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단백분해효소 K

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목차

1. 개요

단백분해효소 K는 소수성 아미노산 다음에 단백질을 소화하는 효소로, 칼슘 이온은 안정성에 기여하지만 활성에는 영향을 미치지 않는다. pH 4-12 범위에서 안정적이며, 37°C에서 50-60°C로 온도를 높이거나 SDS, 구아니딘, 요소 등을 첨가하면 활성이 증가한다. 핵산 정제 과정에서 뉴클레아제 억제를 위해 EDTA를 사용하며, 분자생물학에서 단백질을 분해하고 핵산 제제에서 오염 물질을 제거하는 데 널리 활용된다.

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2. 효소 활성

단백분해효소 K는 넓은 pH 범위(4-12)에서 안정적이며 최적 pH는 8.0이다.[18] 반응 온도를 37℃에서 50-60℃로 높이거나, 0.5-1% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 염산구아니딘(3M), 구아니디늄 티오시아네이트(1M), 요소(4M)를 첨가하면 활성이 증가하는데, 이는 기질 절단 부위에 대한 접근성을 높이기 때문이다.

65℃ 이상, 트리클로로 아세트산(TCA) 또는 세린 프로테아제 억제제 (AEBSF, PMSF, DFP)는 단백질분해효소 K의 활성을 억제한다. 반면 염산구아니딘, 구아니디늄 티오시아네이트, 요소, 사르코실, Triton X-100, 트윈 20, SDS, 시트레이트, 요오드아세트산, EDTA, Nα-Tosyl-Lys Chloromethyl Ketone (TLCK), Nα-Tosyl-Phe Chloromethyl Ketone (TPCK) 등은 단백질분해효소 K를 억제하지 않는다.

일반적으로 사용되는 완충액에서의 단백분해효소 K 활성은 다음과 같다.[7]

완충액 (pH = 8.0, 50 °C, 1.25 μg/mL 프로테아제 K, 15분 배양)프로테이나제 K 활성 (%)
30 mM Tris·Cl100
30 mM Tris·Cl; 30 mM EDTA; 5% 트윈 20; 0.5% Triton X-100; 800 mM GuHCl313
36 mM Tris·Cl; 36 mM EDTA; 5% 트윈 20; 0.36% Triton X-100; 735 mM GuHCl301
10 mM Tris·Cl; 25 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0.5% SDS128
10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 20 mM NaCl; 1% 사르코실74
10 mM Tris·Cl; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl2; 0.45% 트윈 20; 0.5% Triton X-100106
10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 0.5% SDS120
30 mM Tris·Cl; 10 mM EDTA; 1% SDS203


2. 1. 활성 조건

단백분해효소 K는 칼슘에 의해 활성화되며, 소수성 아미노산(지방족, 방향족 등)을 우선적으로 분해한다. 칼슘 이온은 효소 활성 자체에는 영향을 주지 않지만 안정성을 높인다.[17] 배양 시간과 효소 농도가 충분하면 단백질은 완전히 분해된다. 칼슘 이온을 제거하면 안정성은 낮아지지만 분해 활성은 유지된다.[6] 단백분해효소 K는 활성 중심 근처에 두 개의 칼슘 이온 결합 부위를 가지지만, 이들은 촉매 작용에 직접 관여하지 않는다. 잔류 활성은 핵산 제제에서 오염된 단백질을 분해하는 데 충분하다. 따라서 핵산 정제 시 단백분해효소 K를 사용할 때는 EDTA를 첨가하여 뉴클레아제와 같은 금속 이온 의존성 효소를 억제한다.

단백분해효소 K는 넓은 pH 범위(4-12)에서 안정하며, 최적 pH는 8.0이다.[5] 반응 온도를 37°C에서 50-60°C로 높이거나, 0.5-1% 도데실황산나트륨(SDS), 3M 염산구아니딘, 1M 구아니디늄 티오시아네이트, 4M 요소를 첨가하면 활성이 증가한다. 이러한 조건들은 기질 절단 부위에 대한 접근성을 높여 단백질분해효소 K 활성을 향상시킨다. 반면 65°C 이상, 트리클로로아세트산(TCA), 세린 단백질분해효소 억제제 (AEBSF, PMSF, DFP)는 활성을 억제한다.

