CDNA 말단의 급속 증폭
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1. 개요
CDNA 말단의 급속 증폭(RACE)은 RNA 전사체의 cDNA 복사본을 생성하여 전사체의 알려지지 않은 말단 부분을 복사하는 분자 생물학 기술이다. 5' RACE와 3' RACE의 프로토콜은 약간 다르며, 5' RACE는 cDNA의 3' 말단에 동종 중합체 꼬리를 추가하고, 3' RACE는 mRNA의 폴리 A 꼬리를 이용한다. RACE로 생성된 cDNA 분자는 고처리량 시퀀싱 기술을 사용하여 염기서열을 분석할 수 있으며, 이를 RACE-seq라고 한다. RACE는 RNA 분자의 알려지지 않은 5' 또는 3' 부분을 증폭하는 데 사용되며, 전사 시작점 매핑, RNA 절단 부위 매핑, 새로운 전사체 및 융합 유전자 특성화 등에 활용된다.
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| CDNA 말단의 급속 증폭 | |
|---|---|
| 개요 | |
| 종류 | 분자생물학 실험 기법 |
| 목적 | cDNA 말단 서열 증폭 |
| 상세 정보 | |
| 원리 | mRNA의 3' 또는 5' 말단의 cDNA 서열을 증폭하여 전체 cDNA 서열을 확보 |
| 방법 | 3'-RACE: mRNA의 3' 말단에 poly(A) 꼬리를 이용하여 cDNA 합성 및 증폭 5'-RACE: mRNA의 5' 말단에 어댑터 서열을 연결하여 cDNA 합성 및 증폭 |
| 응용 | |
| 유전자 발현 연구 | 새로운 유전자 또는 유전자 이형체의 5' 및 3' 말단 서열 결정 유전자 발현 조절 연구 |
| cDNA 라이브러리 제작 | 전체 cDNA 서열을 포함하는 라이브러리 제작 |
| 장점 | |
| 간편성 | 비교적 간단한 실험 과정 |
| 효율성 | 적은 양의 mRNA로도 cDNA 말단 서열 확보 가능 |
| 단점 | |
| 비특이적 증폭 | PCR 과정에서 비특이적인 산물 생성 가능성 |
| 키메라 형성 | PCR 과정에서 서로 다른 cDNA 단편이 연결되어 키메라 형성 가능성 |
2. 과정
RACE는 RNA 전사체의 cDNA 복사본을 생성하는 과정으로 시작한다. 이 과정에서 전사체 중앙의 알려진 서열을 사용하여 전사체의 알려지지 않은 말단 부분을 복사한다. 복사된 영역은 5' 또는 3' 말단에서 알려진 서열에 의해 경계가 정해진다.[1]
5' RACE와 3' RACE는 프로토콜(protocol)이 약간 다르다. 5' RACE는 cDNA의 3' 말단에 동일 뉴클레오타이드 가닥을 추가해야 하지만, 3' RACE는 진핵생물 mRNA의 3' 말단에 자연적으로 존재하는 폴리 A 꼬리를 사용하므로 이 과정이 필요하지 않다.[1]
2. 1. 5' RACE
5' RACE는 mRNA를 주형으로 사용하여, 유전자 내의 알려진 서열을 인식하는 안티센스(역방향) 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 역전사 반응으로 시작한다.[1] 이 프라이머는 유전자 특이적 프라이머(GSP)라고 불린다.[1] 프라이머는 mRNA에 결합하고, 효소 역전사 효소는 프라이머의 3' 말단에 염기쌍을 추가하여 특정 단일 가닥 cDNA 산물을 생성하는데, 이는 mRNA의 역상보적 서열이다.[1] cDNA 합성이 완료된 후, 효소 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이 효소(TdT)를 사용하여 cDNA의 3' 말단에 동일한 뉴클레오타이드 가닥, 즉 동종 중합체 꼬리를 추가한다.[1] (동종 중합체 꼬리 부착보다 훨씬 효율적인, de novo cDNA 합성을 위한 첫 번째 가닥의 3'-말단 서열을 추가하는 다른 방법들이 있지만, 이 방법의 의미는 동일하다.)[1] 그 다음에는 PCR이 수행되는데, 여기에는 알려진 서열에 결합하는 두 번째 안티센스 유전자 특이적 프라이머(GSP2)와 cDNA의 3' 말단에 추가된 동종 중합체 꼬리에 결합하는 센스(정방향) 범용 프라이머(UP)가 사용되어 5' 말단에서 cDNA 산물을 증폭시킨다.[1]2. 2. 3' RACE
