맥삼-길버트 염기 서열 분석법
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1. 개요
맥삼-길버트 염기 서열 분석법은 1977년 앨런 맥삼과 월터 길버트가 개발한 DNA 염기 서열 분석 방법이다. 이 방법은 정제된 DNA를 직접 사용할 수 있다는 장점으로 초기 생어법보다 널리 사용되었으나, 기술적 복잡성과 유해 화학 물질 사용, 규모 확장의 어려움 때문에 체인 터미네이션 방법, 즉 생어법이 개선되면서 점차 사용 빈도가 줄어들었다. 맥삼-길버트 염기 서열 분석법은 DNA 단편의 5' 말단에 방사성 동위원소를 표지하고, 화학적 처리를 통해 특정 염기에서 DNA를 절단한 후, 겔 전기 영동법과 자동 방사법을 이용하여 염기 서열을 분석하는 방식으로 진행된다. 이 기술은 메틸화 간섭 분석법 개발에도 영향을 미쳤다.
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| 맥삼-길버트 염기 서열 분석법 | |
|---|---|
| 맥삼-길버트 염기 서열 분석법 | |
| 유형 | |
| 방법 | DNA 염기 서열 결정 |
| 개발자 | |
| 개발자 | 앨런 맥섬 월터 길버트 |
| 개발 연도 | |
| 개발 연도 | 1976~1977년 |
| 발표 논문 | |
| 논문 | https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.74.2.560 |
| 특징 | |
| 특징 | DNA의 화학적 변형과 후속적인 특정 염기에서의 DNA 사슬 분열에 기반함 |
| 장점 | |
| 장점 | 정제된 DNA를 직접 사용 DNA 복제가 필요 없음 |
| 단점 | |
| 단점 | 기술적으로 복잡하고 유해한 화학 물질 사용 대규모 DNA 서열 분석에는 적합하지 않음 자동화가 어려움 |
| 중요성 | |
| 중요성 | 최초의 DNA 서열 결정 방법 중 하나 생물학 연구에 혁명을 일으킴 |
| 대체 기술 | |
| 대체 기술 | 생어 염기 서열 분석법 |
2. 역사
프레더릭 생어와 앨런 콜슨이 플러스 마이너스 염기 서열 분석에 관한 연구를 발표한 지 2년 후에 맥삼-길버트 염기 서열 분석법이 발표되었다.[10][11][2][3] 정제된 DNA를 직접 사용할 수 있다는 장점 덕분에 맥삼-길버트 염기 서열 분석법은 빠르게 인기를 얻었다. 초기 생어법에서는 단일 가닥 DNA 생산을 위해 각 읽기 시작을 분자 클로닝해야 했다.[12][4] 그러나 체인 터미네이션 방법이 개선되면서 맥삼-길버트 염기 서열 분석법은 기술적 복잡성과 유해 화학 물질 사용, 규모 확장의 어려움 때문에 점차 사용 빈도가 줄어들었다.[12][4]
앨런 맥삼과 월터 길버트의 1977년 논문 "DNA 염기 서열 분석을 위한 새로운 방법"은 2017년 미국 화학 학회 화학사 분과에서 화학 혁신상 인용으로 선정되어 하버드 대학교 분자 및 세포 생물학과에 수여되었다.[5]
2. 1. 개발 배경
1970년대 초, DNA 염기서열 분석은 매우 어려운 과제였다. 프레더릭 생어와 앨런 콜슨은 플러스 마이너스 염기 서열 분석에 관한 연구를 진행하였고,[10][11] 이를 바탕으로 앨런 맥삼과 월터 길버트는 1977년 DNA 염기 서열 분석을 위한 새로운 방법을 발표하였다.[5] 맥삼-길버트 염기 서열 분석법은 정제된 DNA를 직접 사용할 수 있었기 때문에 빠르게 인기를 얻었다.[12][2] 그러나 체인 터미네이션 방법이 개선됨에 따라 맥삼-길버트 염기 서열 분석법은 기술적 복잡성, 유해 화학 물질 사용, 스케일 업의 어려움 때문에 선호되지 않게 되었다.[12][4]2. 2. 초기 발전과 한계
프레더릭 생어와 앨런 콜슨이 플러스 마이너스 염기 서열 분석에 관한 연구를 발표한 지 2년 후인 1977년, 앨런 맥삼과 월터 길버트는 DNA 염기 서열 분석법을 발표했다.[10][11][2][3] 맥삼-길버트 염기서열 분석법은 정제된 DNA를 직접 사용할 수 있다는 장점 덕분에 초기 생어법보다 빠르게 인기를 얻었다. 초기 생어법은 각 읽기 시작 지점을 분자 클로닝하여 단일 가닥 DNA를 생산해야 했다.[4]하지만, 맥삼-길버트 염기서열 분석법은 기술적으로 복잡하고, 유해한 화학 물질을 다량 사용해야 하며, 대규모 염기서열 분석에 적용하기 어렵다는 단점이 있어 체인 터미네이션 방법이 개선되면서 선호되지 않게 되었다.[12][4]
