헤마글루티닌 에스테라아제
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1. 개요
헤마글루티닌 에스테라아제(HE)는 인플루엔자 C 바이러스에서 발견되는 당단백질로, 바이러스의 수용체 결합, 수용체 가수분해(에스테라아제), 막 융합 활성을 수행한다. HE는 세 개의 도메인으로 구성되며, 수용체 결합 부위, 에스테라아제 도메인, 막 근위 도메인을 포함한다. HEF는 N-아세틸-9-O-아세틸뉴라민산(9-O-Ac-Neu5Ac)에 결합하여 세포 감염을 시작하고, 에스테라아제 활성을 통해 바이러스 입자를 방출하며, 막 융합 활성을 통해 바이러스 유전체를 세포질로 주입한다. 또한, HE 단백질은 세포 내 수송, S-아실화, 단백질 분해 절단 등 다양한 번역 중 및 번역 후 변형을 거쳐 기능을 수행한다.
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| 헤마글루티닌 에스테라아제 | |
|---|---|
| 일반 정보 | |
 | |
| 발견 위치 | 일부 외피 바이러스 |
| 기능 | 헤마글루티닌 에스테라아제 융합 당단백질 |
| 도메인 | HE, SNGH 에스테라아제 도메인 HE, 헤마글루티닌 도메인 |
2. 구조
코로나바이러스 및 토로바이러스 HE는 인플루엔자 C 바이러스의 HEF 당단백질에서 유래되었으며, 헤마글루티닌 에스테라아제가 삼량체에서 이량체 당단백질로 변화하였다.[1] HE 단량체는 중심 에스테라아제/가수분해효소 도메인, 수용체 결합 렉틴 도메인, 막 근위 도메인의 세 가지 도메인으로 구성된다.[4]
CoV와 ToV의 HE 이량체는 두 개의 동일한 접촉 영역(CR 1 및 2)을 갖는다. CR 1은 수용체 결합 도메인을 포함하고, CR 2는 막 근위 도메인을 포함한다. ToV HE의 CR 2에는 추가적인 에스테라아제 도메인이 있어, CoV HE보다 표면적이 더 크다. 코로나바이러스 HE는 카르복실 말단 막 앵커 근처의 Cys385 사이에 여러 이황화 결합을 가져, HE 이량체를 서로 연결한다.[4]
CoV HE에서 두 개의 R 도메인 베타 시트는 서로 연결되어 이합체 인터페이스를 가로지르는 연속적인 분자간 베타 시트를 형성한다. 반면, ToV에서는 각도가 다르게 정렬되어, ToV 수용체 결합 도메인의 베타 시트가 더 꼬이고, 접촉 영역 1은 더 작으며, R 도메인 위치는 CoV에 비해 베타 가닥을 따라 이동한다.[4]
2. 1. 결정 구조
전자 현미경을 사용한 초기 연구에서는 HEF 스파이크가 막 근처의 줄기와 구형 머리로 구성된 버섯 모양의 삼량체를 형성한다는 것을 보여주었다.[2]이후 연구에서는 브로멜라인으로 절단된 외피 영역의 X선 결정학을 사용하여 헤마글루티닌 에스테라아제 융합 삼량체의 더 높은 해상도 구조(4.5Å)를 검사하고 보여줄 수 있었다. 헤마글루티닌과 헤마글루티닌 에스테라아제 융합 단백질은 구조와 개별 세그먼트의 폴딩 측면에서 유사하다. 그러나 HA와 HEF 사이에는 아미노산의 12%만 동일하다. HE와 HEF의 한 가지 중요한 차이점은 에스테라제 영역을 포함하는 HEF 구형 도메인(도메인 하단 부분)에 추가적인 돌출부가 있다는 것이다. HA와 HEF 모두에서 수용체 결합 부위는 도메인의 상단 부분에서 발견되며 HEF1 잔기만 포함한다. 줄기는 60Å 길이의 세 개의 α-나선으로 구성되어 있으며, 여기에는 HEF2 서열의 모든 서열과 N-말단 잔기(1–40) 및 C-말단 잔기(367–432)인 특정 HEF1 잔기가 포함되어 있다.[2]
결정 구조는 HEF가 9-O-Ac-Neu5Ac에 결합하는 방식이 HA가 Neu5Ac에 결합하는 방식과 동일하다는 것을 보여준다. 결합 부분에는 α-나선, 루프 및 확장된 가닥이 포함된다. 아미노산(Tyr127, Thr170, Gly172, Tyr227 및 Arg292)과 리간드의 하이드록실 그룹 사이에는 수소 결합이 있으며, 다른 잔기는 수용체 결합 부위의 구조적 지지체를 형성한다. HEF 결합 부위에는 고유한 소수성 포켓이 있어 아세틸 메틸 그룹을 수용한다.[2]
3. 활성
HE는 헤마글루티닌 활성과 에스테라아제 활성을 모두 가지고 있다.
