플라스미드

3. 특성

플라스미드는 염색체와는 별개로 존재하며 자율적으로 증식하는 유전자로, 세포 내에서 다음 세대로 안정하게 유지 및 전달된다. 플라스미드는 복제 개시점을 가지고 있어 세포 내에서 독립적으로 복제될 수 있으며, 이러한 자기 복제 단위를 레플리콘이라고 부른다.^[17] 전형적인 세균 레플리콘은 플라스미드 특이적 복제 개시 단백질(Rep) 유전자, 이터론이라고 불리는 반복 단위, DnaA 박스, 인접한 AT가 풍부한 영역과 같은 여러 요소로 구성될 수 있다.^[17]

플라스미드의 크기는 1 킬로베이스 쌍(kbp) 미만의 매우 작은 것부터 수백만 염기쌍(Mbp)의 매우 큰 것까지 다양하다. 플라스미드는 일반적으로 원형이지만, 선형 플라스미드도 존재한다.^[17]

플라스미드는 개별 세포에 하나에서 수백 개까지 다양한 수로 존재할 수 있으며, 이를 플라스미드 복제수라고 한다. 복제수는 플라스미드의 크기와 복제 조절 방식에 따라 결정된다. 일반적으로 큰 플라스미드는 복제수가 낮은 경향이 있다.^[14] 낮은 복제수를 가진 플라스미드는 세포 분열 시 손실될 위험이 있으므로, parABS 시스템 및 parMRC 시스템과 같은 플라스미드 분리 시스템을 통해 두 개의 딸 세포에 복사본을 안정적으로 분배한다.^[18]

4. 종류 및 분류

플라스미드는 여러 가지 방식으로 분류될 수 있다. 크게 접합 플라스미드와 비접합 플라스미드로 나눌 수 있다. 접합 플라스미드는 세균 접합을 촉진하는 전이 유전자를 가지고 있어, 성적 필리를 통해 다른 세균으로 전이될 수 있다.^[14][20] 비접합 플라스미드는 스스로 접합을 시작할 수 없어, 접합 플라스미드의 도움을 받아야만 전이된다.^[21]

플라스미드는 상용성 그룹(incompatibility group)으로도 분류된다. 미생물은 여러 종류의 플라스미드를 가질 수 있지만, 서로 다른 플라스미드가 한 세포에 존재하려면 호환성이 있어야 한다. 호환되지 않는 두 플라스미드 중 하나는 세포에서 빠르게 소실된다. 호환되지 않는 플라스미드는 같은 복제 또는 분할 메커니즘을 공유하기 때문에, 단일 세포에서 함께 유지될 수 없다.^[22][23]

기능에 따른 분류는 다음과 같다:

플라스미드는 하나 이상의 기능 그룹에 속할 수 있다.

대부분 플라스미드는 이중 가닥 DNA 분자이지만, 일부는 단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 RNA로 구성된다. RNA 플라스미드는 비감염성 세포 외 선형 RNA 복제자로, 균류와 다양한 식물에서 발견된다. 그러나 RNA 플라스미드와 RNA 바이러스 등을 명확히 구분하기는 어렵다.^[30]

크로미드는 염색체와 플라스미드의 경계에 있는 요소로, 일부 박테리아 종에서 발견된다. 이들은 핵심 유전자를 가지며 염색체와 유사한 코돈 사용을 보이지만, 플라스미드형 복제 메커니즘을 사용한다.^[31]

5. 형태

플라스미드는 다양한 형태로 나타날 수 있다.

• 열린 원형(nicked open-circular) : DNA가 원형으로 존재하나 한 가닥에 틈(Nick)이 존재한다.
• 안정된 원형(relaxed circular) : DNA 이중나선이 틈 없이 원형으로 존재하며, 효소에 의해 안정된 상태를 유지한다.
• 선형(linear)
• 초나선 또는 닫힌 원형(supercoiled, or closed-circular) : DNA 가닥이 꼬여 가장 뭉친 상태로 존재한다.
• 변성된 초나선(supercoiled denatured) : 초나선 형태를 이루나 변성된 부분이 있어 초나선에 비해 덜 밀집된 형태이다.

