차세대 염기서열 분석

3. 실험 과정

차세대 염기서열 분석 (NGS) 실험은 크게 다음과 같은 과정으로 이루어진다.

1. '''DNA 분절화''': 온전한 DNA는 길이가 매우 길어(약 2미터^[46]) 시퀀서로 직접 분석할 수 없다. 따라서 시퀀서가 인식 가능한 크기로 DNA를 자르는 과정이 필요하다. 이 과정은 물리적 방법(초음파 사용) 또는 효소적 방법(제한 효소 사용)을 통해 이루어진다.

2. '''말단 수리''': 분절된 DNA는 끝부분이 불완전한 경우가 많다. DNA 중합효소를 이용하여 양쪽 끝을 완전한 이중나선 형태로 만든다.

3. '''어댑터 부착''': 시퀀서가 DNA 조각을 인식하고 결합할 수 있도록 특수한 염기서열(어댑터)을 붙인다. 이 어댑터에는 샘플을 구별하는 바코드 정보도 포함될 수 있다.

4. '''라이브러리 제작''': 어댑터가 부착된 DNA 조각들을 라이브러리라고 부른다.

5. '''시퀀싱''': 라이브러리의 어댑터 부위를 이용하여 시퀀서 상에서 대규모 복제를 수행하고, 복제 과정에서 염기가 결합되는 순서를 관측한다. 이때 형광 물질이나 전압 차이를 이용해 염기 서열을 판독한다.

NGS 반응을 위한 템플릿을 준비하는 방법에는 단일 DNA 분자에서 유래된 증폭된 템플릿과 단일 DNA 분자 템플릿을 사용하는 두 가지 방법이 있다. 단일 형광 이벤트를 감지할 수 없는 이미징 시스템의 경우, DNA 템플릿 증폭이 필요한데, 에멀젼 PCR (emPCR), 롤링 서클, 고상 증폭 등이 사용된다.

합성 기반 시퀀싱(SBS)은 DNA 중합효소에 의한 뉴클레오티드 삽입을 감지하여 DNA 샘플의 염기서열을 결정한다. 1993년에 처음 기술되었고,^[1] 이후 개선되었다.^[30] SBS는 DNA 증폭, 단일 가닥 DNA 생성, 개량된 중합효소를 사용한 뉴클레오티드 삽입 및 감지 등의 단계를 거치며, 이 원리는 454, PacBio, 이온 토렌트, 일루미나, MGI 등 대부분의 대규모 병렬 시퀀싱 기기에 사용된다.

3. 1. DNA 분절화 (Fragmentation)

• 물리적 방법: DNA가 담긴 샘플 튜브에 물과 같은 매질을 통해 초음파 진동을 가하여 DNA를 분절한다. 에너지 세기와 노출 시간을 조절하여 원하는 길이의 DNA 조각을 만들 수 있다.
• 효소적 방법: 제한 효소를 사용하여 DNA를 자르는 방법이다. DNA를 자르는 동시에 어댑터(Adapter)를 붙이는 과정이 함께 진행된다. 물리적 방법에 비해 어댑터 부착 단계까지의 여러 과정을 생략할 수 있어 적은 양의 시료로도 가능하다. 하지만, 효소적 방법은 분절 과정이 시간에 큰 영향을 받고, 시료 상태가 좋지 않으면 균일한 DNA 조각을 만들기 어렵다는 단점이 있다.

3. 2. 말단 수리 (End Repair)

3. 3. 어댑터 부착 (Adapter Ligation)

3. 4. 라이브러리 제작 (Library Preparation)

• 물리적 방법: DNA가 담긴 샘플 튜브에 초음파 진동을 가하여 DNA를 분절한다. 에너지 세기와 노출 시간을 조절하여 원하는 길이의 DNA 파편을 만들 수 있다.
• 효소적 방법: 제한 효소를 사용하여 DNA를 자른다. DNA를 자르는 동시에 어댑터를 붙이는 단계가 함께 진행된다. 물리적 방법에 비해 어댑터 부착까지의 여러 과정을 생략할 수 있어 적은 시료로도 가능하다. 그러나 효소적 방법은 분절 과정의 시간에 큰 영향을 받고, 시료 상태가 좋지 않으면 균일한 DNA 파편을 만들기 어렵다.

3. 5. 시퀀싱 (Sequencing)

4. 분석 방법

차세대 염기서열 분석(NGS)은 기존의 염기서열 분석 방법에 비해 훨씬 빠르고 저렴하게 대량의 DNA 염기서열 정보를 얻을 수 있는 기술이다. NGS는 다양한 분석 방법을 통해 구현되는데, 대표적인 방법들은 다음과 같다.

