실시간 중합효소 연쇄 반응
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1. 개요
실시간 중합효소 연쇄 반응(Real-time PCR)은 형광체를 사용하여 유전자 발현 수준을 감지하는 분자 생물학 기술이다. 소량의 RNA에서 유전자 발현을 정량화하기 위해 RNA를 cDNA로 역전사한 후, 형광 물질과 센서가 장착된 열 사이클러를 사용하여 DNA를 증폭하고 각 사이클에서 증폭된 생성물의 양을 측정한다. 이 기술은 유전자 발현 연구, 진단, 미생물학, 식물 병원체 검출, GMO 검출 등 다양한 분야에서 활용되며, 유전자 발현량 측정, 바이러스 정량화, 유전자형 결정, SNP 분석 등 다양한 용도로 사용된다.
실시간 중합효소 연쇄 반응 기술은 유전자 발현을 연구하는 현대적인 방법론이다. 이전에는 mRNA의 양을 측정하기 위해 차등 표시, RNase 보호 분석 및 노던 블롯과 같은 방법이 사용되었다.[4] 노던 블롯은 샘플에서 mRNA 전사체의 양을 시각화하여 유전자의 발현 수준을 추정하는 데 자주 사용되는 방법이다. 이 방법에서는 정제된 RNA를 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, 고체 매트릭스(예: 나일론 막)로 옮긴 다음, 관심 유전자에 상보적인 특정 DNA 또는 RNA 프로브로 탐침한다. 이 기술은 여전히 유전자 발현을 평가하는 데 사용되지만, 비교적 많은 양의 RNA가 필요하며 mRNA 수준에 대한 정성적 또는 반정량적 정보만 제공한다.[4]
실시간 중합효소 연쇄 반응은 지정된 파장 이상의 빛을 조사하고 여기된 형광체에서 방출되는 형광을 감지할 수 있는 기능을 갖춘 열 순환기에서 수행된다. 열 순환기는 시료를 빠르게 가열 및 냉각할 수 있어 핵산과 DNA 중합효소의 물리화학적 특성을 활용한다.
2. 역사적 배경
정량화 방법의 변동으로 인한 추정 오류는 DNA 무결성, 효소 효율 및 기타 여러 요인의 결과일 수 있다. 이러한 이유로 여러 표준화 시스템(종종 정규화 방법이라고 함)이 개발되었다. 일부는 전체 유전자 발현을 정량화하기 위해 개발되었지만, 가장 일반적인 것은 거의 일정한 발현 수준으로 선택된 정규화 유전자라고 하는 다른 유전자와 관련하여 연구 중인 특정 유전자를 정량화하는 것을 목표로 한다. 이러한 유전자는 종종 기본 세포 생존과 관련된 기능이 일반적으로 구성적 유전자 발현을 의미하는 하우스키핑 유전자에서 선택된다.[5][6] 이를 통해 연구자는 관심 유전자의 발현과 선택된 정규화 유전자의 발현의 비율을 보고할 수 있으며, 이를 통해 발현의 절대적 수준을 실제로 알지 못하고도 전자를 비교할 수 있다.
가장 일반적으로 사용되는 정규화 유전자는 튜불린, 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소, 알부민, 사이클로필린, 및 리보솜 RNA를 암호화하는 유전자이다.[4]
3. 실험 과정
PCR 과정은 일반적으로 25~50회 반복되는 일련의 온도 변화로 구성되며, 대개 다음 세 단계로 이루어진다.
단편 크기가 작기 때문에 마지막 단계는 생략되기도 한다. 이때는 효소가 결합 단계와 변성 단계 사이에서 DNA 증폭 산물을 복제할 수 있다. 비특이적 염료를 사용할 때는 프라이머 이량체로 인한 신호를 줄이기 위해 약 80°C에서 짧은 시간 동안 형광을 측정하는 추가 단계를 거치기도 한다. 각 주기에 사용되는 온도와 시간은 DNA 합성에 사용되는 효소, 반응 내 이가 이온 및 dNTP 농도, 프라이머의 결합 온도 등 다양한 요인에 따라 달라진다.[52]
3. 1. 기본 원리
실시간 중합효소 연쇄 반응의 실험 과정은 일반적인 중합효소 연쇄 반응을 따르지만, 증폭된 DNA가 실시간으로 측정된다는 중요한 차이점이 있다. 일반적인 중합효소 연쇄 반응에서는 DNA가 마지막에 관측되는 반면, 실시간 중합효소 연쇄 반응에서는 증폭 과정이 실시간으로 모니터링된다.
