클로닝 벡터
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1. 개요
클로닝 벡터는 분자생물학에서 DNA 단편을 복제하고 증폭하는 데 사용되는 운반체로, 대장균과 같은 숙주 내에서 복제 기점, 클로닝 부위, 선택 표지, 리포터 유전자, 발현 요소 등의 특징을 갖는다. 클로닝 부위는 DNA 단편 삽입 위치이며, 선택 표지는 형질전환된 세포를 선택하는 데 사용된다. 리포터 유전자는 성공적인 클론을 쉽게 식별하도록 돕고, 발현 요소는 유전자 발현에 필요한 프로모터 등을 포함한다. 클로닝 벡터에는 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드, 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 인간 인공 염색체, 바이러스 벡터 등이 있으며, 삽입할 DNA 크기와 클로닝 방법에 따라 적절한 벡터를 선택한다. 클로닝 성공 여부는 청백색 선별법과 같은 스크리닝 방법을 통해 확인할 수 있다.
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| 클로닝 벡터 | |
|---|---|
| 클로닝 벡터 | |
 | |
| 종류 | 플라스미드 파지 코스미드 P1 인공 염색체 (PAC) 인공 염색체 (YAC, BAC, HAC) |
| 크기 | '2000–10,000 염기쌍' |
| 특징 | 복제 원점 제한 효소 부위 선별 마커 |
| 상세 정보 | |
| 정의 | 유전 물질을 세포 내로 운반하는 작은 DNA 분자. |
| 용도 | 유전자 클로닝을 위한 DNA 단편 운반체. |
| 필수 요소 | 복제 원점 다중 클로닝 부위 선택 마커 |
| 복제 원점 | 벡터가 숙주 세포 내에서 자가 복제하는 데 필요한 DNA 서열. |
| 다중 클로닝 부위 | 여러 제한 효소에 대한 인식 부위를 포함하는 짧은 DNA 서열. |
| 선택 마커 | 형질전환된 세포를 식별하는 데 사용되는 유전자 (예: 항생제 내성 유전자). |
2. 클로닝 벡터의 특징
분자 생물학에서 사용되는 클로닝 벡터는 적절한 클로닝 부위 및 선택 표지자와 같은 기능을 수행하는 데 필요한 주요 특징을 가지고 있다. 쉽고 편리한 이유로, 클로닝은 종종 대장균(E. coli)을 사용하여 수행된다. 따라서 사용되는 클로닝 벡터는 복제 기점(ori)과 같이 ''대장균''에서 증식 및 유지를 위해 필요한 요소를 종종 가지고 있다. ColE1 복제 기점은 많은 플라스미드에서 발견된다. 일부 벡터는 ''대장균'' 외에 다른 유기체에서도 유지될 수 있도록 하는 요소를 포함하며, 이러한 벡터는 셔틀 벡터라고 불린다.
일반적으로 클로닝 벡터는 다음과 같은 특징들을 가진다.
- 복제 원점 (ori, origin of replication): 클로닝 벡터가 숙주 세포 내에서 복제하는 데 필요한 DNA 서열이다.
- 선택 표지 (Selectable marker): 항생제 저항성 유전자와 같이 형질전환된 세포를 선택하고 식별할 수 있도록 하는 유전자이다.
- 클로닝 부위 (Cloning site): 제한 효소 절단 부위와 같이 외부 DNA를 삽입할 수 있는 특정 DNA 서열이다.