앨런 맥삼과 월터 길버트의 1977년 논문 "DNA 염기 서열 분석을 위한 새로운 방법"은 2017년 미국 화학 학회 화학사 분과에서 화학 혁신상 인용으로 선정되었으며, 이 상은 하버드 대학교 분자 및 세포 생물학과에 수여되었다.[5]
2. 3. 생어법과의 경쟁 및 현재
프레더릭 생어와 앨런 콜슨이 플러스 마이너스 염기 서열 분석에 관한 연구를 발표한 지 2년 후에 맥삼-길버트 염기 서열 분석법이 발표되었다.[10][11] 정제된 DNA를 직접 사용할 수 있다는 장점 덕분에 맥삼-길버트 염기 서열 분석법은 빠르게 인기를 얻었다. 초기 생어법에서는 단일 가닥 DNA 생산을 위해 각 읽기 시작을 분자 클로닝해야 했다.[12] 그러나 사슬 종결 방법, 즉 생어법이 개선되면서 맥삼-길버트 염기서열 분석법은 기술적 복잡성과 유해 화학 물질 사용, 규모 확장의 어려움 때문에 점차 사용 빈도가 줄어들었다.[12][4]앨런 맥삼과 월터 길버트의 1977년 논문 "DNA 염기 서열 분석을 위한 새로운 방법"은 2017년 미국 화학 학회 화학사 분과에서 화학 혁신상 인용으로 선정되어 하버드 대학교 분자 및 세포 생물학과에 수여되었다.[5] 현재는 특수한 경우를 제외하고 대부분 생어 염기서열 분석법이나 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술을 사용한다.
3. 순서
맥삼-길버트 염기 서열 분석법은 DNA 단편의 5' 말단 하나에 방사성 탐침이 필요하며 DNA 정제가 필요하다. 화학적 처리는 네 가지 반응(G, A + G, C, C + T) 각각에서 네 가지 뉴클레오타이드 염기 중 하나 또는 두 개의 작은 비율에서 파손을 생성한다. 예를 들어, 퓨린(A + G)은 폼산을 사용하여 정화되고, 구아닌 (또는 소량의 아데닌)은 황산 다이메틸에 의해 메틸화되며 피리미딘(C + T)은 하이드라진을 사용하여 가수분해한다. 하이드라진 반응에 염(염화 나트륨)을 첨가하면 C 단독 반응에 대한 티민의 반응이 억제된다. 변형된 DNA는 피페리딘에 의해 절단될 수 있다. 변형 화학 물질의 농도는 DNA 분자 당 평균 하나의 변형을 도입하도록 제어된다. 따라서 일련의 표지된 단편이 방사성 표지된 말단에서 각 분자의 첫 번째 절단부위까지 생성된다.
네 가지 반응의 단편은 크기 분리를 위해 변성 아크릴아미드 겔에서 나란히 전기 영동된다. 조각을 시각화하기 위해 젤을 엑스선 필름에 노출시켜 자동 방사법 촬영을 하여 동일한 방사성 표지 DNA 분자의 위치를 각각 보여주는 일련의 어두운 밴드를 생성한다. 특정 단편의 존재 및 부재로부터 서열이 유추될 수 있다.[13][14]
맥삼-길버트 염기 서열 분석법은 염기 서열 분석할 DNA 단편의 한쪽 5′ 말단에 방사성 동위원소 표지를 해야 한다. (일반적으로 키나아제 반응을 통해 감마-32P ATP 사용) 그리고 DNA를 정제해야 한다. 화학적 처리를 통해 네 가지 반응(G, A+G, C, C+T) 각각에서 네 가지 뉴클레오타이드 염기 중 하나 또는 두 개의 소량 부분에 절단이 생성된다. 예를 들어, 퓨린(A+G)은 개미산을 사용하여 탈퓨린화되고, 구아닌(및 어느 정도는 아데닌)은 황산 다이메틸에 의해 메틸화되며, 피리미딘(C+T)은 히드라진을 사용하여 가수분해된다. 히드라진 반응에 소금(염화 나트륨)을 첨가하면 C-전용 반응에서 티민의 반응이 억제된다. 그런 다음 변형된 DNA는 변형된 염기의 위치에서 뜨거운 피페리딘; (CH2)5NH에 의해 절단될 수 있다. 변형 화학 물질의 농도는 DNA 분자당 평균 하나의 변형이 일어나도록 조절된다. 따라서 방사성 동위원소로 표지된 말단에서 각 분자의 첫 번째 "절단" 부위까지 일련의 표지된 단편이 생성된다.