3. 1. 수용체 결합 활성
HEF는 바이러스 수용체 역할을 하는 N-아세틸-9-O-아세틸뉴라민산(9-O-Ac-Neu5Ac)을 포함하는 당지질 및 당단백질에 결합한다.[1] HEF는 9-O-Ac-Neu5Ac가 다음 갈락토실 잔기에 α-2,3 또는 α-2,6 결합으로 부착되었는지 여부와 관계없이 수용체에 결합할 수 있다.[1] 그러나 숙주 특이성은 말단 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac)과 Neu5Ac의 배당체 결합에 의해 영향을 받을 수 있다.[1] 인플루엔자 C 바이러스는 고유한 수용체 특이성으로 인해 다양한 세포 표면의 9-O-Ac-Neu5Ac를 인식할 수 있다.[1]3. 2. 수용체 가수분해 (에스테라아제) 활성
HEF의 수용체 가수분해 효소 활성은 에스테라아제 효소를 사용하여 감염된 세포에서 바이러스 입자를 방출하는 데 도움을 준다. 이 효소는 종말 9-O-Ac-Neu5Ac의 C9 위치에서 아세틸기를 절단한다.[2] 세린 가수분해 효소 계열에 속하는 HEF의 에스테라아제 활성에는 세린 아미노산의 수산기(OH)가 기질의 카르보닐 그룹을 친핵성 공격하는 과정이 포함되며, 이 과정에는 히스티딘과 아스파르트산, 두 개의 다른 아미노산이 관여한다. 염기성 히스티딘은 수산기를 분극화하고 탈양성자화하여 세린의 반응성을 향상시키며, 아스파르트산은 히스티딘을 분극화한다.[2]X선 결정학을 통한 HEF 결정 구조 분석 결과, 세린 57, 아스파르트산 352, 히스티딘 355가 에스테라아제 활성에 중요한 아미노산으로 밝혀졌다. 초기 연구에서 Ser57 및 His355 잔기의 돌연변이는 HEF의 에스테라아제 활성을 완전히 멈추게 할 수 있다는 것이 확인되었다.[2]
3. 3. 막 융합 활성
막 융합 활성은 바이러스가 유전체를 세포의 세포질로 주입하는 데 중요하다. 막 융합을 활성화하려면 전구체 단백질 HEF0와 HA0을 HEF1과 HEF2 서브유닛으로 절단한 다음, 이러한 단백질을 산성 pH에 노출시키는 과정이 선행되어야 한다.[2]산성 pH는 단백질의 특정 재배열을 시작하는 특정 아미노산의 양성자화를 유발한다. 양성자화된 아미노산은 히스티딘으로 밝혀졌으며, pKa는 엔도솜의 pH와 일치한다. 연구에 따르면 인플루엔자 A와 C의 균주별로 막 융합 활성을 유발하는 pH 값에 약 0.7의 차이가 있다.[2]
낮은 pH에서 발생하는 HEF 구조의 컨포메이션 변화는 융합 펩타이드를 줄기 하단에서 분리시키고 분자 외부 표면을 노출시켜 엔도솜 막에 삽입할 수 있게 한다. 또 다른 컨포메이션 변화는 외피 도메인을 구부려 융합 펩타이드를 막횡단 영역으로 밀어낸다. 그 결과, 바이러스와 엔도솜 막이 가까워지고 반융합을 통해 지질을 교환한다. 그런 다음 융합 구멍이 열리고 결국 두 지질 이중층이 완전히 합쳐진다.[2]
4. 접힘 및 세포 내 수송
헤마글루티닌 에스테라아제 단백질의 접힘과 단백질 도메인의 조립 방식은 소포체에서 골지체로의 막 및 분비 단백질 수송에 기여한다. 연구자들은 삼량체화가 소포체를 빠져나가기 전 단계에서 일어난다는 것을 발견했다.[5] HE 단백질의 단량체는 조립이 가능하기 전에 접힌다. 헤마글루티닌 에스테라아제가 골지체로 이동하기 전에 광범위하게 접히고 조립되어야 한다.