2. 1. 클로닝 부위 (Cloning site)
모든 클로닝 벡터는 유전자를 편리하게 벡터에 삽입하거나 제거할 수 있는 기능을 가지고 있다. 이는 다수의 고유한 제한 효소 제한 효소 절단 부위를 포함하는 다중 클로닝 부위(MCS) 또는 폴리링커일 수 있다. MCS의 제한 효소 절단 부위는 먼저 제한 효소에 의해 절단된 다음, 동일한 효소로 소화된 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 증폭된 표적 유전자가 DNA 연결 효소를 사용하여 벡터에 연결된다. 원하는 경우 표적 DNA 서열을 특정 방향으로 벡터에 삽입할 수 있다. 필요한 경우 제한 효소 절단 부위를 또 다른 벡터로 서브 클로닝하는 데 사용할 수 있다.다른 클로닝 벡터는 연결 효소 대신 토포이소머라제를 사용할 수 있으며, 벡터나 삽입물의 제한 효소 소화 없이 더 빠르게 클로닝을 수행할 수 있다. 이 TOPO 클로닝 방법에서 선형화된 벡터는 토포이소머라제 I을 양쪽 끝에 부착하여 활성화되며, 이 "TOPO-활성화"된 벡터는 PCR 산물의 5' 말단을 모두 연결하여 토포이소머라제를 방출하고 순환 벡터를 형성함으로써 PCR 산물을 수용할 수 있다.[2] DNA 소화 및 연결 효소를 사용하지 않는 또 다른 클로닝 방법은 부위 특이적 재조합에 의한 것으로, 예를 들어 게이트웨이 기술 시스템에서 사용된다.[3][4] 유전자는 클로닝 벡터(이 방법에서는 엔트리 클론이라고 함)에 클로닝되면 재조합을 통해 다양한 발현 벡터에 편리하게 도입될 수 있다.[5]
2. 2. 선택 표지 (Selectable marker)
선택 표지는 형질전환된 세포를 선택할 수 있게 하는 유전자이다. 주로 항생제 저항성이 표지로 사용되며, 페니실린 그룹의 베타-락탐 항생제인 암피실린에 대한 저항성을 부여하는 베타-락타마제 유전자가 그 예이다. 일부 벡터는 두 개의 선택 표지를 포함하기도 하는데, 예를 들어 플라스미드 pACYC177은 암피실린과 카나마이신 저항성 유전자를 모두 가지고 있다.[6] 셔틀 벡터처럼 두 가지 다른 유기체에서 유지되도록 설계된 벡터는 두 개의 선택 표지가 필요할 수 있으며, 제오신 및 히그로마이신 B에 대한 저항성과 같은 일부 선택 표지는 다른 세포 유형에서 효과적이다. 영양요구성 유기체가 최소 배지에서 자랄 수 있게 해주는 영양요구성 선택 표지도 사용될 수 있는데, 효모의 해당 영양요구성 균주와 함께 사용되는 ''LEU2'' 및 ''URA3''가 그 예이다.[7]다른 종류의 선택 표지로는 barnase,[8] Ccda,[9] 및 parD/parE 독소[10][11]와 같이 숙주 세포에 치명적인 유전자를 이용하는 방법이 있다. 이는 클로닝 과정에서 치명적인 유전자를 파괴하거나 제거함으로써 작동하며, 이 유전자가 손상되지 않은 채 남아 있는 클론은 숙주 세포를 죽이기 때문에 성공적인 클론만 선택된다.
2. 3. 리포터 유전자 (Reporter gene)
리포터 유전자는 클로닝 벡터를 사용하여 성공적인 클론을 쉽게 선별하고 식별할 수 있도록 돕는 유전자이다. 클로닝 벡터에 사용되는 리포터 유전자로는 청백색 선별법에서 α 상보성을 위한 ''lacZ''α 단편이 있다. 또한 MCS에 인접하고 이를 둘러싸는 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 통해 융합 단백질 생산을 용이하게 한다. 스크리닝에 사용될 수 있는 융합 파트너의 예로는 녹색 형광 단백질(GFP) 및 루시페라제가 있다.[1]2. 4. 발현 요소 (Elements for expression)
클로닝 벡터는 클로닝된 표적 유전자의 유전자 발현에 필요한 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS) 등의 요소를 항상 포함하는 것은 아니지만, 많은 경우 이러한 요소를 포함하며 발현 벡터로 작동할 수 있다.[1] 표적 DNA는 선택된 숙주에서 표적 유전자가 발현되도록 특정 프로모터의 제어를 받는 부위에 삽입된다.[1] 프로모터가 존재하면 유전자 발현이 엄격하게 제어되고 효소 유도 및 억제를 통해 필요할 때만 단백질이 생성되도록 조절할 수 있다.[1] 일반적으로 T7, ''lac'' 프로모터 등이 사용된다.[1] 청백색 선별과 같은 선별 기술을 사용할 때 프로모터가 필요하다.[1]프로모터와 RBS가 없는 클로닝 벡터는 클로닝된 DNA 서열에 사용되기도 한다.[1] 예를 들어, 생성물이 대장균(E. coli) 세포에 독성을 가지는 유전자를 클로닝할 때 사용된다.[1] 클로닝된 유전자의 발현이 필요한 경우, 보통 더 적합한 발현 벡터로 서브클로닝하므로, 게놈 라이브러리나 cDNA 라이브러리를 만들 때는 클로닝된 DNA 서열에 프로모터와 RBS가 반드시 필요하지 않다.[1]
일부 벡터는 ''시험관 내'' mRNA 생산과 같이 이종 단백질을 발현하지 않고 전사만을 위해 설계되기도 한다.[1] 이러한 벡터를 전사 벡터라고 부르며, 폴리아데닐화 및 종결에 필요한 서열이 부족하여 단백질 생산에는 사용되지 않을 수 있다.[1]
3. 클로닝 벡터의 종류
