μm)를 사용할 수 있다. 이러한 "초고성능 액체 크로마토그래피" 시스템 또는 UHPLC는 초고압 크로마토그래피 시스템이라고도 할 수 있으며,[53] 최대 120 MPa(17,405 lbf/in2) 또는 약 1200 기압에서 작동할 수 있다.[54] "UPLC"[55]라는 용어는 워터스 코퍼레이션의 상표이지만, 때로는 UHPLC의 더 일반적인 기술을 지칭하는 데 사용된다.

HPLC의 핵심 기기이다. 극도로 안정적인 송액이 가능한 구조로 되어 있다. 펌프 앞에는 온라인 탈기 장치(디개서, degasser)가 부착되는 경우가 많다. 또한 플런저 전후에는 체크 밸브가 설치되어 이동상의 역류를 방지한다.

펌프의 최대 사용 압력은 40 MPa 정도이지만, 2000년대 후반에는 100 MPa 정도의 고압 송액이 가능한 초고속 액체 크로마토그래피(Ultra High Performance Liquid Chromatography, UHPLC) 시스템이 등장하여, 실리카겔의 미립자화와 함께 더욱 고속, 고분해능의 분석이 가능해졌다. UHPLC는 제조사에 따라 UPLC(워터스), UFLC(시마즈) 등으로 불린다.

:; 아이소크라틱 펌프

:: 한 종류의 용매만을 송액하는 펌프. 저렴하지만, 용매 혼합비를 변경할 수 없으므로 경사(gradient) 분석이 불가능하며, 분석 범위가 좁다.

:; 고압 경사 펌프

:: 두 대 이상의 아이소크라틱 펌프를 연결하여, 각 유량을 제어하여 용매 혼합비를 변화시킴으로써 경사 분석을 수행한다. 용매 종류별로 펌프를 준비해야 하므로 고가이다.

:; 저압 경사 펌프

:: 펌프는 한 대이지만, 펌프 앞에 있는 밸브 전환에 의해 용매 혼합비를 변화시켜 (일반적으로 4종류의 용매를 혼합하여) 경사 분석을 수행한다. 펌프에 의해 압력이 가해지기 전에 용매를 혼합하므로 이렇게 불린다. 고압 경사 펌프에 비해 저렴하지만, 용매 혼합이 덜 되고, 기포가 발생하기 쉽다는 단점이 있다.

:; 나노/마이크로 플로우 펌프

:: 극미량의 시료 분석에 적합한 유량(nL 또는 μL 단위)으로 용액을 이송한다. 일반적으로 내경 1 mm 이하의 모세관 컬럼을 연결하여 사용한다.

:; 분석 펌프

:: 일반적인 분석에 적합한 유량(0.1 - 10 mL 정도)으로 용액을 이송한다. 내경 1 - 10 mm 정도의 분석 컬럼을 연결하여 사용한다.

:; 분취 펌프

:: 물질의 분리 정제의 목적에 적합한 유량(10 mL 이상)으로 용액을 이송한다. 대형 컬럼을 연결하여 사용한다. 이 종류의 펌프는 분석용에 비해 내압이 낮은 경우가 많다.

; 시료 주입기

시료를 주입하는 부분으로, 수동식(매뉴얼 인젝터)과 자동식(오토 인젝터)이 있다.

현재 시판되는 매뉴얼 인젝터는 대부분 레오다인사 제품이며, "레오다인"이 매뉴얼 인젝터의 대명사가 되었다. 작동 방식은 두 종류의 유로를 전환하는 매우 단순한 것이다.

# 노브를 로드 측으로 하고, 마이크로 시린지로 샘플 루프 내에 시료를 넣는다. 샘플 주입량 계량에는, 사람의 손으로 시린지로 계량하는 방법과, 샘플 루프에서 넘치는 양을 주입하여 샘플 루프로 계량하는 두 가지 방법이 있다. 후자가 사람에 의한 숙련도의 차이가 없기 때문에 재현성이 좋다.

# 노브를 인젝션 측으로 전환하여 샘플을 유로에 주입한다. 매뉴얼 인젝터에 전기 신호를 출력하는 기능이 있다면, 이때 인젝션 신호를 검출기 또는 인테그레이터로 보낼 수 있다.

대부분의 제조사가 레오다인의 수동 주입기를 장치에 내장하고 있으며, 시료를 주사기로 계량하여 이를 전환하여 유로에 주입한다. 제조사에 따라 시료 처리 방법에 차별성을 두어, 사용하는 목적에 따라 선택할 수 있다. 대량(수십에서 1000개 이상)의 시료를 연속 분석할 수 있도록, 시료는 웰 플레이트나 여러 개의 바이알에 넣어 장치 내에 세팅하도록 되어 있다. 시료를 냉장·보온하는 기능이 있는 것도 있다.

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 자동시료 주입기를 사용하면 많은 수의 시료를 HPLC 시스템에 자동으로 주입할 수 있다. 또한, HPLC 자동시료 주입기는 각 주입에 대해 정확히 동일한 주입 부피와 기술을 가지고 있어, 높은 수준의 주입 부피 정밀도를 제공한다. 시료 챔버 내에서 시료 교반을 가능하게 하여 균질성을 높일 수 있다.[58]

; 컬럼

극미량 유속에 사용되는 나노 액체 크로마토그래피(nano-LC) 시스템의 튜빙


고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 컬럼의 내부 지름(ID)은 중요한 매개변수이다.[44] 내부 지름은 용질 밴드의 측면 확산 감소로 인해 감소될 때 검출 응답에 영향을 미칠 수 있다. 또한 등용매 모드와 구배 모드에서 유량 및 주입 부피가 사용되는 더 작거나 더 큰 지름에 비례하여 축소 또는 확대되지 않을 때 분리 선택도에 영향을 미칠 수 있다.[45] 이는 컬럼에 로딩할 수 있는 분석물의 양을 결정한다. 더 큰 지름의 컬럼은 일반적으로 나중에 사용할 약물 제품의 정제와 같은 준비 응용 분야에서 사용된다.[46] 저 ID 컬럼은 최근의 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC)에서 감도가 향상되고 용매 소비가 줄어들었다.[47]

더 큰 ID 컬럼(10mm 이상)은 많은 양의 물질을 정제하는 데 사용된다.