헤마글루티닌-에스테라아제의 구조는 세포 내 수송에 기여한다. ''C형 인플루엔자 바이러스''의 헤마글루티닌-에스테라아제(HE) 당단백질은 막 융합에 활성적인 줄기 도메인(F), 아세틸에스테라아제 도메인(E), 그리고 수용체 결합 도메인(R)의 세 도메인으로 구성된다.[6] 이 단백질은 8개의 N-결합된 당화 부위를 포함하며, F 도메인에 4개(26, 395, 552, 603번 위치), E 도메인에 3개(61, 131, 144번 위치), R 도메인에 1개(189번 위치)가 있다.[6] 도메인 내의 올리고당 사슬은 세포 내 수송에 영향을 미친다. 한 연구에 따르면, F 도메인의 두 부위(26번 및 603번 위치)와 E 도메인의 부위(144번 위치)에서의 당화가 HE 분자가 소포체에서 수송되기 위해 필요하며, 이 세 부위 중 하나가 없는 돌연변이 HE는 삼량체 조립을 거치지 못한다.[6] 올리고당은 F 및 R 도메인에서 에스테라아제 활성을 유지하는 데 필요하다. 만약 도메인 중 하나라도 올리고당 사슬이 부족하다면, 세포 표면 발현에 영향을 미칠 것이다. HE 단량체는 올리고당 사슬이 없었음에도 불구하고 완전한 효소 활성을 보여 아세틸에스테라아제 활성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다.[6] 올리고당 사슬은 세포 내 수송에는 중요하지만 융합 활성에는 중요하지 않다. 따라서 올리고당 사슬은 실제로 막 융합을 촉진하지 않는다.
5. S-아실화 및 RAFT-국소화
헤마글루티닌 에스테라아제(HEF) 효소의 아실화는 인플루엔자 C 바이러스의 바이러스 복제에 필수적이다. HEF의 아실화 부위가 없는 재조합 바이러스는 구조될 수 있지만, 바이러스 역가는 야생형 Flu C에 비해 1 로그만큼 감소하는 것으로 나타났다.[2] 결과적으로 생성된 바이러스 입자는 규칙적인 단백질 조성을 가지며 전자 현미경으로 형태 변화는 뚜렷하지 않지만, 용혈 활성은 감소하여 막 융합에 결함이 있음을 나타낸다.[2] 이는 유사한 결과를 보인 여러 HA 단백질 아형과 비교된다.
헤마글루티닌-에스테라아제-융합 단백질은 N-글리코실화, 이황화 결합 형성, S-아실화 및 HEF1, HEF2 서브유닛으로의 단백질 분해 절단과 같은 공동번역 변형 및 번역 후 변형을 거친다.[2] ''인플루엔자 C 바이러스''의 HEF 단백질은 막횡단 시스테인에 부착된 단 하나의 스테아레이트를 가지고 있다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 HA는 플라스마 막의 콜레스테롤과 스핑고지질이 풍부한 나노도메인인 막 래프트와 관련이 있는 반면, HEF는 플라스마 막의 벌크 상에 국한되는 것으로 생각된다.[2]
6. 단백질 분해 절단
단백질 분해 절단은 헤마글루티닌 에스테라아제(HE)의 막 융합 활성 전에 발생해야 하는데, 이는 단백질이 낮은 pH에서 활성화되도록 하기 때문이다. 모든 인플루엔자 C 바이러스 균주의 HEF 단백질은 단염기 절단 부위를 포함하고 있으며, 이 점에서 인간, 돼지, 말 및 낮은 병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 HA와 유사하다.[2] 고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스의 HA에 존재하며, 유비쿼터스 단백질 분해 효소 푸린에 의해 처리되는 다염기 절단 부위는 HEF 단백질에서는 발견되지 않는다. 결과적으로, 인플루엔자 C 바이러스의 복제는 바이러스 감염 부위, 즉 호흡기로 제한되며, 다른 인플루엔자 바이러스와 달리 다른 조직으로 퍼지지 않는다. 조직 배양에서 인플루엔자 C 바이러스의 여러 복제 주기는 트립신을 첨가하면 가능하며, 배아화된 계란은 절단된 HEF를 가진 감염성 바이러스를 생성한다.[2]
HEF의 단백질 분해 절단을 촉매하는 효소는 아직까지 밝혀지지 않았지만, HA와 HEF 모두 ''시험관 내''에서 유사한 농도(5μg/mL~20μg/mL)의 트립신에 의해 절단될 수 있으므로, 세포 내부에서도 동일한 효소에 의해 활성화될 가능성이 높다.[2]
7. 바이러스 입자에서 HE 스파이크의 규칙적인 배열
인플루엔자 C 바이러스의 유일한 스파이크인 헤마글루티닌-에스테라아제-융합 당단백질(HEF)은 수용체 결합, 수용체 가수분해, 막 융합 활성을 결합한다.[8] 이 HE 단백질은 구조적 배열에도 스파이크를 가지고 있다.