클로닝 벡터는 DNA 단편의 크기, 복제 수, 클로닝 방법 등에 따라 다양한 종류가 있으며, 적절한 벡터를 선택해야 한다. 대장균(E. coli)을 이용한 클로닝이 많이 사용되므로, 사용되는 클로닝 벡터는 ColE1 복제 기점과 같이 대장균 내에서 증식 및 유지에 필요한 요소를 가지고 있다. 일부 벡터는 대장균 외 다른 생물체에서도 유지될 수 있도록 하는 요소를 포함하며, 이러한 벡터를 셔틀 벡터라고 부른다.[1] 큰 DNA 삽입체는 복제 수가 높은 일반적인 클로닝 벡터에서 안정적으로 유지되지 않을 수 있으므로, 큰 DNA 조각을 클로닝하려면 더 특수한 클로닝 벡터가 필요할 수 있다.[1]
3. 1. 플라스미드 (Plasmid)
플라스미드는 자율적으로 복제되는 원형의 염색체 외 DNA이다. 플라스미드는 표준적인 클로닝 벡터이며 가장 일반적으로 사용된다. 대부분의 일반적인 플라스미드는 최대 15 kb 크기의 DNA 삽입체를 클로닝하는 데 사용될 수 있다. 가장 초기에 일반적으로 사용된 클로닝 벡터 중 하나는 pBR322 플라스미드이다. 다른 클로닝 벡터로는 pUC 계열의 플라스미드가 있으며, 매우 다양한 클로닝 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다. 많은 플라스미드는 높은 복제수를 가지며, 예를 들어 pUC19는 세포당 500-700개의 복제수를 가진다.[1] 높은 복제수는 재조합 플라스미드를 더 많이 생산하여 이후의 조작에 유용하다. 그러나 낮은 복제수 플라스미드는 특정 상황, 예를 들어 클론된 유전자에서 유래된 단백질이 세포에 독성이 있는 경우에 선호될 수 있다.[12]일부 플라스미드는 M13 박테리오파지 복제 기점을 포함하고 있으며 단일 가닥 DNA를 생성하는 데 사용될 수 있다. 이것들을 파지미드라고 하며, 예로는 pBluescript 계열의 클로닝 벡터가 있다.
3. 2. 박테리오파지 (Bacteriophage)
λ 파지와 M13 파지는 클로닝에 사용되는 박테리오파지이다.[13] 파지에 포장될 수 있는 DNA 양에는 상한선(최대 53kb)이 있어서, 파지 DNA에 외부 DNA를 삽입하려면 파지 클로닝 벡터는 용원성 관련 유전자와 같이 필수적이지 않은 유전자를 삭제해야 할 수 있다. λ 파지를 클로닝 벡터로 사용하면 용균성 주기만 사용하기 때문이다.[14] λ 파지 벡터에는 삽입 벡터와 치환 벡터 두 종류가 있다. 삽입 벡터는 5–11kb 크기의 외부 DNA를 삽입할 수 있는 고유한 절단 부위를 포함한다. 치환 벡터는 절단 부위가 용균성 주기에 필수적이지 않은 유전자를 포함하는 영역을 감싸고 있으며, 이 영역은 클로닝 과정에서 삭제되어 DNA 삽입물로 대체될 수 있고, 8–24kb 크기의 더 큰 DNA를 삽입할 수 있다.[1]파지에 포장될 수 있는 DNA 크기에는 하한선도 있으며, 너무 작은 벡터 DNA는 파지에 제대로 포장될 수 없다. 이 속성은 선택에 사용될 수 있는데, 삽입물이 없는 벡터는 너무 작을 수 있으므로 삽입물이 있는 벡터만 증식을 위해 선택될 수 있다.[15]
3. 3. 코스미드 (Cosmid)
코스미드는 박테리오파지 λ DNA의 일부를 통합한 플라스미드로, DNA를 λ 입자로 포장하는 데 필요한 요소를 포함하는 응집성 말단 부위(''cos'')를 가지고 있다. 적절한 복제 기점(ori) 하에서 플라스미드처럼 복제될 수 있다. 일반적으로 28~45Kb 사이의 큰 DNA 단편을 클로닝하는 데 사용된다.[1]3. 4. 세균 인공 염색체 (Bacterial Artificial Chromosome, BAC)
세균 인공 염색체(BAC)는 최대 350kb 크기의 삽입체를 클로닝할 수 있으며, 세포당 복제수가 1개인 상태로 대장균에서 유지된다.[1] BAC는 F 플라스미드를 기반으로 한다. P1 파지를 기반으로 하는 P1 유래 인공 염색체(PAC)라는 다른 인공 염색체도 있다.3. 5. 효모 인공 염색체 (Yeast Artificial Chromosome, YAC)
효모 인공 염색체는 1 메가베이스(1Mb=1000kb) 이상의 DNA 조각을 클로닝하는 데 사용되는 벡터이다. 인간 게놈 프로젝트와 같이 게놈을 매핑하는 데 필요한 더 큰 DNA 조각을 클로닝하는 데 유용하다. 이 벡터는 텔로미어 서열, 자율 복제 서열(효모 세포에서 선형 염색체를 복제하는 데 필요한 기능)을 포함한다. 또한 이러한 벡터는 외래 DNA를 클로닝하기에 적합한 제한 효소 절단 부위와 선택 표지 유전자로 사용될 유전자를 포함한다.3. 6. 인간 인공 염색체 (Human Artificial Chromosome, HAC)
인간 인공 염색체(HAC)는 인간 세포 내에서 유전자 전달, 발현 연구 및 인간 염색체 기능 연구에 사용될 수 있다. HAC는 매우 큰 DNA 조각을 운반할 수 있고 (크기 제한이 없음), 다른 벡터의 제한적인 클로닝 능력 문제를 겪지 않으며, 바이러스 벡터에 의한 숙주 염색체로의 삽입으로 인한 삽입 돌연변이 발생 가능성도 피할 수 있다.[16][17]3. 7. 동물 및 식물 바이러스 벡터 (Animal and plant viral vectors)