분석용 컬럼(4.6mm)은 가장 일반적인 유형의 컬럼이었지만, 더 좁은 컬럼[47]의 인기가 빠르게 높아지고 있다. 이들은 샘플의 전통적인 정량 분석에 사용되며, 종종 UV-Vis 흡수 검출기를 사용한다.

세관 컬럼(1–2mm)은 특수 UV-Vis 검출기, 형광 검출 또는 액체 크로마토그래피-질량 분석법과 같은 다른 검출 방법을 사용하여 더 높은 감도를 원하는 응용 분야에 사용된다.

모세관 컬럼(0.3mm 미만)은 질량 분석법과 같은 대체 검출 수단에 거의 독점적으로 사용된다. 이들은 더 큰 컬럼이 사용하는 스테인리스강 튜빙 대신 일반적으로 융합 석영 모세관으로 만들어진다.

전통적인 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 작은 구형의 실리카 입자(매우 작은 비드)의 바깥쪽에 고정상이 부착된 상태에서 수행된다. 이러한 입자는 다양한 크기로 제공되며, 5 μm 비드가 가장 일반적이다. 일반적으로 작은 입자는 더 많은 표면적과 더 나은 분리를 제공하지만, 최적의 선형 속도에 필요한 압력은 입자 직경의 제곱에 반비례하여 증가한다.[48][49][50]

컬럼 속도, 효율 및 배압 방정식에 따르면[51] 입자 직경을 절반으로 줄이고 컬럼 크기를 동일하게 유지하면 컬럼 속도와 효율이 두 배로 증가하지만, 배압은 네 배로 증가한다. 또한 작은 입자 HPLC는 띠 넓어짐 현상을 감소시킬 수 있다.[52] 더 큰 입자는 제조 HPLC(컬럼 직경 5 cm ~ >30 cm) 및 고체상 추출과 같은 비 HPLC 응용 분야에 사용된다.

많은 고정상은 더 넓은 표면적을 제공하기 위해 다공성이다. 작은 기공은 더 넓은 표면적을 제공하는 반면, 큰 기공 크기는 특히 더 큰 분석물에 대해 더 나은 동역학을 가집니다. 예를 들어, 기공보다 약간 작은 단백질은 기공으로 들어갈 수 있지만 일단 들어가면 쉽게 빠져나오지 못할 수 있다.

내부에 컬럼을 수납하여 가열 또는 냉각하여 컬럼의 온도를 제어하는 장치. 컬럼 히터라고도 한다.

컬럼 주변의 온도 변동으로 용출 시간이 불안정해지고 재현성이 떨어지는 경우가 있기 때문에 컬럼 온도를 일정하게 유지하기 위해 사용한다. 또한 컬럼 온도를 분리 조건의 파라미터 중 하나로 적극적으로 이용하는 경우도 있다.

가온하는 경우가 많았기 때문에 "오븐, 히터"라고 불리지만, 현재는 주변 기온보다 저온으로 만들기 위한 냉각 기능이 있는 장치도 많다. 또한, 주변 기온 부근에서 사용하는 경우에도 냉각 기능은 일정한 효과가 있다.

; 검출기

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 검출기는 크게 두 가지 범주로 나뉜다. 범용 검출기 또는 선택적 검출기이다. 범용 검출기는 일반적으로 용질을 포함하는 이동상과 용질이 없는 이동상 간의 물리적 성질 차이를 측정하여 벌크 특성(예: 굴절률)을 측정하는 반면, 선택적 검출기는 용질의 물리적 또는 화학적 성질에 단순히 반응하여 용질 특성(예: UV-Vis 흡수도)을 측정한다.[56] HPLC는 가장 일반적으로 UV-Vis 흡수도 검출기를 사용한다. 그러나 다양한 다른 크로마토그래피 검출기를 사용할 수 있다. UV-Vis 흡수도 검출기를 보완하는 범용 검출기는 대전 에어로졸 검출기(CAD)이다. 일반적으로 사용되는 검출기 종류에는 흐름 셀을 통과하면서 용리의 굴절률 변화를 측정하여 판독값을 제공하는 굴절률 검출기가 있다. 특정 경우에는 여러 검출기를 사용할 수 있다. 예를 들어 LCMS는 일반적으로 UV-Vis와 질량 분석기를 결합한다.

검출기로는 목표 물질의 성질에 따라 광학적 성질(흡광도, 굴절률, 형광 등), 전기화학적 성질, 질량 분석법 등을 이용하는 장치가 있다.

또한, JIS K0124:2002 고속 액체 크로마토그래피 통칙에 따르면, '''흡광 광도 검출기(UV/VIS 검출기)''', '''형광 검출기(FLD)''', '''시차 굴절률 검출기(RID)''', '''전기화학 검출기(ECD)''', '''전기 전도도 검출기(CD)''', '''질량 분석계(MS)''', '''적외선 분광 광도계(IR)''', '''선광도 검출기(OR)''', '''원 이색성 검출기(CD)''', '''수소 염 이온화 검출기(FID)''', '''방사선 검출기(RI)''', '''유전율 검출기''', '''화학 발광 검출기(생물 발광도 포함)(CLD)''', '''원자 흡광 분광 분석 장치(AA)''', 유도 결합 플라스마 발광 분광 분석 장치(ICP-AES), 고주파 플라스마 질량 분석계, 열 검출기, 광 산란 검출기, 점도 검출기, 이온 전극, 초음파 검출기, 핵 자기 공명 장치(NMR)가 기재되어 있다.