구형 및 실 모양 입자 표면의 HEF 삼량체는 주로 육각형으로 구성되는 망상 구조로 배열되어 있다.[2] 이 특징은 인플루엔자 C 바이러스 입자에 고유하다. HEF가 막에서 제거된 경우에도 원래 가지고 있던 중합체 망상 구조를 여전히 볼 수 있다. 이러한 결과는 육각형 배열이 HEF의 고유한 특징이며 M1과 같은 다른 바이러스 단백질을 필요로 하지 않고, 그 형성은 HEF의 외배엽 간의 측면 상호 작용과 관련이 있음을 나타낸다.[2] 바이러스 입자의 스파이크 배열 형성은 바이러스 입자를 생성하고 덮음으로써 바이러스 입자 주위의 외피 역할을 한다. 이는 무극성 분자가 내부에 있는 지질 이중층 막의 소수성 효과와 유사하다.
8. N-글리코실화 부위의 위치
HEF의 N-글리코실화 부위는 HEF1과 HEF2에 위치한다. HEF2에는 하나의 서퀀이 있으며, HEF1에는 6개가 있다. 3개는 구상 머리 부분에, 2개는 줄기와 머리를 연결하는 힌지 부위에 있다. 589번 위치의 부위는 막 관통 영역과 너무 가까워 글리코실화되지 않는다. 글리코실화는 단백질의 적절한 접힘, 단백질 분해로부터의 보호, 항원성 에피토프 제시에 중요하다.[2]
8. 1. 인플루엔자 C 바이러스에서
인플루엔자 C 바이러스의 HEF는 641개의 아미노산으로 구성된 전형적인 1형 막 단백질이다. HEF는 N-말단 HEF1과 막 관통 도메인 및 세포질 꼬리로 구성된 HEF2, 두 개의 소단위체로 구성된다.[2] 전자 현미경 분석 결과, HEF의 스파이크는 막 근처의 자루와 구형 머리로 구성된 버섯 모양의 삼합체를 형성한다.[2] HEF는 아스파라진 결합 탄수화물만 포함하고 있어 O-글리코실화가 일어나지 않는다.[2]9. 분자 내 이황화 결합의 위치
HEF1에서 15개의 시스테인 잔기 중 12개는 6개의 사슬 내 이황화 결합을 형성하여 구형 머리 도메인을 안정화시킨다. 성숙 단백질에서 이황화 결합을 형성하지 않는 두 개의 시스테인 잔기(Cys373과 Cys399)는 구형 머리와 줄기 영역을 연결하는 힌지에 위치한다. 나머지 시스테인 잔기는 삼량체의 하단 근처, 외배엽 도메인 영역에서 HEF와 사슬 간 이황화 결합을 형성한다. HEF2의 이러한 이황화 결합은 하위 단위체가 막 융합을 촉매하는 큰 형태 변화를 수행할 수 있게 한다.[2]
9. 1. 인플루엔자 바이러스에서
인플루엔자 C 바이러스에서 HEF1의 시스테인 잔기는 6개의 내부 사슬 이황화 결합을 형성하여 구형 머리 도메인을 안정화시킨다. HEF의 적절한 접힘 및 기능에 필요하지 않거나 연결 힌지에 위치한 두 개의 시스테인 잔기는 성숙 단백질에서 이황화 결합을 형성하지 않는다. 나머지 시스테인은 HEF2 서브유닛 외피 도메인의 유일한 시스테인 잔기와 사슬 간 이황화 결합을 형성하는데, 이 잔기는 삼량체의 바닥에 위치한다. 인플루엔자 A 바이러스는 HA1과 HA2를 연결하는 하나의 결합을 포함하여 유사한 이황화 결합 분포를 가지며, 대부분은 내부 사슬 결합이다. HEF2 및 HA2 서브유닛에서 이황화 결합이 드물게 나타나는 것은 이러한 서브유닛이 막 융합을 촉매하는 큰 형태 변화를 수행할 수 있게 한다.[2]10. 번역 중 및 번역 후 변형
HEF(헤마글루티닌 에스테라아제)는 소포체 내강으로 이동하는 동안 N-말단 신호 펩타이드가 절단되고 탄수화물이 부착된다. 이황화 결합이 형성되고 재형성된다. 이러한 변형은 분자의 접힘과 삼량체 형성에 영향을 미친다. 이후, 지방산 사슬이 막횡단 영역 끝에 위치한 시스테인에 부착되고 HEF는 2개의 서브유닛으로 절단되는데, 이 과정은 바이러스 복제에 필수적이다.[2]
10. 1. 인플루엔자 바이러스에서