실시간 중합효소 연쇄 반응에서는 DNA 증폭을 실시간으로 측정하기 위해 두 가지 방법을 사용한다.
실시간 중합효소 연쇄 반응은 종종 역전사 중합효소 연쇄 반응과 결합되어 세포 또는 조직의 mRNA와 비번역 RNA를 수량화하는 데 사용된다. 모든 유기체의 세포는 유전자 전사체(단일 가닥 RNA)의 교체를 통해 유전자 발현을 조절하는데, 세포 내에서 발현되는 유전자의 양은 샘플에 존재하는 해당 유전자의 RNA 전사체 복사본 수로 측정할 수 있다. 소량의 RNA로부터 유전자 발현을 정확하게 감지하고 정량화하려면 유전자 전사체의 증폭이 필요하다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 DNA를 증폭하는 일반적인 방법이며, RNA 기반 PCR의 경우 RNA 샘플을 먼저 역전사 효소를 사용하여 상보적 DNA(cDNA)로 역전사한다.
실시간 중합효소 연쇄 반응에서는 소량의 DNA를 증폭하기 위해 DNA 주형, 최소 한 쌍의 특정 프라이머, 데옥시리보뉴클레오티드 삼인산, 적절한 완충 용액 및 열 안정성 DNA 중합효소를 사용하여 기존 PCR과 동일한 방법을 사용한다. 여기에 형광체로 표시된 물질을 추가하고, 열 사이클러를 사용하여 특정 파장에서 여기된 후 형광을 측정하여 특정 생성물의 생성 속도를 측정한다.[3] 이를 통해 각 PCR 사이클에서 증폭된 생성물의 생성 속도를 측정할 수 있으며, 생성된 데이터는 컴퓨터 소프트웨어로 분석하여 여러 샘플에서 ''상대적 유전자 발현''(또는 ''mRNA 복사본 수'')을 계산할 수 있다.
정량적 PCR은 샘플에서 DNA의 존재와 양을 결정하기 위해 DNA 검출 및 정량화에도 적용될 수 있다.[3] 이 측정은 각 증폭 사이클 후에 이루어지기 때문에 실시간 PCR (즉각적 또는 동시 PCR)이라고 불린다.
정량적 PCR과 DNA 마이크로어레이는 유전자 발현을 연구하는 현대적인 방법이다. 이전에는 mRNA의 양을 측정하기 위해 차등 표시, RNase 보호 분석 및 노던 블롯과 같은 방법이 사용되었다.[4]
실시간 중합효소 연쇄 반응은 각 시료에 대해 지정된 파장 이상의 빛을 조사하고 여기된 형광체에서 방출되는 형광을 감지할 수 있는 기능을 갖춘 열 순환기에서 수행된다. 열 순환기는 또한 시료를 빠르게 가열 및 냉각할 수 있어 핵산과 DNA 중합효소의 물리화학적 특성을 활용한다.
PCR 과정은 일반적으로 25~50회 반복되는 일련의 온도 변화로 구성된다.
단편의 크기가 작기 때문에 마지막 단계는 일반적으로 생략되는데, 효소가 정렬 단계와 변성 단계 사이의 변화 동안 DNA 증폭 산물을 복제할 수 있기 때문이다. 비특이적 염료를 사용할 때는 프라이머 이량체 존재로 인한 신호를 줄이기 위해, 4단계 PCR을 통해 80 °C의 온도에서 각 사이클에서 몇 초만 지속되는 짧은 온도 단계에서 형광을 측정하기도 한다. 각 사이클에 사용되는 온도와 시간은 사용된 DNA 합성 효소, 반응 내 이가 이온 및 데옥시리보뉴클레오티드 삼인산(dNTP)의 농도, 프라이머의 결합 온도 등 다양한 매개변수에 따라 달라진다.
3. 2. 화학적 분류
(이중 가닥 DNA 결합 염료)DNA 이중 나선에 결합하는 형광 염료를 사용한다. (예: SYBR Green) * 프로브가 필요 없어 저렴하다. * 프라이머 이량체 등 비특이적 DNA도 검출한다. 특이적 검출
(형광 리포터 프로브)형광 표지된 특이적 DNA 탐침(프로브)을 사용한다. (예: TaqMan 프로브) * 특이적 DNA만 검출하여 정확도가 높다. * 프로브 설계 및 합성에 비용과 노력이 필요하다.
