TA 클로닝
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1. 개요
TA 클로닝은 PCR로 생성된 DNA 조각(인서트)을 벡터에 삽입하는 분자 생물학 기술이다. Taq 중합효소를 사용하여 인서트를 생성하고, 벡터는 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 꼬리를 만든다. TA 클로닝은 기존 서브 클로닝보다 간단하고 빠르지만, 방향성 클로닝이 불가능하여 유전자가 반대 방향으로 클로닝될 수 있다는 단점이 있다.
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| TA 클로닝 | |
|---|---|
| 기본 정보 | |
 | |
| 유형 | 분자 클로닝 기술 |
| 개발자 | 홀거 헤르츠슈트 폴 슈트르믈 귄터 크람머 |
| 기술 정보 | |
| 기반 | DNA 중합효소의 속성 |
| 특징 | 효율적인 클로닝 방향성 클로닝 가능 |
| 제한 사항 | 백그라운드 콜로니 형성 플라스미드 크기 제한 |
2. TA 클로닝의 원리
TA 클로닝은 Taq 중합효소를 사용한 PCR 과정에서 비롯된다. Taq 중합효소는 3'에서 5' 방향으로 교정 활성이 없어 PCR 생성물의 각 말단에 높은 확률로 단일 3'-아데닌(A) 돌출부를 추가한다. PCR 프라이머의 5' 말단에 구아닌(G)을 포함하면 말단 프라이머 아데노신 오버행 추가 가능성을 최대화할 수 있다.[3] 3'에서 5' 방향으로 엑소뉴클레아제 활성이 강한 열 안정성 중합효소는 3' 아데닌 돌출부를 남기지 않아 TA 클로닝에 적합하지 않다.[4]
표적 벡터는 선형화한 후 블런트엔드(무딘 말단부) 제한 효소로 절단한다. 이후 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 ddTTP로 꼬리를 붙이는데, 이때 하나의 T 잔기만 추가하기 위해 ddTTP를 사용하는 것이 중요하다. 이 과정을 통해 각 블런트엔드에 단일 3'-오버행 티민(T) 잔기를 갖는 벡터가 생성된다.[5]
2. 1. 인서트 (삽입물) 생성
인서트는 Taq 중합효소를 사용하여 PCR에 의해 생성된다. 이 중합효소는 3'에서 5' 방향으로 교정 활성이 없고, 높은 확률로 PCR 생성물의 각 말단에 단일 3'-아데닌(A) 돌출부를 추가한다. 말단 프라이머 아데노신 오버행을 추가하는 Taq DNA 중합효소의 가능성을 최대화하기 때문에 PCR 프라이머에 5' 말단에 구아닌(G)이 있는 것이 가장 좋다.[3] 광범위한 3'에서 5' 방향으로 엑소뉴클레아제 활성을 함유하는 열 안정성 중합효소는 이들이 3' 아데닌 돌출부를 남기지 않기 때문에 사용되어서는 안 된다.[4]2. 2. 벡터 생성
표적 벡터는 선형화되고 블런트엔드(무딘 말단부, blunt-end) 제한 효소(restriction enzyme)로 절단된다. 이어서, 이 벡터는 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 ddTTP로 꼬리가 달리게 된다. 하나의 T 잔류물만 추가하기 위해 ddTTP를 사용하는 것이 중요하다. 이 꼬리는 각 블런트엔드에 단일 3'-오버행 티민(T) 잔기를 갖는 벡터를 만든다.[5] 제조업체는 일반적으로 이미 선형화되고 돌출된 티민으로 태그가 지정된 광범위한 준비된 벡터가 있는 TA 클로닝 "키트"를 판매한다.3. TA 클로닝의 장단점
TA 클로닝은 서브 클로닝에 비해 여러 장단점을 가진다.
| 장점 | 단점 |
|---|---|
3. 1. 장점
TA 클로닝은 선형화된 벡터를 만들 때 외에는 제한 효소가 필요하지 않아 기존의 서브 클로닝보다 훨씬 간단하고 빠르다. 프라이머 설계 시 제한 부위를 추가할 필요가 없어 더 짧은 프라이머를 사용할 수 있으므로 시간과 비용을 절약할 수 있다. 또한, 전통적인 복제에 사용할 수 있는 적절한 제한 부위가 없는 경우 TA 클로닝이 종종 대안으로 사용된다.[6]3. 2. 단점
TA 클로닝의 주요 단점은 방향성 클로닝이 불가능하여, 유전자가 50% 확률로 반대 방향으로 클로닝될 가능성이 있다는 것이다.[6] 이외에도, TA 클로닝 절차는 기존의 서브 클로닝보다 훨씬 간단하고 빠르다. 프라이머 설계 시 제한 부위를 추가할 필요가 없어, 더 짧은 프라이머를 사용해 시간과 비용을 절약할 수 있다. 또한 전통적인 복제에 사용할 수 있는 실행 가능한 제한 사이트가 없는 경우 TA 복제가 종종 대안으로 사용된다.참조
[1]
웹인용
Improved TA Cloning
https://web.archive.[...]
Caister Academic Press
2009-10-17
[2]
웹인용
TA Cloning
http://www.premierbi[...]
2017-02-05
[3]
웹인용
TA cloning protocol
https://web.archive.[...]
Hubbart Center for Genomic Studies
2009-10-17
[4]
웹인용
TA Cloning Kit Manual
https://web.archive.[...]
Invitrogen
2009-10-17
[5]
저널
A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors
1991-03-11
[6]
웹인용
Improved TA Cloning
https://web.archive.[...]
Caister Academic Press
2009-10-17
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