단백분해효소 K는 염산구아니딘, 구아니디늄 티오시아네이트, 요소, 사르코실, Triton X-100, 트윈 20, SDS, 구연산, 요오드아세트산, EDTA, Nα-Tosyl-Lys Chloromethyl Ketone (TLCK), Nα-Tosyl-Phe Chloromethyl Ketone (TPCK) 등에 의해 억제되지 않는다.

일반적으로 사용되는 완충액에서의 단백분해효소 K 활성은 다음과 같다.[7]

완충액 (pH = 8.0, 50 °C, 1.25 μg/mL 단백분해효소 K, 15분 배양)단백분해효소 K 활성 (%)
30 mM Tris·Cl100
30 mM Tris·Cl; 30 mM EDTA; 5% 트윈 20; 0.5% Triton X-100; 800 mM GuHCl313
36 mM Tris·Cl; 36 mM EDTA; 5% 트윈 20; 0.36% Triton X-100; 735 mM GuHCl301
10 mM Tris·Cl; 25 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0.5% SDS128
10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 20 mM NaCl; 1% 사르코실74
10 mM Tris·Cl; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl2; 0.45% 트윈 20; 0.5% Triton X-100106
10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 0.5% SDS120
30 mM Tris·Cl; 10 mM EDTA; 1% SDS203


2. 2. 활성 측정

단백분해효소 K는 칼슘에 의해 활성화되며, 소수성 아미노산(지방족, 방향족 등) 다음에 오는 단백질을 우선적으로 분해한다. 칼슘 이온은 효소 활성에는 영향을 주지 않지만 안정성에 기여한다. 배양 시간을 길게 하고 효소 농도를 충분히 높이면 단백질이 완전히 소화된다. 칼슘 이온을 제거하면 효소 안정성은 감소하지만 단백질 분해 활성은 남는다.[17] 단백분해효소 K는 활성 중심 근처에 2개의 칼슘 이온 결합 부위를 가지지만, 촉매 작용에 직접 관여하지는 않는다. 잔류 활성은 핵산 제제에서 단백질을 제거하기에 충분하므로, 핵산 정제 시 단백분해효소 K 분해는 EDTA(뉴클레아제 등 금속 이온 의존성 효소 억제제) 존재 하에 수행된다.

단백분해효소 K는 넓은 pH 범위(4-12)에서 안정하며, 최적 pH는 8.0이다.[18] 반응 온도를 37℃에서 50-60℃로 높이거나, 0.5-1% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 또는 염산구아니딘(3M), 구아니디늄 티오시아네이트(1M), 요소(4M)를 첨가하면 활성이 증가한다. 이는 기질 절단 부위에 대한 접근성을 높여 단백질 분해 효소 K 활성을 향상시킨다. 65℃ 이상, 트리클로로 아세트산(TCA) 또는 세린 프로테아제 억제제 (AEBSF, PMSF, DFP)는 활성을 억제한다. 단백분해효소 K는 염산구아니딘, 구아니디늄 티오시아네이트, 요소, 사르코실, Triton X-100, 트윈 20, SDS, 시트레이트, 요오드아세트산, EDTA, Nα-Tosyl-Lys Chloromethyl Ketone (TLCK), Nα-Tosyl-Phe Chloromethyl Ketone (TPCK) 등에 의해 억제되지 않는다.