• ''니크 개방형 고리'' DNA는 한 가닥이 절단되어 있다.
• ''이완된 고리형'' DNA는 두 가닥 모두 절단되지 않은 완전한 상태이지만, 효소적으로 ''이완''되어(초코일 제거)있다. 이는 꼬인 연장 코드를 풀고 이완시킨 다음 자체적으로 연결하는 것으로 모델링할 수 있다.
• ''선형'' DNA는 양쪽 가닥이 절단되었거나 DNA가 ''생체 내''에서 선형이기 때문에 자유 말단을 가지고 있다. 이는 자체적으로 연결되지 않은 전기 연장 코드로 모델링할 수 있다.
• ''초코일'' (또는 ''공유 결합 폐쇄 고리형'') DNA는 두 가닥 모두 절단되지 않은 완전한 상태이며, 통합된 꼬임이 있어 콤팩트한 형태를 갖는다. 이는 연장 코드를 꼬고 자체적으로 연결하는 것으로 모델링할 수 있다.
• ''초코일 변성'' DNA는 ''초코일 DNA''와 유사하지만, 페어링되지 않은 영역이 있어 약간 덜 콤팩트하다. 이는 플라스미드 준비 과정에서 과도한 알칼리성으로 인해 발생할 수 있다.

6. 플라스미드 유지

일부 플라스미드는 안정적인 유지를 위해 중독 모듈 (addiction module) 또는 분리 후 살상 시스템 (postsegregational killing system, PSK)을 갖춘다.^[101] 예를 들어, 대장균의 플라스미드 R1에는 hok/sok (숙주 살해/살해 억제) 시스템이 있다.^[101] 이 시스템은 수명이 긴 독과 수명이 짧은 해독제를 모두 생성한다. 플라스미드를 유지하는 딸 세포는 생존하지만, 플라스미드를 상속받지 못한 딸 세포는 모세포에서 남은 독으로 인해 죽거나 성장률이 저하된다. 여러 유형의 플라스미드 중독 시스템 (독소/해독소, 대사 기반, ORT 시스템)이 문헌에 기술되었으며,^[102] 생명공학 (발효) 또는 생물의학 (백신 치료) 분야에 응용된다.

생명공학에 사용되는 플라스미드는 독소-항독소 중독 시스템을 거의 포함하지 않으므로, 플라스미드 손실을 방지하기 위해 항생제 압력 하에 유지해야 한다.

7. 응용

플라스미드는 유전공학에서 다양한 목적으로 활용된다. 플라스미드의 주요 용도 중 하나는 단백질을 대량으로 만드는 것이다. 연구자들은 관심 유전자를 포함하는 플라스미드를 가진 박테리아를 배양하여, 박테리아가 항생제 내성을 부여하는 단백질을 생성하는 것처럼 삽입된 유전자로부터 대량의 단백질을 생산하도록 유도할 수 있다. 이는 인슐린과 같이 필요한 단백질을 대량 생산하는 저렴하고 쉬운 방법이다.

7. 1. 벡터 (Vector)

7. 2. 클로닝 (Cloning)

7. 3. 단백질 생산 (Protein Production)

7. 4. 유전자 치료 (Gene Therapy)

7. 5. 질병 모델 (Disease Models)

7. 6. 생합성 유전자 클러스터(BGC, Biosynthetic Gene Cluster)

8. 플라스미드 DNA 추출

플라스미드는 특정 염기 서열을 정제하는 데 자주 이용되는데, 이는 플라스미드가 나머지 게놈에서 쉽게 정제될 수 있기 때문이다. 플라스미드는 분자 클로닝 및 벡터로 사용하기 위해 분리해야 하는 경우가 많다.

세균으로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 방법에는 플라스미드 추출 키트(미니프렙에서 맥시프렙 또는 벌크프렙)를 사용하거나, 알칼리 용해, 효소 용해, 기계적 용해를 사용하는 등 여러 가지 방법이 있다.^[103] 미니프렙은 여러 세균 클론에서 플라스미드가 올바른지 빠르게 확인하는 데 사용될 수 있다. 얻을 수 있는 것은 소량의 불순한 플라스미드 DNA로, 제한 효소 절단을 이용한 분석 및 일부 클로닝 기술에 충분하다.

맥시프렙은 훨씬 더 많은 양의 세균 현탁액을 배양하여 수행할 수 있다. 본질적으로 이는 확장된 미니프렙에 추가 정제를 거치는 것이다. 이를 통해 비교적 많은 양()의 매우 순수한 플라스미드 DNA를 얻을 수 있다.

다양한 규모, 순도 및 자동화 수준으로 플라스미드 추출을 수행하기 위해 많은 상업용 키트가 개발되었다.