네 가지 반응의 단편은 크기 분리를 위해 변성 아크릴아마이드 겔에서 나란히 겔 전기영동된다. 단편을 시각화하기 위해 겔을 X선 필름에 노출하여 자동 방사법을 수행하면 각기 동일한 방사성 동위원소로 표지된 DNA 분자의 위치를 나타내는 일련의 어두운 밴드가 생성된다. 특정 단편의 존재와 부재로부터 서열을 추론할 수 있다.
3. 1. 방사성 동위원소 표지 및 DNA 정제
맥삼-길버트 염기 서열 분석법은 분석할 DNA 단편의 5' 말단에 방사성 동위원소 표지를 하는 것으로 시작한다. 일반적으로 키나아제 반응을 통해 감마-32P ATP를 사용한다.[13][14] 이후, 분석에 사용할 DNA를 정제한다.3. 2. 화학적 처리 및 절단
맥삼-길버트 염기 서열 분석법은 우선 DNA 단편의 5' 말단에 감마-32P ATP를 사용하여 방사성 동위원소 표지를 하고 DNA를 정제해야 한다.[13][14]정제된 DNA는 네 가지 다른 화학 반응을 거친다. 각 반응은 특정 염기(구아닌(G), 아데닌+구아닌(A+G), 시토신(C), 시토신+티민(C+T))를 선택적으로 변형시킨다. 퓨린(A+G)은 개미산을 사용하여 탈퓨린화되고, 구아닌(및 어느 정도는 아데닌)은 황산 다이메틸에 의해 메틸화되며, 피리미딘(C+T)은 히드라진을 사용하여 가수분해된다. 히드라진 반응에 염화 나트륨을 첨가하면 C 단독 반응에 대한 티민의 반응이 억제된다.[13][14]
변형된 DNA는 뜨거운 피페리딘; (CH2)5NH에 의해 절단될 수 있다. 각 반응에서 화학 물질의 농도는 DNA 분자당 평균 하나의 변형이 일어나도록 조절된다. 따라서 일련의 표지된 단편이 방사성 표지된 말단에서 각 분자의 첫 번째 절단부위까지 생성된다.[13][14]
3. 3. 겔 전기영동 및 자동 방사법
맥삼-길버트 염기 서열 분석법에서 네 가지 반응을 통해 생성된 다양한 길이의 DNA 단편들은 변성 아크릴아마이드 겔에서 전기 영동을 통해 크기별로 분리된다.[13][14] 겔을 X선 필름에 노출시켜 자동 방사법을 수행하면, 방사성 동위원소로 표지된 DNA 단편들의 위치가 어두운 밴드로 나타난다.[13][14] 이 밴드 패턴을 분석하여 DNA 염기서열을 추론할 수 있다.4. 관련 방법
맥삼-길버트 염기 서열 분석법은 DNA 결합 단백질에 대한 DNA 결합 부위를 매핑하는 데 사용되는 메틸화 간섭 분석법으로 이어졌다.[15][7]
1994년에는 자동화된 맥삼-길버트 염기 서열 분석 프로토콜이 개발되었다.[8]
4. 1. 메틸화 간섭 분석법
맥삼-길버트 염기서열 분석법은 DNA 결합 단백질에 대한 DNA 결합 부위를 찾는 데 사용되는 메틸화 간섭 분석법 개발에 영향을 주었다.[15][7]5. 같이 보기
참조
[1]
논문
A new method for sequencing DNA
1977-02
[2]
논문
A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase
1975-05
[3]
간행물
Determination of nucleotide sequences in DNA
http://nobelprize.or[...]
1980-12-08
[4]
서적
Handbook of comparative genomics: principles and methodology
https://books.google[...]
Wiley-Liss
[5]
웹사이트
Citations for Chemical Breakthrough Awards 2017 Awardees
http://www.scs.illin[...]
2018-03-12
[6]
웹사이트
Cold Spring Harbor Protocols - Chemical Sequencing
http://cshprotocols.[...]
[7]
웹사이트
Cold Spring Harbor Protocols - Methylation Interference Assay
http://cshprotocols.[...]
[8]
논문
Automation of the Maxam-Gilbert chemical sequencing reactions.
1994-06
[9]
논문
A new method for sequencing DNA
1977-02
[10]
논문
A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase
1975-05
[11]
간행물
Determination of nucleotide sequences in DNA
http://nobelprize.or[...]
1980-12-08
[12]
서적
Handbook of comparative genomics: principles and methodology
https://books.google[...]
Wiley-Liss
[13]
논문
A new method for sequencing DNA
1977-02
[14]
웹인용
Cold Spring Harbor Protocols - Chemical Sequencing
http://cshprotocols.[...]
[15]
웹인용
Cold Spring Harbor Protocols - Methylation Interference Assay
http://cshprotocols.[...]
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