전기화학 검출기(ECD)와 함께 사용하면 HPLC-ECD는 신경화학 분석 연구 응용 분야에서 노르에피네프린, 도파민, 세로토닌, 글루탐산, GABA, 아세틸콜린 등과 같은 신경 전달 물질을 선택적으로 검출한다.[57] HPLC-ECD는 신경 전달 물질을 펨토몰 범위까지 검출한다. 신경 전달 물질을 검출하는 다른 방법으로는 액체 크로마토그래피-질량 분석법, ELISA 또는 방사성 면역 분석법이 있다.

3. 2. 이동상

HPLC에서 이동상은 분석 대상 물질을 용해시켜 컬럼을 통과하도록 운반하는 역할을 한다. 이동상은 다음과 같은 조건을 만족해야 한다.[13][14][15][16]

  • HPLC 등급의 용매를 사용해야 한다.
  • 초순수(비저항값 18 MΩ 이상)를 사용해야 한다.
  • 측정하고자 하는 파장보다 낮은 UV cutoff 값을 가진 용매를 사용해야 한다.
  • 용매 간 섞임성(miscibility No. 차 15 미만)이 좋아야 한다.
  • 분리하고자 하는 시료를 잘 녹일 수 있어야 한다.
  • 모든 용매는 반드시 여과 및 탈기하여 사용해야 한다.
  • 점도가 낮아야 한다.
  • 고정상을 변화시키지 않아야 한다.


이동상으로 사용되는 용매는 매우 다양한데, 물, 염류 수용액, 알코올류, 아세토니트릴, 디클로로메탄, 트리플루오로아세트산 등이 사용된다.[13] 상용성이 있는 용매들을 혼합하여 사용하기도 한다.

이동상의 조성을 시간에 따라 연속적으로 변화시키는 방법을 '''그래디언트 분석'''이라고 한다. 예를 들어, 역상 크로마토그래피에서 물/메탄올 혼합 용매를 사용할 때, 처음에는 메탄올 농도를 낮게 하여 극성이 높은 물질을 먼저 용출시키고, 점차 메탄올 농도를 높여 극성이 낮은 물질을 순차적으로 용출시킬 수 있다. 반면, 일정한 조성의 용매를 사용하는 방법을 '''아이소크라틱 분석'''이라고 한다.[13]

이동상을 준비하는 과정은 다음과 같다.[13]

  • HPLC 등급의 용매와 초순수(비저항값 18 MΩ)를 사용한다.
  • 용매를 부피비로 계량하여 혼합한다. (용매의 성질에 따라 흡열 또는 발열 반응이 일어날 수 있으며, 시간이 지남에 따라 혼합 용매의 부피비가 달라질 수 있다.)
  • 수용성 필터(PVDF 재질)는 물로 활성화한 후 사용하고, 지용성 필터(PTFE 재질)는 MeOH 또는 적합한 용매로 활성화한 후 사용한다.
  • 이동상에 녹아 있는 공기, 산소, 기포를 제거하기 위해 진공 탈기(Vacuum Degassing), 헬륨 퍼징(Helium Sparging), 초음파 파쇄(Ultrasonication) 등의 방법을 사용한다.


이동상을 공급하는 펌프의 종류는 다음과 같다.

종류설명
아이소크라틱 펌프한 종류의 용매만 공급하는 펌프. 저렴하지만, 용매 혼합비를 변경할 수 없어 그래디언트 분석이 불가능하고, 분석 범위가 좁다.
고압 그래디언트 펌프두 대 이상의 아이소크라틱 펌프를 연결하여 각 유량을 제어함으로써 용매 혼합비를 변화시켜 그래디언트 분석을 수행한다. 용매 종류별로 펌프가 필요하여 고가이다.
저압 그래디언트 펌프한 대의 펌프로 펌프 앞의 밸브 전환을 통해 용매 혼합비를 변화시켜 (일반적으로 4종류의 용매 혼합) 그래디언트 분석을 수행한다. 펌프에 의해 압력이 가해지기 전에 용매를 혼합하기 때문에 저압 그래디언트 펌프라고 불린다. 고압 그래디언트 펌프보다 저렴하지만, 용매 혼합이 덜 되고, 기포가 발생하기 쉽다.


3. 3. 등용매 용리 및 구배 용리

등용매 용리는 분리 과정 동안 이동상의 조성이 일정하게 유지되는 방식이다. 이는 단순 혼합물의 분리에 효과적이다.

구배 용리는 이동상의 조성을 분석 중에 변화시키는 방식이다. 일반적으로 낮은 용출 강도에서 높은 용출 강도로 변경된다. 높은 용출 강도는 용출 속도를 높여 머무름 시간을 단축시킨다. 예를 들어, 역상 크로마토그래피에서 일반적인 구배 프로파일은 5% 아세토니트릴(물 또는 수성 완충액)에서 시작하여 5-25분 동안 95% 아세토니트릴로 선형적으로 진행될 수 있다. 일정한 이동상 조성의 기간도 구배 프로파일의 일부일 수 있다.[13]

이동상 성분, 첨가제(예: 염 또는 산) 및 구배 조건의 선택은 컬럼 및 시료 성분의 특성에 따라 달라진다. 역상 HPLC에서 물/아세토니트릴 구배를 사용하는 경우, 더 소수성인 성분은 나중에 용출되고, 이동상이 아세토니트릴이 더 풍부해지면 용출 속도가 빨라진다.[13]

구배 용리는 고정상 및 이동상과의 다양한 상호 작용을 가진 복잡한 혼합물에 필요하다. 분석 과정에서 수성 이동상의 극성과 표면 장력을 자동으로 감소시켜 이러한 효과를 사용한다. 적절한 분리를 제공하는 HPLC 방법을 찾기 위해 종종 시료를 사용하여 일련의 시험 실행을 수행한다.[13]

고속 액체 크로마토그래피에서, 용매의 조성에 기울기를 주어(즉, 조성을 연속적으로 변화시켜) 용출을 수행하는 경우도 많다. 예를 들어 역상 크로마토그래피에서 물/메탄올 기울기를 사용하는 경우, 먼저 메탄올이 적은 조건에서 극성이 높은 물질이 용출되고, 그 후 메탄올의 비율을 증가시켜감에 따라 보다 극성이 낮은 물질이 순차적으로 용출된다. 이것을 '''그래디언트 분석'''이라고 부른다. 이에 반해, 일정 조성의 용매로 분석물을 용출시키는 분석법을 '''아이소크라틱 분석'''이라고 부른다.