• 파이로시퀀싱 (Pyrosequencing): 1996년 팔 뉘렌(Pål Nyrén)이 제안한 방법으로, 염기서열이 추가될 때마다 발생하는 빛을 감지하여 염기서열을 분석한다. 로슈 454 시스템에 적용되었다.^[47] DNA 조각을 기름방울 안에 넣어 증폭시킨 후, 각 염기에 따라 다른 색깔의 빛을 내는 원리를 이용한다. 1993년에 처음 기술되었으며,^[1] DNA 증폭, 단일 가닥 DNA 생성, 조작된 중합효소를 사용한 뉴클레오티드 삽입, 실시간 빛 감지를 통한 뉴클레오티드 검출 등의 핵심 개념을 포함한다. 1998년에는 비삽입 뉴클레오티드를 제거하는 효소(아피라제)를 사용하여 세척 없이 염기서열 분석을 수행할 수 있게 되었다.^[30]

• 가역적 염료 터미네이터 시퀀싱 (Reversible Dye Terminator Sequencing): DNA를 유리판에 부착된 프라이머로부터 증폭시켜 DNA 라이브러리 복제본 집락을 형성하고, 형광 염료로 표지된 염기를 이용하여 분석하는 방법이다. 많은 양의 데이터를 얻을 수 있고 오류가 적지만, 분석 가능한 서열의 길이가 짧다는 단점이 있다. 뉴클레오티드 주입, 형광 이미징, 절단의 순환 방식을 사용하며,^[31][32][33] 각 dNTP가 추가될 때 형광 표지된 종결제가 이미징된 후 절단되어 다음 염기가 주입될 수 있도록 한다. Solexa 및 일루미나 기기의 기초가 되었다. Helicos BioSciences는 "가상 종결제"라는 차단되지 않은 종결제를 사용하여 DNA 합성이 단일 염기 부가 후 종료되도록 했다.^[22][34][35]

• 라이게이션 기반 시퀀싱 (Sequencing by Ligation): DNA 연결효소와 염기로 암호화된 프로브를 사용하여 서열을 연장하는 방식이다. 형광 표지된 프로브가 프라이밍된 주형에 인접한 상보적인 서열에 혼성화되면, DNA 연결효소가 첨가되어 염료 표지된 프로브를 프라이머에 연결한다. 연결되지 않은 프로브는 씻어내고, 연결된 프로브는 형광 영상을 통해 확인한다.

• 실시간 시퀀싱 (Real-time Sequencing): 퍼시픽 바이오사이언스(Pacific Biosciences)에서 개발한 방법으로, DNA 합성이 진행되는 동안 염료 표지된 뉴클레오티드의 삽입을 실시간으로 관찰하여 염기서열을 분석한다.^[1][30] 단일 DNA 중합효소 분자가 제로 모드 도파관 검출기(Zmw 검출기) 바닥 표면에 부착되어 서열 정보를 얻는다. 퍼시픽 바이오사이언스는 독특한 DNA 중합효소를 사용하여 단일 리드 정확도가 87%이지만, 다중 킬로베이스 리드 길이에서 컨센서스 정확도가 99.999%에 이른다.^[37][38] 2015년에는 시퀀스 처리량을 약 6.5배 증가시킨 시퀄 시스템(Sequel System)을 출시했다.^[39][40]

4. 1. 파이로시퀀싱 (Pyrosequencing)

4. 2. 가역적 염료 터미네이터 시퀀싱 (Reversible Dye Terminator Sequencing)

4. 3. 라이게이션 기반 시퀀싱 (Sequencing by Ligation)

4. 4. 실시간 시퀀싱 (Real-time Sequencing)

5. 데이터 분석

질적 정량기준을 통과한 데이터는 이후 유전체를 재조립하는 과정에 부품으로서 사용된다. 이미 제작되어 있는 참조 유전체 상에 read들을 퍼즐처럼 조합시키는 과정이 진행되며, 이를 정렬 또는 매핑이라 한다. 학계에 발표된 참조 유전체가 존재하지 않는 경우 read간의 연결을 통하여 유전체를 조합하는 방법이 있는데, 이는 ''de-novo'' sequencing이라 하며 주로 발굴된 고생물 시료 및 신생물종 연구에서 활용된다. 생성된 유전체는 이후 유전자의 위치, 유전 변이 확인 및 위험성 평가 등을 측정하는 Annotation 과정을 거친다.^[54]

5. 1. Read 생성

5. 2. Fastq 파일 생성

5. 3. 참조 유전체 매핑 (Reference Genome Mapping)

5. 4. ''De-novo'' 시퀀싱

참조

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_[54] 저널 Challenges and opportunities in understanding microbial communities with metagenome assembly (accompanied by IPython Notebook tutorial).