락토스 오페론

3. 조절

락토스 오페론의 조절은 락토스 유무와 포도당 농도에 따라 두 가지 방식으로 이루어진다. 락토스가 없을 때는 음성 조절이 일어나 ''lac'' 억제자가 작동자에 결합하여 전사를 억제하고, 락토스가 존재하면 억제자가 작동자에서 떨어져 나가 전사가 일어난다. 포도당 농도가 낮으면 cAMP 농도가 높아져 CAP-cAMP 복합체가 형성되고, 이 복합체가 프로모터에 결합하여 RNA 중합효소의 결합을 도와 전사를 촉진하는 양성 조절이 일어난다.

• 음성 조절: ''lacI'' 유전자는 ''lac'' 억제자(LacI)를 생성하는데, 이 억제자는 락토스가 없을 때 ''lac'' 오페론의 오퍼레이터(''lacO'')에 결합하여 RNA 중합효소가 프로모터에 결합하는 것을 막는다. 락토스가 존재하면 락토스 대사 산물인 알로락토스가 억제자와 결합하여 구조를 변화시켜 오퍼레이터에 결합하지 못하게 한다. 그러면 RNA 중합효소가 프로모터에 결합하여 ''lac'' 유전자를 전사할 수 있게 된다.^[7]

• 양성 조절: 포도당 농도가 낮으면 세포 내 cAMP 농도가 높아진다. cAMP는 CAP(카타볼라이트 활성 단백질)와 결합하여 CAP-cAMP 복합체를 형성한다. 이 복합체는 프로모터 상류의 CAP 결합 부위에 결합하여 RNA 중합효소의 프로모터 결합을 촉진한다.^[8]

3. 1. 음성 조절

3. 1. 1. 억제자 구조

3. 1. 2. 유도 메커니즘

• -'''상단''': 유전자는 본질적으로 꺼져 있다. 알로락토스가 없어서 ''lac'' 억제자를 억제할 수 없으므로, 억제자는 오퍼레이터에 단단히 결합하여 RNA 중합효소가 프로모터에 결합하는 것을 방해하고, 그 결과 ''laczya'' mRNA 전사체가 생성되지 않는다.

• 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)는 생리학적 연구를 위해 lac^영어 오페론 유도제로 자주 사용된다.^[13] IPTG는 억제 물질에 결합하여 비활성화시키지만, β-갈락토시다아제의 기질은 아니다.

• Allolactose(알로락토스)는 락토스의 이성질체이며, lac^영어 오페론의 유도제이다. 락토스는 갈락토스-β(1→4)-글루코스인 반면, 알로락토스는 갈락토스-β(1→6)-글루코스이다. 락토스는 가수분해 반응과 다른 반응으로 β-갈락토시다아제에 의해 알로락토스로 전환된다.

3. 2. 양성 조절

3. 2. 1. 카타볼라이트 억제 (Catabolite repression)

3. 2. 2. 유인 (Recruitment)

3. 3. 기타 양성 조절

4. 락토스 유사체

이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)는 락토스 오페론 연구에 자주 사용되는 물질이다. IPTG는 억제 물질에 결합하여 비활성화시키지만, β-갈락토시데이스의 기질은 아니다. 생체 내 연구에서 IPTG를 사용하는 이유는 ''대장균''에서 대사되지 않아 농도가 일정하게 유지되기 때문이다. 이는 ''lac p/o''로 제어되는 유전자의 발현 속도가 실험에서 변수가 아니라는 장점으로 작용한다.^[13]

페닐-β-D-갈락토스(페닐-Gal)는 β-갈락토시데이스의 기질이지만, 억제 물질을 비활성화시키지 않아 유도제가 아니다. 억제 물질이 없는 돌연변이는 페닐-Gal에서 성장할 수 있다는 특징이 있다.

티오메틸 갈락토사이드(TMG)는 락토스 유사체로, lacI 억제 물질을 억제한다.

ONPG(ONPG)는 β-갈락토시데이스에 의해 분해되면 orthonitrophenol(오르토니트로페놀)이라는 노란색 화합물을 생성한다. 이 특징을 이용하여 β-갈락토시데이스 생체 외 분석에 사용된다.^[15]

5. 돌연변이

락토스 오페론의 돌연변이는 락토스 대사 과정에 다양한 영향을 미칠 수 있다.