'''일반적으로 사용되는 완충액에서 단백분해효소 K 활성'''[7]

완충액 (pH = 8.0, 50 °C, 1.25 μg/mL 프로테아제 K, 15분 배양)프로테이나제 K 활성 (%)
30 mM Tris·Cl100
30 mM Tris·Cl; 30 mM EDTA; 5% 트윈 20; 0.5% Triton X-100; 800 mM GuHCl313
36 mM Tris·Cl; 36 mM EDTA; 5% 트윈 20; 0.36% Triton X-100; 735 mM GuHCl301
10 mM Tris·Cl; 25 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0.5% SDS128
10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 20 mM NaCl; 1% 사르코실74
10 mM Tris·Cl; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl2; 0.45% 트윈 20; 0.5% Triton X-100106
10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 0.5% SDS120
30 mM Tris·Cl; 10 mM EDTA; 1% SDS203


2. 3. 억제제

단백분해효소 K는 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), 디이소프로필플루오로포스페이트(DFP), 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드(AEBSF)와 같은 세린 프로테아제 억제제에 의해 억제된다.[20] 반면, 설프히드릴 변형 시약인 파라-클로로머큐리벤조산(PCMB), N-알파-토실-L-리실-클로로메틸-케톤(TLCK), N-알파-토실-L-페닐알라닌 클로로메틸 케톤(TPCK)에는 영향을 받지 않는다. 단, 이러한 시약이 단백분해효소 K 티올을 노출시키는 이황화물 환원 시약과 함께 사용될 경우에는 억제될 수 있다.[21]

65 °C 이상의 온도, 트리클로로아세트산(TCA), 세린 단백질 분해 효소 억제제인 AEBSF, PMSF, DFP는 단백질분해효소 K의 활성을 억제한다.

염산구아니딘, 구아니디늄 티오시아네이트, 요소, 사르코실, Triton X-100, 트윈 20, SDS, 구연산, 요오드아세트산, EDTA, Nα-Tosyl-Lys Chloromethyl Ketone (TLCK), Nα-Tosyl-Phe Chloromethyl Ketone (TPCK)과 같은 세린 단백질 분해 효소 억제제는 단백질분해효소 K를 억제하지 않는다.

3. 응용

단백분해효소 K는 세포 용해물(조직, 세포 배양 세포) 내 단백질을 파괴하고 핵산을 방출하는 데 사용되는데, 이는 DNase와 RNase를 매우 효과적으로 불활성화하기 때문이다. 응용 예시로, 박테리아에서 게놈 DNA를 정제(miniprep)할 때 포화 액체 배양의 박테리아를 용해하고 37°C에서 1시간 동안 100 μg/ml의 단백분해효소 K로 분해하여 단백질을 제거한다.

천연 단백질에 대한 효소의 활성은 SDS와 같은 변성제에 의해 자극을 받는다. 반면, 펩타이드 기질을 사용하여 측정할 때 변성제는 효소를 억제한다. 이는 변성제가 단백질 기질을 펼쳐서 프로테아제에 더 쉽게 접근할 수 있도록 하기 때문이다.[19]

3. 1. 핵산 정제

단백분해효소 K는 분자생물학에서 단백질을 분해하고 핵산 제제에서 오염을 제거하는 데 사용된다. 핵산 제제에 단백분해효소 K를 첨가하면 정제 과정에서 DNA 또는 RNA를 분해할 수 있는 뉴클레아제가 빠르게 비활성화된다. 이 효소는 SDS, 요소와 같은 단백질 변성 화학 물질, EDTA와 같은 킬레이트제, 설프히드릴(sulfhydryl) 시약, 트립신 또는 키모트립신 억제제가 있는 환경에서도 활성을 나타내기 때문에 이 응용 분야에 매우 적합하다.[19]

단백분해효소 K는 DNase와 RNase를 매우 효과적으로 비활성화하므로 세포 용해물(조직, 세포 배양 세포)에서 단백질을 파괴하고 핵산을 방출하는 데 사용된다. 특히 0.5–1% SDS가 있으면 대부분의 미생물 또는 포유류 DNase와 RNase가 효소에 의해 빠르게 비활성화되기 때문에, 단백분해효소 K는 고도로 고유하고 손상되지 않은 DNA 또는 RNA를 분리하는 데 매우 유용하다.

