상보적 DNA
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1. 개요
상보적 DNA(cDNA)는 전령 RNA(mRNA)를 주형으로 하여 역전사효소를 통해 합성된 DNA이다. cDNA는 유전자 클로닝, 유전자 탐침, cDNA 라이브러리 제작에 사용되며, 유전자 발현 연구에도 활용된다. 2013년 미국 대법원은 자연 발생 유전자는 특허를 받을 수 없지만, cDNA는 자연적으로 발생하지 않으므로 특허가 가능하다는 판결을 내렸다.
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- DNA - 미토콘드리아 DNA
미토콘드리아 DNA(mtDNA)는 세포 호흡에 필수적인 유전 정보를 담고 있는 미토콘드리아 내의 이중 가닥 환상 DNA로서, 동물의 경우 약 16,000개의 염기쌍과 37개의 유전자로 구성되며, 모계 유전, 높은 돌연변이율, 질병 및 노화와의 연관성 등의 특징을 가진다. - DNA - 이중 나선
이중 나선은 DNA의 구조로서, 두 개의 폴리뉴클레오티드 사슬이 반대 방향으로 배열되어 오른손잡이 나선 구조를 이루며, 상보적인 염기쌍이 수소 결합으로 연결되고 주구와 부구라는 고랑을 가지며 다양한 형태가 존재한다.
| 상보적 DNA | |
|---|---|
| 분자 생물학 | |
| 유형 | DNA |
| 설명 | RNA의 역전사로 생성된 DNA |
| 관련 항목 | 역전사 효소 mRNA 유전자 라이브러리 |
2. 합성
cDNA는 주로 전사 후 처리가 완료된 mRNA를 주형으로 하여 역전사 효소를 이용해 합성된다. 역전사 효소는 단일 가닥 mRNA의 아데닌, 유라실, 구아닌, 사이토신에 각각 티민, 아데닌, 사이토신, 구아닌을 짝지어 상보적 DNA를 합성한다.[3]
cDNA 합성은 (1) 전체 RNA (리보솜 RNA, mRNA 포함), 또는 (2) polyA-RNA (mRNA)를 주형으로 하는 방법이 있다. 역전사 효소의 반응 개시에는, RNA 위에 반응 시작점이 되는 프라이머를 어닐링시켜, 3'에서 5' 방향으로 cDNA를 합성해야 한다.
cDNA 합성에 사용되는 역전사 효소로는 AMV(닭 골수모세포증 바이러스) 또는 MoMuLV(몰로니 마우스 백혈병 바이러스) 유래의 효소가 많이 사용된다. 이전에는 AMV 유래 효소가 열 안정성이 높아 mRNA의 고차 구조를 피하는 방법으로 사용되었지만, 최근에는 MoMuLV 유래 효소의 개량으로 열 안정성이 높은 변이형 효소가 많이 이용된다. 또한, 일부 내열성 DNA 중합 효소(PCR에 사용되는)는 RNA를 주형으로 DNA를 합성하는 역전사 효소 활성을 갖는 경우도 있어, 이를 이용하기도 한다.
2. 1. RNA 정제
RNA는 숙주 세포의 유전체 DNA로부터 전사되며, 먼저 세포를 용해한 다음 페놀-클로로포름, 실리카 칼럼, 비드 기반 RNA 추출 방법과 같은 널리 사용되는 방법을 사용하여 RNA를 추출한다.[5] 추출 방법은 원료에 따라 다르다. 예를 들어, 식물 조직에서 RNA를 추출하려면 페놀 화합물, 탄수화물 및 기타 화합물을 제거하기 위해 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 추가 시약이 필요하다. 그렇지 않으면 RNA를 사용할 수 없게 된다.[6] DNA와 단백질을 제거하기 위해 DNase 및 Proteinase K와 같은 효소가 분해에 사용된다.[7] RNA 무결성은 구아니디늄 아이소티오시아네이트, 도데실 황산 나트륨(SDS), 페놀 또는 클로로포름과 같은 차오트로픽제를 사용하여 RNase를 비활성화하여 유지된다. 총 RNA는 다른 세포 구성 요소에서 분리된 후 알코올로 침전된다. 특정 응용 분야를 위해 간단하고 신속한 RNA 추출을 위한 다양한 상업용 키트가 있다.[8] 추가적인 비드 기반 방법을 사용하여 크기 또는 고유한 RNA 영역을 기반으로 특정 RNA 하위 유형(예: mRNA 및 microRNA)을 분리할 수 있다.[9][10]2. 2. 역전사
역전사 효소와 정제된 RNA 주형을 사용하여 cDNA의 한 가닥(1차 가닥)을 합성한다. mRNA의 폴리(A) 꼬리에 결합하는 올리고(dT) 프라이머, 무작위 헥사머 프라이머, 또는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 역전사를 개시한다.cDNA 합성은 보통 전사후 처리가 완료된 mRNA와 역전사 효소를 이용하여 이루어진다. 역전사 효소는 단일 가닥 mRNA의 아데닌, 유라실, 구아닌, 사이토신에 각각 티민, 아데닌, 사이토신, 구아닌을 짝지어 상보적 DNA를 합성한다.