오페레이터의 돌연변이는 구조 유전자를 전혀 발현시키지 않거나(비유도형 돌연변이), 음성 제어를 받지 않고 항상 발현하게 한다(구성적 돌연변이). 구성적 돌연변이의 경우, ''lac'' 억제자(리프레서)가 결합하지 못하는 것이 원인이다. 오퍼레이터는 직접 연결된 유전자에만 작용(시스 작용)하기 때문에, 세포 내에 다른 대립 유전자가 있어도 영향을 받지 않는다. 이러한 유전자 돌연변이를 시스 우성이라고 하며, 다른 락토스 오페론의 정상/이상 여부와 관계없이 발현에 영향을 준다.^[26]

''lac'' 억제자를 만드는 ''lacI'' 유전자의 돌연변이(''lacI''^-)도 구성적 돌연변이를 일으킨다. 하지만 이 경우는 세포 내 모든 락토스 오페론에 영향을 주는 트랜스 작용을 한다. 정상 유전자(''lacI''⁺)를 도입하면 음성 제어가 회복되므로 시스 열성이다.^[26] 반면 시스 우성인 오퍼레이터 돌연변이는 정상 유전자가 도입되어도 영향을 받지 않는다.

락토스 오페론의 비유도형 돌연변이는 유전학적으로 두 가지로 나뉜다. 하나는 프로모터에 대한 것으로 시스 우성이다.^[26] 다른 하나는 ''lac'' 억제자가 유도 인자와 결합하지 못하게 되는 것(''lacI''^S)이다.^[26] 이 변형된 억제자는 양성 제어를 무시하고 항상 오퍼레이터와 결합하여 활성 인자나 정상 ''lac'' 억제자가 떼어낼 수 없다.

''lac'' 억제자는 돌연변이에 의해 다양한 형태가 존재하며, 사량체이므로 서로 다른 종류의 서브유닛이 회합하는 경우도 있다. 이를 대립 유전자 간 상호 보완성이라고 한다. 어떤 억제자 돌연변이는 음성 상호 보완성을 일으킨다. 예를 들어 ''lacI^-d''와 ''lacI⁺'' 유전자 조합에서 ''lacI^-d''는 오퍼레이터에 결합할 수 없는 ''lac'' 억제자를 생산하여 음성 제어에 기여하지 못한다. 원래 트랜스 작용 유전자의 돌연변이는 열성이지만, ''lacI^-d''는 정상 ''lacI'' 유전자가 있어도 음성 제어를 상실시킨다. 생산된 "나쁜" 서브유닛이 자신뿐 아니라 사량체의 일부로서 "좋은" 서브유닛이 오퍼레이터에 결합하는 것도 방해하기 때문이다.^[26] 이러한 돌연변이를 도미넌트 네거티브 돌연변이라고 한다.

6. 역사

프랑수아 자코브와 자크 모노는 실험에 일반적인 실험실 세균인 ''대장균''(E. coli)을 사용했지만, 그들이 발견한 많은 기본적인 조절 개념은 모든 유기체의 세포 조절에 기본이 된다.^[17]

오페론의 역사는 1940년 자크 모노가 β-갈락토시다아제의 발현에 대해 연구를 시작하면서 시작되었다. 락토스를 대사하는 이 효소는 락토스나 다른 갈락토사이드의 존재에 의해 증가한다는 것을 발견했다. 모노와 멜빈 콘(Melvin Cohn) 등은 항체를 사용하여 이를 확인하고, 유전자가 유도되는 것이 원인임을 알았다.^[26]

모노는 β-갈락토시다아제를 생산할 수 있지만 락토스를 영양으로 증식할 수 없는 돌연변이에 대한 연구를 통해 동시에 전사되는 유전자군의 존재를 알게 되었다. 야생형과 돌연변이형에 방사성 갈락토사이드를 투여했을 때, β-갈락토시다아제 유전자가 유도되지 않으면 둘 다 섭취할 수 없었다. 유도하면 야생형은 할 수 있지만, 돌연변이형은 할 수 없었다. 이것은 돌연변이형이 갈락토사이드를 섭취하는 데 필요한 물질이 부족하며, 그것은 β-갈락토시다아제와 함께 발현된다는 것을 의미한다. 이 가상 물질을 모노는 갈락토사이드 퍼미아아제라고 명명했다. 그러나 분리하여 존재를 확인하기 전에 단백질을 명명한 것은 공동 연구자들의 비난을 받았다. 모노는 나중에 "전통적인 두 명의 영국 신사는 서로 이름과 평판을 잘 알고 있더라도, 정식으로 소개되기 전까지는 서로 말을 걸지 않는다는 이야기를 떠올렸다"고 말했다.^[26] 실험 후 갈락토사이드 퍼미아아제의 정제를 실시했지만, 그 과정에서 갈락토사이드 트랜스아세틸라아제도 얻었다. 이 단백질은 β-갈락토시다아제 및 갈락토사이드 퍼미아아제와 함께 발현되기 때문이다.