3' RACE는 역전사 과정에서 프라이밍을 위해 모든 진핵생물 mRNA의 3' 말단에 존재하는 자연적인 폴리 A 꼬리를 사용한다.[1] cDNA는 Oligo-dT-어댑터 프라이머(짧은 데옥시-티민 뉴클레오타이드 서열을 가진 프라이머)를 사용하여 생성되는데, 이 프라이머는 폴리아데닐화된 서열을 상보적으로 하고 각 cDNA의 5' 말단에 특수한 어댑터 서열을 추가한다.[1] 그런 다음 PCR을 사용하여 센스 GSP와 어댑터 서열을 상보적으로 하는 안티센스 프라이머를 사용하여 알려진 영역에서 3' cDNA를 증폭시킨다.[1]3. RACE-시퀀싱
RACE로 생성된 cDNA 분자는 고처리량 시퀀싱 기술(RACE-seq라고도 함)을 사용하여 염기서열을 분석할 수 있다. RACE 단편의 고처리량 시퀀싱은 소수의 클론에 대한 분자 클로닝 및 생거 시퀀싱을 수행하는 기존의 RACE 단편 특성화에 비해 시간 효율적이며, 더 민감하고, 비용이 적게 들고, 기술적으로 실현 가능하다.
3. 1. 역사 및 응용
RACE는 RNA 분자의 알려지지 않은 5' (5'-RACE) 또는 3' (3'-RACE) 부분을 증폭하는 데 사용될 수 있으며, 이 경우 RNA 서열의 일부가 알려져 있고 유전자 특이적 프라이머에 의해 표적화된다. 이러한 증폭된 RACE 산물의 특성 분석을 위해 고처리량 시퀀싱과 결합하면, 모든 유형의 코딩 또는 비코딩 RNA 분자를 특성 분석하는 데 이 접근법을 적용할 수 있다.RACE를 고처리량 시퀀싱과 결합하는 아이디어는 2009년 단일 세포주에서 17개 유전자의 전사 시작점(TSS) 매핑을 수행하기 위해 Deep-RACE로 처음 소개되었다.[1] 2014년의 연구에서 합성 siRNA에 의해 유도되는 표적 RNA의 절단 부위를 정확하게 매핑하기 위해, 이 접근법은 처음 RACE-seq라고 명명되었다.[2] 또한, 이 방법론은 새로운 전사체 및 융합 전사체의 전체 길이의 알려지지 않은 부분을 대장암에서 특성 분석하는 데 사용되었다.[3]
lncRNA의 알려지지 않은 전사체 구조를 특성 분석하기 위한 또 다른 연구에서, RACE는 반장(semi-long) 454 시퀀싱과 결합하여 사용되었다.[4]
참조
[1]
논문
High-throughput verification of transcriptional starting sites by Deep-RACE.
http://curis.ku.dk/w[...]
2009-02
[2]
논문
Deep Sequencing Insights in Therapeutic shRNA Processing and siRNA Target Cleavage Precision.
2014-02-04
[3]
논문
Novel RNA variants in colorectal cancers.
2015-11-03
[4]
논문
Extension of human lncRNA transcripts by RACE coupled with long-read high-throughput sequencing (RACE-Seq)
2016-08-17
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