RNA는 cDNA 합성을 위한 주형 역할을 한다.[3] 세포 생명체에서 cDNA는 RNA를 표적 게놈 DNA에 통합하기 위해 바이러스와 레트로트랜스포존에 의해 생성된다. 분자 생물학에서 RNA는 게놈 DNA, 단백질 및 기타 세포 구성 요소를 제거한 후 원재료에서 정제되며, cDNA는 ''생체 외'' 역전사 효소를 통해 합성된다.[4]
cDNA 합성은 (1) 전체 RNA (리보솜 RNA, mRNA 포함), 또는 (2) polyA-RNA (mRNA)를 주형으로 하는 방법이 있다. 역전사 효소 반응은 mRNA가 고차 구조를 취했을 경우 신장되지 않으며, 5' 측으로부터 cDNA의 상보 사슬(mRNA와 같은 방향을 한 DNA 사슬)을 만들 때 5' 측에 생기는 헤어핀 구조를 이용하기 때문에 실제 5' 말단이 손실된다. 이러한 문제 해결을 위해 mRNA의 열 변성이나 고온에서의 역전사 반응이 이용된다.
2. 2. 1. 1차 가닥 합성
역전사 효소는 프라이머가 결합된 mRNA 주형으로부터 cDNA를 합성한다. 주로 사용되는 역전사 효소는 Moloney murine leukemia virus (M-MLV) 역전사 효소 또는 조류 골수모세포증 바이러스(AMV) 역전사 효소이다.[11] M-MLV 역전사 효소는 더 긴 RNA의 전사에 적합하도록 RNase H 활성이 감소된 특징을 가지며,[11] AMV 역전사 효소는 강한 2차 구조를 가진 RNA 주형에도 사용할 수 있다.[12]cDNA 합성을 위한 일반적인 과정은 다음과 같다.
# 세포에서 전사 후 변형 과정을 거친 성숙한 mRNA를 추출한다.
# 프라이머로 폴리-T 올리고뉴클레오타이드를 사용해 폴리-A 꼬리에 혼성(hybridization영어)되게 하거나, 무작위로 6개 염기를 배열한 헥사머(hexamer영어) 단일 가닥 DNA를 합성하여 사용한다.
# 역전사 효소와 디옥시리보뉴클레오타이드(A, T, G, C)를 넣어주면 mRNA에 혼성된 상보적 가닥의 DNA가 합성된다.
역전사 효소 반응 개시에는 RNA 위에 반응 시작점이 되는 프라이머를 어닐링시켜 3'에서 5' 방향으로 cDNA를 합성해야 한다. 프라이머의 종류는 다음과 같다.
- 올리고 dT 프라이머: polyA 구조를 표적으로 하여 mRNA의 3' 말단으로부터 선택적으로 cDNA를 만든다.
- 유전자 특이적 프라이머: 알려진 cDNA 서열에 특이적으로 결합한다.
- 랜덤 프라이머: 통상 6~8 염기 길이로, mRNA의 모든 영역에서 cDNA 합성을 시작한다.
cDNA 합성에 사용되는 역전사 효소로는 AMV(닭 골수모세포증 바이러스) 또는 MoMuLV(몰로니 마우스 백혈병 바이러스) 유래의 효소가 많이 사용된다. 최근에는 MoMuLV 유래 효소의 개량으로 열 안정성이 높은 변이형 효소가 많이 이용된다.