HPLC 기기의 펌프 종류는 다음과 같다.

종류설명
아이소크라틱 펌프1종류의 용매만을 송액한다. 저렴하지만, 용매 혼합비를 변경할 수 없어 그래디언트 분석이 불가능하며, 분석 범위가 좁다.
고압 그래디언트 펌프2대 이상의 아이소크라틱 펌프를 연결하여, 각 유량을 제어하여 용매 혼합비를 변화시킴으로써 그래디언트 분석을 수행한다. 용매 종류별로 펌프를 준비해야 하므로 고가이다.
저압 그래디언트 펌프펌프는 1대이지만, 펌프 앞에 있는 밸브 전환에 의해 용매 혼합비를 변화시켜 (일반적으로 4종류의 용매를 혼합하여) 그래디언트 분석을 수행한다. 펌프에 의해 압력이 가해지기 전에 용매를 혼합하므로 이렇게 불린다. 고압 그래디언트 펌프에 비해 저렴하지만, 용매 혼합이 덜 되고, 기포가 발생하기 쉽다.


4. HPLC의 종류

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 혼합물을 분리하고 각 성분을 식별 및 정량하는 데 사용되는 기술이다. HPLC는 다양한 종류가 있으며, 각각 다른 분리 메커니즘을 기반으로 한다.
이온 교환 크로마토그래피 (Ion-exchange chromatography, IEC)'''이온 교환 크로마토그래피'''('''IEC''') 또는 '''이온 크로마토그래피'''('''IC''')[32]는 용질 이온과 고정상에 결합된 하전 부위 사이의 인력을 기반으로 이온성 용질을 분리하는 기술이다. 컬럼의 이온과 같은 전하를 띤 용질 이온은 반발하여 용리되고, 반대 전하를 띤 용질 이온은 컬럼에 유지된다. 유지된 용질 이온은 이동상 조성(염 농도, pH, 온도 등)을 변경하여 용리할 수 있다.

이온 교환체에는 폴리스티렌 수지, 셀룰로스 및 덱스트란 이온 교환체(겔), 조절된 기공 유리 또는 다공성 실리카겔 등이 있다. 폴리스티렌 수지는 가교 결합을 통해 안정성을 높인다. 셀룰로스와 덱스트란 이온 교환기는 큰 기공 크기와 낮은 전하 밀도를 가져 단백질 분리에 적합하다.

일반적으로 이온 교환체는 더 높은 전하와 더 작은 반경의 이온 결합을 선호한다. 역이온 농도를 증가시키거나 pH를 조절하면 유지 시간을 조절할 수 있다. 이 크로마토그래피는 수질 정화, 미량 성분 사전 농축, 단백질 및 탄수화물 분리 등 다양한 분야에서 사용된다.
크기 배제 크로마토그래피 (Size-exclusion chromatography, SEC)Size-exclusion chromatography|사이즈 익스클루젼 크로마토그래피|SEC영어는 '''겔 여과 크로마토그래피'''(Gel Filtration Chromatography, GFC) 또는 '''겔 투과 크로마토그래피'''(Gel Permeation Chromatography, GPC)라고도 불리며, 분석물을 크기에 따라 분리한다. 크기가 작은 분석물일수록 고정상인 겔에 더 많이 "걸려" 용출이 늦어진다. 분자체를 사용하여 수행한다.
생체 친화성 크로마토그래피 (Bioaffinity chromatography)(내용 누락 - 원본 소스에 관련 내용 없음)

4. 1. 분배 크로마토그래피 (Partition chromatography)

정상 액체 크로마토그래피(NP-HPLC)는 극성 고정 표면에 대한 분석물의 친화성을 바탕으로 분석물을 분리하는 방법이다. 이 방법은 실리카와 같은 극성 고정상을 사용하며, 분석물은 흡착제 표면과 수소 결합 또는 쌍극자-쌍극자 상호작용과 같은 극성 상호작용을 통해 결합하고 유지된다. NP-HPLC는 클로로포름과 같은 비극성, 비수성 이동상을 사용하며, 비극성 용매에 쉽게 용해되는 분석물을 분리하는 데 효과적이다.

분석물의 극성이 증가할수록 흡착 강도는 증가한다. 상호작용 강도는 분석물 분자 구조에 존재하는 작용기뿐만 아니라 입체 요인에도 영향을 받는다. 이러한 입체 장애의 영향으로 NP-HPLC는 구조 이성질체를 분리할 수 있다.

이동상에 더 극성인 용매를 사용하면 분석물의 유지 시간이 감소하는 반면, 소수성 용매는 유지 시간을 증가시킨다. 이동상에 미량의 물과 같은 매우 극성인 용매는 고정상의 고체 표면에 흡착되어 고정된 (물) 층을 형성하며, 이는 유지에 중요한 역할을 한다.

역상 HPLC가 개발되기 전인 1970년대까지 분배 크로마토그래피가 사용되었으나, 실리카 또는 알루미나 크로마토그래피 매체의 표면에 물 또는 양성자성 유기 용매 층이 존재하여 유지 시간의 재현성이 좋지 않아 사용이 줄었다. 이 층은 이동상의 조성 변화에 따라 변동하여 유지 시간에 영향을 준다.

최근에는 Hilic 결합상의 개발로 분배 크로마토그래피가 다시 주목받고 있으며, 재현성이 향상되어 활용 범위가 넓어지고 있다.