동물 및 식물 세포에 감염되는 바이러스는 외래 유전자를 동물 및 식물 세포에 도입하기 위해 조작되어 왔다. 바이러스가 세포에 흡착하고, DNA를 도입하고, 복제하는 자연적인 능력은 배양된 진핵 세포에 외래 DNA를 전달하는 데 이상적인 운반체가 되게 했다. 원숭이 바이러스 40(SV40)을 기반으로 하는 벡터는 포유류 세포와 관련된 최초의 클로닝 실험에 사용되었다. 아데노바이러스 및 유두종 바이러스와 같은 다른 유형의 바이러스를 기반으로 하는 여러 벡터가 포유류에서 유전자를 클로닝하는 데 사용되었다. 현재, 레트로바이러스 벡터는 포유류 세포에서 유전자를 클로닝하는 데 널리 사용된다. 식물의 경우, 콜리플라워 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스 및 제미니 바이러스가 제한적인 성공을 거두며 사용되었다.[1]
4. 스크리닝: 청백색 선별법 (Blue/white screen)
청백색 선별법은 클로닝 성공 여부를 확인하는 방법이다. 대부분의 범용 벡터(예: pUC19)는 β-갈락토시다아제를 암호화하는 유전자를 이용한다. 이 효소는 X-갈(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-d-갈락토사이드)을 불용성 청색 생성물(5,5'-디브로모-4,4'-디클로로 인디고)로 가수분해한다. β-갈락토시다아제의 벡터 기반 ''lacZα'' 염기서열 내에 DNA 단편을 클로닝하면 활성 효소 생성이 억제된다.
X-갈이 포함된 한천 배지에서 형질전환된 콜로니를 관찰하면, 삽입된 DNA가 없는 벡터는 파란색을 띠고, DNA 단편을 포함하는 벡터는 흰색을 띤다. 이를 통해 클로닝 성공 여부를 판별한다.
참조
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웹사이트
Definition of cloning vector
http://www.theodora.[...]
2012-10-18
[2]
웹사이트
The Technology Behind TOPO® Cloning
http://www.invitroge[...]
[3]
서적
High Throughput Protein Expression and Purification
[4]
웹사이트
Cloning Methods - Recombination cloning systems
http://www.embl.de/p[...]
[5]
웹사이트
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http://www.invitroge[...]
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서적
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[7]
논문
Foreign gene expression in yeast: a review
1992-06
[8]
논문
A plasmid vector with positive selection and directional cloning based on a conditionally lethal gene
https://zenodo.org/r[...]
1996-02
[9]
논문
Positive selection of recombinant DNA by CcdB
1996-08
[10]
논문
New positive selection system based on the parD (kis/kid) system of the R1 plasmid
2000-04
[11]
논문
Construction of a pTOC-T vector using GST-ParE toxin for direct cloning and selection of PCR products
2004-11
[12]
웹사이트
Copy number
https://archive.toda[...]
2013-03-06
[13]
논문
Bacteriophage lambda as a cloning vector
1992-12
[14]
서적
Molecular Biotechnology Principles and Applications of Recombinant DNA
https://books.google[...]
ASM Press
[15]
서적
Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction
https://books.google[...]
Wiley-Blackwell
2010-04-19
[16]
논문
Human artificial chromosome (HAC) vector with a conditional centromere for correction of genetic deficiencies in human cells
2011-12
[17]
논문
A new generation of human artificial chromosomes for functional genomics and gene therapy
2013-04
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