2. 2. 2. 2차 가닥 합성
1차 가닥 합성이 완료된 RNA-DNA 혼성체는 여러 2차 가닥 합성 방법을 통해 처리되거나, 이후 분석에 직접 사용될 수 있다.[16][17] 초기 방법인 헤어핀-프라이머 합성은 1차 가닥 cDNA의 3' 말단에서 헤어핀 형성을 통해 2차 가닥 합성을 시작했지만, 무작위적인 프라이밍과 헤어핀 가수분해로 인한 정보 손실이라는 단점이 있었다. 거블러-호프만 방법은 대장균 RNase H를 사용하여 mRNA에 절단을 가하고, 절단된 부분을 대장균 DNA 중합효소 I과 대장균 DNA 연결효소로 채우는 방식이다. 이 방법의 개선된 버전에서는 M-MLV의 낮은 RNase H 활성을 이용하여 mRNA에 절단을 가하고, 2차 가닥 cDNA의 DNA 중합효소 번역 후에 RNase H를 추가하여 남아있는 RNA를 제거한다. 이는 mRNA의 5' 말단에서 서열 정보가 손실되는 것을 방지한다.3. 활용
cDNA는 유전자 클로닝, 유전자 탐침(gene probe), cDNA 라이브러리 구축 등에 활용된다. 과학자들은 한 세포에서 다른 세포로 유전자를 전달하여 새로운 유전 물질을 단백질로 발현시키고자 할 때, 전체 유전자 대신 cDNA를 사용한다. 이는 전체 유전자 DNA에는 인트론처럼 단백질을 암호화하지 않거나 단백질의 암호화 서열을 중단하는 DNA가 포함될 수 있기 때문이다. cDNA의 부분 서열은 종종 발현 서열 태그(EST)로 얻어진다.
2013년 6월 13일, 미국 대법원은 ''분자 병리학 협회 대 마이리아드 제네틱스'' 사건에서 자연 발생 유전자는 특허를 받을 수 없지만, cDNA는 자연적으로 발생하지 않기 때문에 특허를 받을 수 있다고 판결했다.[21]
발현 서열 태그(EST)는 유전자 전사체(RNA)의 일부(보통 5' 말단 또는 3' 말단)에 해당하는 짧은 서열로, 전사체의 "표지"로 사용된다. cDNA 라이브러리에서 임의로 다수의 클론을 선택하고, 간단한 시퀀싱을 통해 길이 500 - 800뉴클레오티드 정도의 서열을 결정한 것이 EST이며, 이를 모아 데이터베이스를 제작하여 이용한다. 특정 유전자의 해석에서 단편적인 서열이 판명된 경우, EST 데이터베이스에서 이에 대응하는 EST를 검색하여, 이를 단서로 단계적으로 RNA 전체의 서열을 얻을 수 있다. 현재는 게놈 프로젝트의 보조 기술(또는 EST 프로젝트)로서 활발히 사용되고 있으며, DNA 마이크로어레이용 프로브로도 사용된다.
3. 1. 유전자 클로닝 및 발현
원핵세포에서 진핵세포 유전자를 발현시키기 위해 cDNA가 사용된다. 원핵세포에는 전사된 RNA에서 인트론을 제거하는 기구가 없으므로 진핵세포의 DNA에서 먼저 인트론을 제거하고 숙주인 원핵세포에 넣어야 한다.[18][19][20]역전사 후 DNA를 증폭시키는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 유전자를 세포 밖에서 복제할 수 있다. cDNA 유전자 양 끝에 결합하는 서열 특이적인 DNA 프라이머를 고안하여 DNA를 증폭시키고, 유전자 양 끝을 뉴클레이스로 잘라 발현 벡터라는 작은 원형 DNA에 삽입한다. 발현 벡터는 세포에서 스스로 복제되고, 숙주의 DNA로 쉽게 합쳐진다. 발현 벡터에는 옮겨진 cDNA의 발현을 유도하기 위하여 강력한 프로모터가 포함되어 있다.[18][19][20]
3. 2. 유전자 발현 연구
cDNA는 RNA-seq, RT-qPCR[18][19][20], 마이크로어레이와 같은 방법을 통해 유전자 발현을 연구하는 데 사용된다. 시퀀싱을 위해 RNA는 시퀀싱 플랫폼 크기 제한으로 인해 단편화되어야 한다. 또한, 2가닥으로 합성된 cDNA는 cDNA 단편이 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 증폭되고 시퀀싱 플로우 셀에 결합될 수 있도록 하는 어댑터와 연결되어야 한다. 유전자 특이적 분석 방법은 일반적으로 형광 측정 및 기타 방법을 통해 cDNA 수준을 정량화하기 위해 마이크로어레이 및 RT-qPCR을 사용한다.SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)는 유전자 전사체(RNA)를 역전사한 cDNA의 일부(10-20bp)를 식별용 염기서열(5-10bp?)을 사이에 두고 직렬로 연결한 것을 DNA 시퀀서로 읽어냄으로써, 많은 전사체의 발현량을 조사할 수 있는 유전자 분석법이다.
4. 바이러스 및 레트로트랜스포존
볼티모어 바이러스 분류 VI군과 VII군에 속하는 바이러스는 유전물질인 RNA를 역전사하여 cDNA를 합성한 후 mRNA로 전사한다.[26] 일부 바이러스는 cDNA를 사용하여 바이러스 RNA를 mRNA(바이러스 RNA → cDNA → mRNA)로 변환하며, mRNA는 숙주 세포를 장악하기 위해 바이러스 단백질을 만드는 데 사용된다.