4. 2. 정상 크로마토그래피 (Normal–phase chromatography)

정상 액체 크로마토그래피(NP-HPLC)는 화학자들이 개발한 초기 HPLC 중 하나로, 실리카와 같은 극성 고정 표면에 대한 분석물의 친화성을 기반으로 분석물을 분리한다. 분석물은 극성 고정상과 수소 결합 또는 쌍극자-쌍극자 유형의 상호 작용을 통해 결합하고 유지된다. 분석물의 극성이 증가할수록 흡착 강도는 증가하며, 이러한 상호 작용 강도는 분석물 분자 구조의 작용기뿐만 아니라 입체 요인에도 영향을 받는다. 이러한 입체 장애의 영향으로 이 방법은 구조 이성질체를 분리할 수 있다.

NP-HPLC는 비극성, 비수성 이동상(예: 클로로포름)을 사용하며, 비극성 용매에 쉽게 용해되는 분석물을 분리하는 데 효과적이다. 이동상에 더 극성인 용매를 사용하면 분석물의 유지 시간이 감소하는 반면, 소수성 용매는 더 느린 용출(유지 시간 증가)을 유도한다. 이동상에 미량의 물과 같은 매우 극성인 용매는 고정상의 고체 표면에 흡착되어 고정된 (물) 층을 형성하는 경향이 있으며, 이는 유지에 적극적인 역할을 한다.

1970년대에 역상 HPLC가 개발되면서 분배 및 NP-HPLC는 실리카 또는 알루미나 크로마토그래피 매체의 표면에 물 또는 양성자성 유기 용매 층이 존재하여 유지 시간의 재현성이 좋지 않아 사용이 줄었다.

최근에는 Hilic 결합상의 개발로 분배 크로마토그래피가 다시 인기를 얻고 있으며, 이 기법의 유용성 범위를 더 잘 이해하게 되면서 재현성이 향상되었다.

순상 크로마토그래피는 고속 액체 크로마토그래피에서 처음 사용되었다. 고정상에 고극성 물질(실리카겔)을, 이동상에 저극성 물질(예: 헥산, 아세트산 에틸, 클로로포름 등의 유기 용매)을 사용한다. 분석물은 극성이 높을수록 고정상과 더 강하게 상호 작용하여 용출이 늦어진다. 또한 극성이 높은 물질의 비율이 높은 이동상일수록 용출이 빨라진다. 순상 타입은 역상 타입의 발전과 함께 사용 빈도가 줄었지만, 목적에 따라 매우 효과적이다. 예를 들어, 역상 타입에서는 분리가 어려운 토코페롤의 이성질체나 유지가 어려운 당류를 쉽게 상호 분석할 수 있으며, 주로 물을 포함하지 않는 이동상을 사용하므로, 물에 난용성인 지용성 비타민이나 가수 분해되기 쉬운 산 무수물 등의 화합물 분리에 적합하다.

또한, 순상 크로마토그래피의 변형으로, "친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)"라고 불리는 분리 모드의 컬럼이 시판되었다. 고정상에 미수식 실리카겔 또는 표면을 극성기(다이올, 아미드, 설포베타인 등)로 수식한 실리카겔을, 이동상에 물을 포함하는 이동상을 사용함으로써, 순상 크로마토그래피로는 분리가 어려운 아미노산 등의 극성 화합물을 분리하는 것이 가능하다.

최근에는, 기존의 순상 모드를 물, 메탄올, 아세토니트릴 등의 고극성 이동상을 사용하여 수행하는 수성 순상 크로마토그래피(ANP)도 사용되고 있다.

4. 3. 역상 크로마토그래피 (Reversed-phase liquid chromatography, RP-LC)

역상 크로마토그래피는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 가장 일반적인 분리 방식이다. 사용되는 이동상은 물 또는 완충액과 아세토니트릴, 메탄올과 같은 유기 용매를 섞어 만든다.[13] 일부 HPLC 기술은 물을 사용하지 않는 이동상을 사용하기도 하지만, 일반적으로 역상 크로마토그래피에서는 수성 성분에 포름산, 인산 또는 트리플루오로아세트산과 같은 산이나 염을 넣어 시료 성분의 분리를 돕는다.[14][15][16]

역상 크로마토그래피에서는 고정상으로 극성이 낮은 물질(예: 실리카겔에 알킬기를 공유 결합시킨 것)을 사용하고, 이동상으로는 극성이 높은 물질(예: 물, 염류 수용액, 알코올, 아세토니트릴 등의 유기 용매)을 사용한다.[36][37] 분석물은 극성이 낮을수록 고정상과 더 강하게 상호작용하여 늦게 나오고, 극성이 낮은 물질의 비율이 많은 이동상일수록 빨리 나온다.

가장 널리 사용되는 컬럼은 실리카겔에 탄소 사슬 수가 18개인 옥타데실기를 결합시킨 ODS 컬럼이다.

이동상의 조성은 분석 대상에 따라 일정하게 유지할 수도 있고("등용매 용리"), 시간에 따라 변화시킬 수도 있다("구배 용리").[38][39] 등용매 용리는 단순한 혼합물 분리에 효과적이며, 구배 용리는 고정상 및 이동상과 다양한 상호 작용을 하는 복잡한 혼합물에 필요하다. 구배 용리에서는 이동상의 조성을 일반적으로 낮은 용출 강도에서 높은 용출 강도로 변경하여, 늦게 나오는 성분의 유지 시간을 줄이고 대부분의 성분에 대해 더 좁고 높은 피크를 얻을 수 있다.

구배 용리의 개략도. 이동상 강도를 높이면 고정상과의 상호 작용 강도가 다른 분석물이 순차적으로 용리된다.