천연 단백질에 대한 효소의 활성은 SDS와 같은 변성제에 의해 자극을 받는다. 반면, 펩티드 기질을 사용하여 측정하면 변성제는 효소를 억제한다. 변성제가 단백질 기질을 펼쳐서 프로테아제에 더 쉽게 접근할 수 있도록 만들기 때문에 이러한 결과가 나타난다.[19]

3. 2. 기타 응용

단백분해효소 K는 분자생물학에서 단백질을 분해하고 핵산 제제에서 오염을 제거하는 데 일반적으로 사용된다. 핵산 제제에 단백분해효소 K를 첨가하면 정제 과정에서 DNA 또는 RNA를 분해할 수 있는 뉴클레아제가 빠르게 비활성화된다. 이 효소는 SDS, 요소와 같은 단백질 변성 화학 물질, EDTA와 같은 킬레이트제, 설프히드릴(sulfhydryl) 시약, 트립신 또는 키모트립신 억제제가 있는 환경에서도 활성을 나타내기 때문에 이 응용 분야에 매우 적합하다.[19]

단백분해효소 K는 DNase와 RNase를 매우 효과적으로 비활성화하므로 세포 용해물(조직, 세포 배양 세포)의 단백질 파괴 및 핵산 방출에 사용된다. 특히 0.5–1% SDS가 있는 환경에서는 대부분의 미생물 또는 포유류 DNase와 RNase가 효소에 의해 빠르게 비활성화되기 때문에 고도로 고유하고 손상되지 않은 DNA 또는 RNA 분리에 매우 유용하다.[19]

천연 단백질에 대한 효소의 활성은 SDS와 같은 변성제에 의해 자극을 받는다. 반대로, 펩티드 기질을 사용하여 측정할 때 변성제는 효소를 억제한다. 이러한 결과는 변성제가 단백질 기질을 펼쳐서 프로테아제에 더 쉽게 접근할 수 있도록 만들기 때문이다.[19]

참조

[1] 논문 Structure of the complex of proteinase K with a substrate analogue hexapeptide inhibitor at 2.2-A resolution 1993-07
[2] 논문 Specificity of proteinase K from ''Tritirachium album'' Limber for synthetic peptides
[3] 논문 The specificity of proteinase K against oxidized insulin B chain 1976-02
[4] 논문 Amino acid sequence of proteinase K from the mold ''Tritirachium album'' Limber 1986
[5] 논문 Proteinase K from Tritirachium album Limber 1974-08
[6] 논문 Crystal structure of calcium-free proteinase K at 1.5-A resolution 1994-09
[7] 웹사이트 Frequently asked questions about Proteinase K https://agscientific[...] 2020-10-15
[8] 논문 Stimulation of Proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins
[9] 웹사이트 PROK - Proteinase K precursor - Parengyodontium album https://www.uniprot.[...] 2019-12-11
[10] 웹사이트 Novagen Proteinase K protocol https://www.sigmaald[...] 2019-12-11
[11] 논문 Proteinase K from Tritirachium album Limber http://www.blackwell[...]
[12] 논문 Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins
[13] 논문 Specificity of proteinase K from ''Tritirachium album'' Limber for synthetic peptides
[14] 논문 The specificity of proteinase K against oxidized insulin B chain 1976-02
[15] 논문 Amino acid sequence of proteinase K from the mold ''Tritirachium album'' Limber 1986
[16] 논문 Proteinase K from Tritirachium album Limber 1974-08
[17] 논문 Crystal structure of calcium-free proteinase K at 1.5-A resolution 1994-09
[18] 논문 Proteinase K from Tritirachium album Limber 1974-08
[19] 논문 Stimulation of Proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins
[20] 웹인용 PROK - Proteinase K precursor - Parengyodontium album https://www.uniprot.[...] 2019-12-11
[21] 웹인용 Novagen Proteinase K protocol https://www.sigmaald[...] 2019-12-11


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