HIV 감염 주기에서 바이러스 RNA에서 cDNA로의 첫 번째 단계가 나타난다. 여기서 숙주 세포막은 바이러스의 지질 외피에 부착되어 바이러스 게놈 RNA의 두 사본을 가진 바이러스 캡시드가 숙주로 들어갈 수 있게 한다. 그런 다음 cDNA 사본은 샤페론 CypA와 바이러스 캡시드 관련 역전사 효소에 의해 촉진되는 과정인 바이러스 RNA의 역전사를 통해 만들어진다.[22]
cDNA는 또한 진핵생물 게놈에서 레트로트랜스포존에 의해 생성된다. 레트로트랜스포존은 RNA 중간체를 통해 게놈 내에서, 때로는 게놈 간에서 이동하는 이동성 유전자 요소이다. 이 메커니즘은 감염성 입자 생성을 제외하고 바이러스와 공유된다.[23][24]
5. 관련 연구 및 기술
상보적 DNA 관련 연구 및 기술은 다음과 같다.
- '''EST (발현 서열 태그)'''
cDNA 라이브러리에서 임의로 다수의 클론을 선택하고, 간단한 시퀀싱을 통해 길이 500 - 800뉴클레오티드 정도의 서열을 결정한 것이 EST이며, 이를 모아 데이터베이스를 제작하여 이용한다. 게놈 프로젝트의 보조 기술(또는 EST 프로젝트)로서 활발히 사용되고 있으며, DNA 마이크로어레이용 프로브로 사용될 수 있다.
- '''FANTOM (마우스 기능 주석)'''
FANTOM은 이화학연구소의 마우스 게놈 백과사전 프로젝트에서 수집된 완전장 cDNA의 주석(기능 주석)을 수행할 목적으로, 하야시자키 요시히데 박사를 중심으로 2000년에 결성된 국제 연구 컨소시엄이다.[1] 전사체 분석 분야를 중심으로 발전·확대되어 왔으며,[1] 프로젝트의 연구 대상은 게놈의 전사 산물이라는 "요소"의 이해에서, 전사 조절 네트워크라는 "시스템" 즉 "생명체의 시스템"의 이해로, 보다 고차의 계층을 향해 착실하게 진행되고 있다.[1]
- '''DNA 마이크로어레이'''
DNA 마이크로어레이는 유전자 발현 양상을 대량으로 분석하는 데 사용된다.
5. 1. EST (발현 서열 태그)
'''EST'''는 expressed sequence tag의 약자로, 유전자 전사체(RNA)의 일부(보통 5' 말단 또는 3' 말단)에 해당하는 짧은 서열로, 전사체의 "표지"로 사용된다. cDNA 라이브러리에서 임의로 다수의 클론을 선택하고, 간단한 시퀀싱을 통해 길이 500 - 800뉴클레오티드 정도의 서열을 결정한 것이 EST이며, 이를 모아 데이터베이스를 제작하여 이용한다. 묶는 방법으로는 EST 클러스터링이라는 기법이 사용된다. 특정 유전자의 해석에서 단편적인 서열이 판명된 경우, EST 데이터베이스에서 이에 대응하는 EST를 검색하여, 이를 단서로 단계적으로 RNA 전체의 서열을 얻을 수 있다. 현재는 게놈 프로젝트의 보조 기술(또는 EST 프로젝트)로서 활발히 사용되고 있다. 또한 EST는 DNA 마이크로어레이용 프로브로 사용할 수도 있다. 최근에는 처음부터 완전장 cDNA(RNA 전체 길이에 해당하는 cDNA)를 얻어 분석하는 기술도 발전하고 있지만, EST는 여전히 유전자 해석에 있어서 유용한 기술이다.5. 2. FANTOM (마우스 기능 주석)
FANTOM은 이화학연구소의 마우스 게놈 백과사전 프로젝트에서 수집된 완전장 cDNA의 주석(기능 주석)을 수행할 목적으로, 하야시자키 요시히데 박사를 중심으로 2000년에 결성된 국제 연구 컨소시엄이다.[1] 그 역할은 전사체 분석 분야를 중심으로 발전·확대되어 왔다.[1] 또한, 프로젝트의 연구 대상은 게놈의 전사 산물이라는 "요소"의 이해에서, 전사 조절 네트워크라는 "시스템" 즉 "생명체의 시스템"의 이해로, 보다 고차의 계층을 향해 착실하게 진행되고 있다.[1]5. 3. DNA 마이크로어레이
DNA 마이크로어레이는 유전자 발현 양상을 대량으로 분석하는 데 사용된다.참조
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