역상 크로마토그래피는 분자량이 작은 물질 분석뿐만 아니라, 핵산이나 단백질 분석에도 사용된다. 단백질 분석에는 세공경이 큰 화학 결합형 실리카겔을 컬럼 충전제로 사용하고, 이동상 조건으로는 보통 pH 2 - 3 또는 중성 부근에서 유기 용매량을 늘려가는 구배 용리법을 사용한다.

역상 크로마토그래피에서 분리가 일어나는 주된 이유는 물 구조의 높은 질서 때문이다. 이동상의 유기 성분은 이 높은 질서를 줄여 수성 성분의 지연 강도를 낮추는 역할을 한다.[40]

4. 4. 크기 배제 크로마토그래피 (Size-exclusion chromatography, SEC)

Size-exclusion chromatography|사이즈 익스클루젼 크로마토그래피|SEC영어는 '''겔 여과 크로마토그래피'''(Gel Filtration Chromatography, GFC) 또는 '''겔 투과 크로마토그래피'''(Gel Permeation Chromatography, GPC)라고도 불리며, 분석물을 크기에 따라 분리한다. 크기가 작은 분석물일수록 고정상인 겔에 더 많이 "걸려" 용출이 늦어진다. 분자체를 사용하여 수행한다.

4. 5. 이온 교환 크로마토그래피 (Ion-exchange chromatography, IEC)

'''이온 교환 크로마토그래피'''('''IEC''') 또는 '''이온 크로마토그래피'''('''IC''')[32]는 금속 산업, 산업 폐수, 생물학적 시스템, 제약 샘플, 식품 등 환경 및 산업 기원의 수성 샘플에서 이온성 용질을 분리하고 결정하는 데 사용되는 분석 기술이다. 유지는 용질 이온과 고정상에 결합된 하전 부위 사이의 인력에 기반한다. 컬럼의 이온과 동일한 전하를 띤 용질 이온은 반발하여 유지 없이 용리되는 반면, 컬럼의 하전 부위와 반대 전하를 띤 용질 이온은 컬럼에 유지된다. 컬럼에 유지된 용질 이온은 이동상 조성을 변경하여(예: 염 농도, pH, 컬럼 온도 등을 높이는 방식) 용리할 수 있다.

이온 교환체의 유형에는 폴리스티렌 수지, 셀룰로스 및 덱스트란 이온 교환체(겔), 조절된 기공 유리 또는 다공성 실리카겔 등이 있다. 폴리스티렌 수지는 가교 결합을 허용하여 사슬의 안정성을 높인다. 가교 결합이 높을수록 굽힘이 줄어들어 평형 시간이 증가하고 궁극적으로 선택성이 향상된다. 셀룰로스와 덱스트란 이온 교환기는 더 큰 기공 크기와 낮은 전하 밀도를 갖고 있어 단백질 분리에 적합하다.

일반적으로 이온 교환체는 더 높은 전하와 더 작은 반경의 이온 결합을 선호한다.

역이온(수지 내 작용기에 관하여) 농도의 증가는 용질 이온과의 강한 경쟁을 유발하므로 유지 시간을 감소시킨다. pH 감소는 양이온 교환에서, pH 증가는 음이온 교환에서 유지 시간을 감소시킨다. 예를 들어, 양이온 교환 컬럼에서 용매의 pH를 낮춤으로써 음이온 고정상에서 위치를 놓고 경쟁할 수 있는 수소 이온이 더 많아져 약하게 결합된 양이온이 용리된다.

이러한 형태의 크로마토그래피는 수질 정화, 미량 성분의 사전 농축, 리간드 교환 크로마토그래피, 단백질의 이온 교환 크로마토그래피, 탄수화물 및 올리고당의 고pH 음이온 교환 크로마토그래피 등 다양한 분야에서 널리 사용된다. 주로 이온성 물질의 정량에 효과적이다.

'''이온 교환 크로마토그래피'''는 무기 이온이나 고극성 분자를 전하를 이용하여 분리한다. 양이온 및 음이온 타입이 모두 있으며, 이온 교환 수지를 이용한다.

4. 6. 생체 친화성 크로마토그래피 (Bioaffinity chromatography)

이온 교환 크로마토그래피(IEC) 또는 이온 크로마토그래피(IC)[32]는 금속 산업, 산업 폐수, 생물학적 시스템, 제약 샘플, 식품 등 환경 및 산업에서 만들어지는 수성 샘플에서 이온성 용질을 분리하고 확인하는 데 사용되는 분석 기술이다. 이온 교환 크로마토그래피에서 용질 이온과 고정상에 결합된 하전 부위 사이의 인력을 기반으로 용질이 머무르게 된다. 컬럼의 이온과 동일한 전하를 띤 용질 이온은 서로 반발하여 유지되지 않고 용리되는 반면, 컬럼의 하전 부위와 반대 전하를 띤 용질 이온은 컬럼에 유지된다. 컬럼에 유지된 용질 이온은 이동상의 조성을 변경하여 용리할 수 있는데, 예를 들어 염 농도와 pH를 높이거나 컬럼 온도를 높이는 방식이 사용된다.

이온 교환체의 유형에는 폴리스티렌 수지, 셀룰로스 및 덱스트란 이온 교환체(겔), 조절된 기공 유리 또는 다공성 실리카겔 등이 있다. 폴리스티렌 수지는 가교 결합을 가능하게 하여 사슬의 안정성을 높인다. 가교 결합이 높을수록 굽힘이 줄어들어 평형 시간이 증가하고 궁극적으로 선택성이 향상된다. 셀룰로스와 덱스트란 이온 교환기는 더 큰 기공 크기와 낮은 전하 밀도를 가지고 있어 단백질 분리에 적합하다.

일반적으로 이온 교환체는 더 높은 전하와 더 작은 반경을 가진 이온의 결합을 선호한다.

