TA 클로닝
1. 개요
TA 클로닝은 PCR로 생성된 DNA 조각(인서트)을 벡터에 삽입하는 분자 생물학 기술이다. Taq 중합효소를 사용하여 인서트를 생성하고, 벡터는 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 꼬리를 만든다. TA 클로닝은 기존 서브 클로닝보다 간단하고 빠르지만, 방향성 클로닝이 불가능하여 유전자가 반대 방향으로 클로닝될 수 있다는 단점이 있다.
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| 유형 | 분자 클로닝 기술 |
|---|---|
| 개발자 | 홀거 헤르츠슈트 폴 슈트르믈 귄터 크람머 |
| 기반 | DNA 중합효소의 속성 |
|---|---|
| 특징 | 효율적인 클로닝 방향성 클로닝 가능 |
| 제한 사항 | 백그라운드 콜로니 형성 플라스미드 크기 제한 |
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복제 -
꺾꽂이
꺾꽂이는 식물의 줄기, 잎, 뿌리 등을 잘라 새로운 개체를 번식시키는 무성 생식 방법으로, 식물 종류와 부위에 따라 다양한 방법이 있으며, 적절한 환경과 기술이 필요하다. -
복제 -
탯줄
탯줄은 태아에게 영양을 공급하는 통로로, 제대정맥과 제대동맥으로 구성되며, 출생 후에는 늦게 결찰하는 것이 신생아에게 유익할 수 있고, 제대혈은 줄기 세포의 공급원이며, 다양한 이상과 용어로 사용된다. -
분자생물학 기술 -
중합효소 연쇄 반응
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분자생물학 기술 -
플라스미드
플라스미드는 염색체와 독립적으로 존재하며 자율적으로 증식하는 주로 원형 DNA 형태의 유전 물질로, 유전자 공학에서 유전자 운반체로 사용되며 세균 내에서 항생제 내성 유전자 등을 포함하여 숙주 세포 생존에 기여하고 생명공학 연구 및 유전자 치료에 활용된다. -
분자생물학 -
단백질
단백질은 아미노산 중합체로 생체 구조 유지와 기능에 필수적이며, 아미노산 서열에 따라 고유한 3차원 구조를 형성하여 효소, 구조, 수송, 저장, 수축, 방어, 조절 단백질 등 다양한 기능을 수행하고, 인체 내에서 건강 유지와 질병 예방에 중요한 역할을 하는 필수 영양소이다. -
분자생물학 -
의학
의학은 질병의 진단, 예후, 치료, 예방을 연구하는 과학 및 실천 분야이며, 고대부터 발전하여 현대에는 다양한 전문 분야로 세분화되고 첨단 기술 발전에 따라 혁신적인 변화를 겪고 있다.
2. TA 클로닝의 원리
TA 클로닝은 Taq 중합효소를 사용한 PCR 과정에서 비롯된다. Taq 중합효소는 3'에서 5' 방향으로 교정 활성이 없어 PCR 생성물의 각 말단에 높은 확률로 단일 3'-아데닌(A) 돌출부를 추가한다. PCR 프라이머의 5' 말단에 구아닌(G)을 포함하면 말단 프라이머 아데노신 오버행 추가 가능성을 최대화할 수 있다. 3'에서 5' 방향으로 엑소뉴클레아제 활성이 강한 열 안정성 중합효소는 3' 아데닌 돌출부를 남기지 않아 TA 클로닝에 적합하지 않다.
표적 벡터는 선형화한 후 블런트엔드(무딘 말단부) 제한 효소로 절단한다. 이후 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 ddTTP로 꼬리를 붙이는데, 이때 하나의 T 잔기만 추가하기 위해 ddTTP를 사용하는 것이 중요하다. 이 과정을 통해 각 블런트엔드에 단일 3'-오버행 티민(T) 잔기를 갖는 벡터가 생성된다.
2.1. 인서트 (삽입물) 생성
인서트는 Taq 중합효소를 사용하여 PCR에 의해 생성된다. 이 중합효소는 3'에서 5' 방향으로 교정 활성이 없고, 높은 확률로 PCR 생성물의 각 말단에 단일 3'-아데닌(A) 돌출부를 추가한다. 말단 프라이머 아데노신 오버행을 추가하는 Taq DNA 중합효소의 가능성을 최대화하기 때문에 PCR 프라이머에 5' 말단에 구아닌(G)이 있는 것이 가장 좋다. 광범위한 3'에서 5' 방향으로 엑소뉴클레아제 활성을 함유하는 열 안정성 중합효소는 이들이 3' 아데닌 돌출부를 남기지 않기 때문에 사용되어서는 안 된다.
2.2. 벡터 생성
표적 벡터는 선형화되고 블런트엔드(무딘 말단부, blunt-end) 제한 효소(restriction enzyme)로 절단된다. 이어서, 이 벡터는 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 ddTTP로 꼬리가 달리게 된다. 하나의 T 잔류물만 추가하기 위해 ddTTP를 사용하는 것이 중요하다. 이 꼬리는 각 블런트엔드에 단일 3'-오버행 티민(T) 잔기를 갖는 벡터를 만든다. 제조업체는 일반적으로 이미 선형화되고 돌출된 티민으로 태그가 지정된 광범위한 준비된 벡터가 있는 TA 클로닝 "키트"를 판매한다.
3. TA 클로닝의 장단점
TA 클로닝은 서브 클로닝에 비해 여러 장단점을 가진다.
| 장점 | 단점 |
|---|---|