1950년대까지 모노는 3개의 효소가 갈락토사이드를 동시에 유도한다는 것을 확인했다. 또한, 유도를 필요로 하지 않는 '''구성적 돌연변이체'''(constitutive mutation)도 발견했다. 이것은 항상 3개의 유전자를 깨어 있게 한다. 유전학 연구를 진전시키기 위해 파스퇴르 연구소에서 프랑수아 자코브와 공동 연구를 시작했다.^[26] 아서 파디의 협력으로 유도를 필요로 하는('''유도성''') 야생형 대립 유전자와 구성적 돌연변이체를 모두 가진 '''부분 이배체'''(merodiploid)를 제작했다.^[26] 유도성 대립 유전자가 우성이라는 것이 증명되었고, 유도 전에 발현을 막는 것은 유전자가 아닌 다른 물질임이 판명되었다. 구성적 돌연변이체는 ''lac'' 억제자 유전자(''lacI'')가 결손되어 있다는 것을 확인했다.

''lac'' 억제자(LacI)가 DNA의 특정 영역에 결합한다고 예상하는 것은 쉬운 일이다. 자코브와 모노는 이 영역을 오퍼레이터라고 명명하고, 돌연변이의 영향이 크다고 생각했다. 존재를 확인하기 위해 ''lacI''와 다른 곳에서의 돌연변이가 구성적 돌연변이를 일으키는 것을 증명했다. ''lacI'' 돌연변이는 우성, 오퍼레이터 돌연변이는 열성이라는 이론으로, 자코브는 세균 부분 이배체의 유도성과 구성적 돌연변이의 두 오퍼레이터를 집의 문을 제어하는 두 라디오 수신기에, 두 리프레서 유전자를 문을 닫은 상태로 유지하는 신호를 보내는 송신기에 비유했다.^[26] 하나의 리프레서 유전자가 돌연변이하면 송신기 하나가 고장 나지만, 다른 송신기가 살아있어 두 문은 닫힌다. 즉, 두 유전자군은 억제되므로 이 돌연변이는 열성이다. 구성적 돌연변이의 이상이 오퍼레이터에서 일어나면 수신기 하나가 고장 나 문은 열린 상태로 유지된다. 다른 기능하는 수신기의 문은 닫힌 채로 유지되어 유전자 발현이 가능하므로 이 돌연변이는 우성이다. 이처럼 같은 유전자에 대해서만 우성이고, 부분 이배체의 다른 DNA 상에서는 열성인 돌연변이를 '''시스 우성'''(''cis''-dominant)이라고 한다. 자코브와 모노는 시스 우성('''구성적 오퍼레이터''' operator constitutive에서 O^c로 표시)을 발견하고 오퍼레이터 존재를 증명했다.

자코브와 모노의 연구 후, 1960년대에 월터 길버트와 Benno Muller-Hill은 ''lac'' 억제자를 부분적으로 정제했다.^[26] 유전자 클로닝은 아직 개발되지 않았고, 가장 민감도가 높은 생물학적 분석은 '''이소프로필티오갈락토사이드'''(IPTG)였다. 세포 추출액의 ''lac'' 억제자 농도가 너무 낮아 검출할 수 없어, IPTG에 강하게 결합하는 변이 ''lacI^t''를 가진 대장균을 사용했다.

DNA와 결합한 ''lac'' 억제자(LacI)는 니트로셀룰로스 필터 결합법으로 검출할 수 있다. 길버트의 방법으로 정제한 ''lac'' 억제자를 농도별로 나누어, 멜빈 콘은 IPTG 유무에 따라 결합 비율을 조사했다.^[26] 이 결과는 유도 인자가 오퍼레이터 접근을 억제함을 나타낸다. 콘 등은 구성적 돌연변이 오퍼레이터(''lacO^c'')를 포함하는 DNA는 야생형보다 고농도를 요구한다는 것도 밝혔다. 자코브와 모노가 오퍼레이터로 정의한 DNA 영역은 리프레서에 결합된다는 것을 확인할 수 있다.