인플루엔자 C형의 표면 당단백질 HEF는 수용체 결합, 수용체 비활성화, 융합 활성의 세 가지 기능을 수행한다.[9] 수용체 결합은 바이러스가 세포 표면의 N-아세틸-9-O-아세틸뉴라민산에 부착되도록 매개하며, 수용체 비활성화는 N-아세틸-9-O-아세틸뉴라민산에서 9-O-아세틸기를 제거한다.[9] 융합 활성은 HEF가 두 개의 서브유닛으로 번역 후 단백질 분해 절단을 거치고 산성 환경에 노출되는 것에 달려있다.[9] 낮은 pH 조건에서 HEF의 구조 변화가 일어난다.[9]막 융합을 활성화하려면, 전구체 단백질 HEF0을 HEF1과 HEF2 서브유닛으로 절단한 다음, 이러한 단백질을 산성 pH에 노출시키는 과정이 선행되어야 한다.[2] 산성 pH는 단백질의 특정 재배열을 시작하는 특정 아미노산의 양성자화를 유발한다.[2]
낮은 pH에서 발생하는 HEF 구조의 컨포메이션 변화는 융합 펩타이드를 줄기 하단에서 분리시키고 분자 외부 표면을 노출시켜 엔도솜 막에 삽입할 수 있게 한다.[2] 또 다른 컨포메이션 변화는 외피 도메인을 구부려 융합 펩타이드를 막횡단 영역으로 밀어낸다.[2] 그 결과, 바이러스와 엔도솜 막이 가까워지고 반융합을 통해 지질을 교환한다.[2] 그런 다음, 융합 구멍이 열리고 결국 두 지질 이중층이 완전히 합쳐진다.[2]
인플루엔자 C형은 구조적 구성 요소로 인플루엔자 A형 및 B형과 구별된다.[2] HEF의 세포질 부분을 구성하는 아미노산은 아르기닌-트레오닌-라이신 3개로 구성되어 있으며, 인플루엔자 A형 및 B형은 10개의 헤마글루티닌 아미노산으로 구성되어 있다.[9] HEF의 번역 후 변형은 지방산에 의한 아실화이다.[9] 스테아르산 지방산은 HEF에 부착된 주된 지방산으로 검출되었으며, 팜미트산 지방산은 다른 모든 막 단백질에서 발견되었다.[9]
참조
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논문
Structure of coronavirus hemagglutinin-esterase offers insight into corona and influenza virus evolution
2008-07
[2]
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The role of stearate attachment to the hemagglutinin-esterase-fusion glycoprotein HEF of influenza C virus
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The Hemagglutinin-Esterase Fusion Glycoprotein Is a Primary Determinant of the Exceptional Thermal and Acid Stability of Influenza D Virus
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Structural basis for ligand and substrate recognition by torovirus hemagglutinin esterases
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Post-translational folding of the influenza C virus glycoprotein HEF: defective processing in cells expressing the cloned gene
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