역이온(수지 내 작용기에 관하여) 농도가 증가하면 용질 이온과의 강한 경쟁을 유발하여 유지 시간이 감소한다. pH 감소는 양이온 교환에서 유지 시간을 감소시키고 pH 증가는 음이온 교환에서 유지 시간을 감소시킨다. 예를 들어, 양이온 교환 컬럼에서 용매의 pH를 낮추면 음이온 고정상에서 위치를 놓고 경쟁할 수 있는 수소 이온이 더 많아져 약하게 결합된 양이온이 용리된다.

이러한 형태의 크로마토그래피는 수질 정화, 미량 성분의 사전 농축, 리간드 교환 크로마토그래피, 단백질의 이온 교환 크로마토그래피, 탄수화물 및 올리고당의 고pH 음이온 교환 크로마토그래피 등 다양한 분야에서 널리 사용된다.

4. 7. 수성 정상 크로마토그래피 (Aqueous normal-phase chromatography, ANP)

정상 액체 크로마토그래피(NP-HPLC)는 실리카와 같은 극성 고정상에 대한 분석물의 친화성을 바탕으로 분석물을 분리한다. 분석물은 극성 고정상과 수소 결합 또는 쌍극자-쌍극자 상호작용을 통해 결합한다. 비극성, 비수성 이동상(예: 클로로포름)이 사용되며, 분석물의 극성이 증가할수록 흡착 강도가 증가한다. 상호작용 강도는 분석물 분자 구조의 작용기뿐만 아니라 입체 요인에도 영향을 받는다. 이러한 입체 장애의 영향으로 이 방법은 구조 이성질체를 분리할 수 있다.

이동상에 더 극성인 용매를 사용하면 분석물의 유지 시간이 감소하고, 소수성 용매는 유지 시간을 증가시킨다. 이동상에 미량의 물과 같은 매우 극성인 용매는 고정상의 표면에 흡착되어 고정된 (물) 층을 형성하며 유지에 영향을 준다. 이는 분석물이 고체 표면과 직접 상호작용하기 때문에 정상 액체 크로마토그래피에서 특이한 현상이다.

역상 HPLC가 개발되면서, 실리카 또는 알루미나 크로마토그래피 매체의 표면에 물 또는 양성자성 유기 용매 층이 존재하여 유지 시간의 재현성이 좋지 않았던 분배- 및 NP-HPLC는 1970년대에 사용이 줄었다.

최근에는 Hilic 결합상의 개발로 분배 크로마토그래피가 다시 인기를 얻고 있으며, 재현성이 향상되었다.

5. HPLC의 발전

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 이전에는 과학자들이 탁상용 컬럼 액체 크로마토그래피 기술을 사용했다. 액체 크로마토그래피 시스템은 용매의 유속이 중력에 의존했기 때문에 대체로 비효율적이었다. 분리하는 데 수 시간이 걸렸고, 때로는 며칠이 걸리기도 했다. 당시의 기체 크로마토그래피(GC)는 액체 크로마토그래피(LC)보다 더 강력했지만, 기체 상 분리 및 고분자량 생체 고분자의 분석은 불가능하다는 것이 분명했다.[17] GC는 생체 분자가 대부분 비휘발성 유기 화합물이고 GC의 고온에서 열적으로 불안정하기 때문에 많은 생명 과학 및 건강 응용 분야에 효과적이지 않았다.[18] 그 결과, 곧 HPLC 개발로 이어질 대안적인 방법들이 가설로 제기되었다.

1941년 마틴(Martin)과 싱(Synge)의 획기적인 연구에 이어, 캘빈 기딩스(Calvin Giddings),[19] 요제프 후버(Josef Huber) 등은 1960년대에 LC가 일반적인 LC(및 GC) 수준인 150 μm보다 훨씬 작은 입자 직경을 사용하고 압력을 사용하여 이동상의 속도를 증가시킴으로써 고효율 모드로 작동될 수 있다고 예측했다.[17] 이러한 예측은 60년대에서 70년대에 걸쳐 광범위한 실험과 개선을 거쳐 오늘날에 이르렀다.[20] 초기 개발 연구는 LC 입자, 예를 들어 표면 다공성 입자인 역사적인 Zipax를 개선하기 시작했다.[21]

1970년대는 하드웨어와 계측 분야에서 많은 발전을 가져왔다. 연구자들은 HPLC 시스템의 기본적인 설계를 만들기 위해 펌프와 주입기를 사용하기 시작했다.[22] 가스 증폭기 펌프는 일정한 압력에서 작동하고, 안정적인 흐름과 양호한 정량을 위해 누출 없는 씰이나 체크 밸브가 필요하지 않기 때문에 이상적이었다.[18] 듀폰 IPD(산업 폴리머 부서)에서는 저체류 부피 구배 장치를 활용하고 격막 주입기를 루프 주입 밸브로 교체하는 등 하드웨어 획기적인 성과를 거두었다.[18]

계측 발전도 중요했지만, HPLC의 역사는 주로 입자 기술의 역사와 진화에 관한 것이다.[18][23] 다공성 층 입자가 도입된 이후 효율성을 개선하기 위해 입자 크기를 줄이는 꾸준한 추세가 있었다.[18] 그러나 입자 크기를 줄이면서 새로운 문제들이 발생했다. 실질적인 단점은 컬럼을 통해 이동성 유체를 밀어 넣는 데 필요한 과도한 압력 강하와 극도로 미세한 물질의 균일한 충전을 준비하는 어려움에서 비롯된다.[24] 입자 크기가 상당히 줄어들 때마다 압력을 처리하기 위해 일반적으로 또 다른 일련의 기기 개발이 이루어져야 한다.[20][18]

6. HPLC의 응용

고속액체 크로마토그래피(HPLC)는 분자량이 큰 물질의 분석에도 사용될 수 있어, 제약 개발과 같은 분야에서 널리 활용된다.[101] HPLC는 높은 품질(순수)의 제품을 생산할 수 있지만,[60] 대량 생산에는 비용이 많이 드는 기술이 될 수 있다.[62]