9. 생물정보학 (Bioinformatics)

분자 생물학 기법으로서 플라스미드 사용은 여러 생물정보학 소프트웨어에 의해 지원된다. 이러한 프로그램들은 플라스미드 벡터의 DNA 서열을 기록하고, 제한 효소의 절단 부위를 예측하며, 조작을 계획하는 데 도움을 준다. 플라스미드 맵을 처리하는 소프트웨어 패키지 예시로는 ApE, Clone Manager, GeneConstructionKit, Geneious, Genome Compiler, LabGenius, Lasergene, MacVector, pDraw32, Serial Cloner, UGENE, VectorFriends, Vector NTI, WebDSV 등이 있다. 이러한 소프트웨어들은 습식 실험을 수행하기 전에 전체 실험을 컴퓨터 시뮬레이션으로 수행하는 데 도움을 준다.^[62]

수많은 플라스미드가 수년에 걸쳐 만들어졌으며 연구자들은 Addgene(https://www.addgene.org), BCCM/GeneCorner(https://bccm.belspo.be/about-GeneCorner)와 같은 플라스미드 데이터베이스에 플라스미드를 제공해 왔다. 연구 목적으로 해당 데이터베이스에서 플라스미드를 찾고 요청할 수 있다.

연구자들은 또한 종종 플라스미드 서열을 NCBI 데이터베이스(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)에 업로드하며, 여기서 특정 플라스미드의 서열을 검색할 수 있다.

10. 에피솜 (Episome)

에피솜이라는 용어는 1958년 프랑수아 자코브와 엘리 볼만이 자율적으로 복제되거나 염색체에 통합될 수 있는 염색체 외 유전 물질을 지칭하기 위해 도입하였다.^[49][50] 그러나 이 용어가 도입된 이후, 자율적으로 복제되는 염색체 외 DNA에 대해서는 플라스미드가 더 선호되는 용어가 되면서 그 사용법이 바뀌었다. 1968년 런던에서 열린 심포지엄에서 일부 참가자들은 에피솜이라는 용어를 폐기할 것을 제안했지만, 다른 참가자들은 그 의미를 변경하여 이 용어를 계속 사용했다.^[51][52]

오늘날 일부 학자들은 세균에서 염색체에 통합될 수 있는 플라스미드를 지칭하는 맥락에서 에피솜이라는 용어를 사용한다.^[53] 통합 플라스미드는 여러 세대에 걸쳐 세포 내에서 복제되고 안정적으로 유지될 수 있지만, 어떤 단계에서는 독립적인 플라스미드 분자로 존재하게 된다. 진핵생물에서 에피솜이라는 용어는 핵에서 복제될 수 있는 비통합 염색체 외 닫힌 원형 DNA 분자를 의미한다.^[54][55] 이러한 예시 중 가장 흔한 것은 헤르페스바이러스, 아데노바이러스, 폴리오마바이러스를 포함한 바이러스이지만, 일부는 플라스미드이다. 다른 예로는 인위적인 유전자 증폭이나 병리학적 과정(예: 암세포 변환) 동안 발생할 수 있는 이중 분체 염색체와 같은 비정상적인 염색체 조각이 있다. 진핵생물의 에피솜은 DNA가 안정적으로 유지되고 숙주 세포와 함께 복제된다는 점에서 세균의 플라스미드와 유사하게 작동한다. 폭스바이러스 감염과 같이 세포질 바이러스 에피솜도 발생할 수 있다. 헤르페스바이러스와 같은 일부 에피솜은 세균 파지와 유사한 회전 원형 메커니즘으로 복제된다. 다른 에피솜은 양방향 복제 메커니즘(''세타 타입'' 플라스미드)을 통해 복제된다. 어떤 경우든 에피솜은 숙주 세포 염색체와 물리적으로 분리되어 있다. 엡스타인-바 바이러스와 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스를 포함한 여러 암 바이러스는 암세포에서 잠복 상태로 유지되며, 염색체와 구별되는 에피솜으로 유지되면서 암세포 증식을 촉진하는 종양 유전자를 발현한다. 암에서 이러한 에피솜은 세포가 분열할 때 숙주 염색체와 함께 수동적으로 복제된다. 이러한 바이러스 에피솜이 다수의 바이러스 입자를 생성하기 위해 용균성 주기를 시작하면 일반적으로 숙주 세포를 죽이는 세포 내 선천 면역 방어 메커니즘을 활성화한다.

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