HPLC는 불법 약물 검출에도 사용된다.[63] 면역 분석법보다 특이성과 다양한 약물 범위를 포괄할 수 있다는 장점이 있지만, 약물 농도 평가는 질량 분석법과 함께 수행되는 경우가 많다.[65] 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)는 도핑제, 약물 대사산물 등 다양한 물질을 검출하는 데 사용된다.[67][68]

의료 분야에서 HPLC는 질량 분석법(MS)과 함께 사용되는 경우가 많으며(LC-MS[70] 또는 LC-MS/MS[71]), 약물 개발,[74] 약리학,[75] 맞춤형 의료,[76] 공중 보건[77][78] 및 진단[79] 등에 활용된다. 특히 신생아 대사 이상 선별 검사(NBS)에 중요한 역할을 한다.[81]

연구 목적으로는 항진균제, 천식 치료제와 같은 잠재적 임상 후보 물질의 농도를 감지하거나,[69] 합성 반응의 결과를 확인하는 데 사용된다.

7. 대한민국 HPLC 관련 업체

주어진 원본 소스는 대부분 일본 HPLC 관련 업체 정보를 담고 있어, '대한민국 HPLC 관련 업체' 섹션에 직접적으로 부합하는 내용은 없습니다. 따라서 섹션 제목에 맞게 내용을 수정하면 다음과 같습니다.

대한민국에는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 관련 다양한 업체들이 있으나, 주어진 자료에는 대한민국 업체에 대한 구체적인 정보는 없고 일본 업체 정보만 나열되어 있다. 따라서 대한민국 HPLC 관련 업체에 대한 추가 정보가 필요한 상황이다.

7. 1. 칼럼 제조사

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 장치에서 실제로 분리가 일어나는 곳은 칼럼이며, 이는 소모품이다. 일반적으로 미세한(수 μm) 구형의 다공성 실리카겔을 스테인리스강 관에 채운 형태가 많다. 분석 목적과 분리 방법에 따라 다양한 종류의 HPLC 칼럼이 사용된다. 다음은 대표적인 칼럼 제조사와 브랜드명이다.

제조사브랜드명
애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)Zorbax
인택트(Intact)Unison, Cadenza, Scherzo, Presto, Intrada, DACAPO
워터스(Waters)XSelect, XBridge, SunFire, Atlantis
화학물질평가연구기구(化学物質評価研究機構)L-column
간토 화학(関東化学)Mightysil
크로마닉 테크놀로지스(Chromanic Technologies)Sunniest, SunShell(코어 쉘 칼럼)
GL 사이언스(ジーエルサイエンス)InertSustain, Inertsil, MonoClad(모노리스 칼럼), MonoCap(모노리스 캐필러리 칼럼)
시그마 알드리치 재팬(シグマ アルドリッチ ジャパン)Ascentis
오사카 소다(大阪ソーダ)CAPCELL PAK
시마즈 제작소(島津製作所)Shimpack
쇼와 덴코(昭和電工)Shodex
신와 화학공업(信和化工)Ultron ES-OVM(광학 이성체 분리용), HF-ODS(모노리스 캐필러리 칼럼)
스미카 분석 센터(住化分析センター)SUMICHIRAL(광학 이성체 분리용)
다이오넥스(日本ダイオネクス)Acclaim
다이셀(ダイセル)CHIRALCEL, CHIRALPAK(광학 이성체 분리용)
도쿄 가세이 공업(東京化成工業)Kaseisorb LC
도소(東ソー)TSK-GEL
나카라이 테스크(ナカライテスク)COSMOSIL
노무라 화학(野村化学)Develosil
페노메넥스(Phenomenex)Gemini, Jupiter, Luna, Onyx(모노리스 칼럼)
머크(メルク)Chromolith(모노리스 칼럼), ZIC-HILIC
YMC(ワイエムシィ)YMC-Pack, YMC-Triart, CHIRAL ART, BioPro IEX
와코 순약 공업(和光純薬工業)Wakopak


7. 2. 장비/시스템 제조사


  • 시마즈 제작소: 종합 분석 장치 제조사이다.
  • 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies): 종합 분석 장치 제조사이다.
  • 워터스(Waters): 종합 분석 장치 제조사이다.
  • 히타치 하이테크놀로지스(Hitachi High-Tech): 종합 분석 장치 제조사이다.
  • 써모 피셔(Thermo Fisher Scientific): 종합 분석 장치 제조사이다.
  • 다이오넥스(Dionex): 화학 제품 제조사이다. 이온 크로마토그래피가 유명하다. 고속 액체 크로마토그래피를 판매하였고, 최근에는 ESA사를 인수하여 CAD를 판매하였다. 2010년 말에 써모 피셔에 인수되었다[94].
  • GL 사이언스(GL Sciences): 크로마토그래피 관련 제품 제조사이다. 역상 C18 등 칼럼 및 고상 미니 칼럼 제조사로 유명하지만, HPLC 시스템 및 분취 시스템도 제조하고 있다.
  • 일본 분광(JASCO): 분광계 제조사이다.
  • 도소(TOSOH): 화학 제품 제조사이다. 각종 GPC 시스템, 이온 크로마토그래피를 제조한다. 범용기는 2009년 9월 생산 종료하였다[95].
  • YMC(YMC): 랩 스케일에서 플랜트 스케일까지 HPLC용 충전제, HPLC용 칼럼, 분취 시스템의 토탈 솔루션을 제공한다.
  • 오사카 소다(Osaka Soda): 화학 제품 제조사이다. 캐리 오버가 적은 HPLC 등 독특한 HPLC 시스템도 제조하고 있다.
  • 에이콤(Eicom): 종합 분석 장치 제조사이다. HPLC-전기화학 검출기 및 마이크로 다이알리시스 제조사이다[96].
  • 일본 분석 공업 주식회사(Nihon Bunseki Kogyo): 분석 장치 제조사이다. 리사이클 분취 HPLC 및 큐리 포인트 파이로라이저 등을 제조·판매하고 있다.

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