오퍼레이터 점유가 왜 음성 조절로 이어지는지에 대해서는 여러 설이 있지만, 전사를 실행하는 효소 '''RNA 중합효소'''(RNA polymerase)를 방해한다고 생각된다. RNA 중합효소는 전사를 시작하기 위해 프로모터에 결합해야 하는데, 프로모터는 오퍼레이터 바로 옆이다. 음성 조절 해명은 우여곡절을 겪었다. ''lac'' 억제자는 프로모터 접근을 막는 장애물로 생각되었으나, 1971년 Ira Pastan은 ''lac'' 억제자 존재 하에서도 강력한 결합이 일어난다는 것을 밝혔다.^[26] 1987년 Susan Straney와 Donald Crothers 등은 두 개가 DNA에 동시에 결합할 수 있다는 것을 확인했다.^[26] ''lac'' 억제자는 DNA 결합 후 RNA 중합효소에 영향을 준다고 생각하게 되었다. Barbara Krummel과 Michael Chamberlin 등은 초기 전사 복합체의 탈출을 억제한다고 생각했다.^[26] 이 가설이 옳다면 어보티브 전사체^[26]가 만들어지지만, Jookyung Lee와 Alex Goldfarb 등은 ''lac'' 억제자 존재 하에서 6nt의 RNA를 얻었다.^[26] Lee와 Goldfarb 등의 실험과 인용된 다른 실험 조건은 RNA 중합효소와 ''lac'' 억제자 농도가 큰 등 생체 조건과 달랐다. Thomas Record 등은 생체에 가까운 조건에서 어보티브 전사체의 합성 속도를 측정했다.^[26] RNA 중합효소와 락토스 오페론 프로모터 복합체를 만들고, (1) 단독 (2) 전사 억제제 헤파린 첨가 (3) ''lac'' 억제자 첨가 (4) 복합체 없음의 4가지 경우를 실험했다. (1)에서는 어보티브 전사체가 문제없이 합성되었지만, (2)와 (3)은 유사한 억제가 일어났다. 헤파린은 유리 상태일 때 결합하고 DNA와 결합하지 않도록 하는 단백질로, DNA와 RNA 중합효소 중 어느 쪽이 먼저 만나는지 경쟁한다. 경쟁적 억제 양식이며, ''lac'' 억제자가 이 형식의 억제제임이 분명하다. 현재는 DNA 결합을 RNA 중합효소와 경쟁한다는 초기 가설이 유력하다.

1978년 윌리엄 레즈니코프는 락토스 오페론의 주요 프로모터 22bp 상류에 다른 프로모터가 있다는 것을 발견했다.

1984년 Wing Wu와 도널드 크로더스는 CAP-cAMP에 의한 '''DNA 굴곡'''을 전기 영동으로 측정했다. DNA는 굽으면 이동도가 작아지고, 꺾인 부분이 중앙에 가까울수록 현저해진다. 크로더스는 활성제 결합 부위가 다른 동일 길이 DNA 단편을 여러 개 준비하고 CAP-cAMP 복합체에 결합시켰다. 전기 영동으로 이동도 차이를 측정해 굴곡 각도를 90°로 추정했다. 1991년 토마스 A. 스테이츠에 의해 약 100°로 수정되었다.

1996년 미첼 루이스는 ''lac'' 억제자 및 오퍼레이터를 포함하는 21bp DNA 단편과의 복합체를 X선 결정 구조 분석했다.^[26] ''lac'' 억제자 사량체의 두 이량체는 각각 DNA의 다른 부위에 결합한다는 것이 명백해졌다.

2002년 리처드 에브라이트는 DNA와 CAP-cAMP 복합체, RNA 중합효소 αCTD 복합체를 X선 결정 구조 분석했다. αCTD가 결합하기 쉽도록 CAP 결합 부위에 인접한 서열을 친화성이 큰 A-T 고함유 서열(5'-AAAAAA-3')로 바꿨다.

7. 분자생물학에서의 활용

''lac'' 유전자와 그 유도체는 투-하이브리드 분석과 같은 여러 세균 기반 선택 기술에서 리포터 유전자로 사용될 수 있다. 이는 성공적인 전사 활성 인자가 특정 프로모터 서열에 결합했는지 여부를 결정해야 하기 때문이다.^[16] X-gal을 포함한 LB 배지에서 흰색 집락이 파란색 음영으로 바뀌는 것은 약 20–100 β-갈락토시다제 단위에 해당하며, 테트라졸륨 락토스 및 MacConkey 락토스 배지는 100–1000 단위 범위를 가진다. 이 범위의 높고 낮은 부분에서 각각 가장 민감하다.^[16] MacConkey 락토스 및 테트라졸륨 락토스 배지는 모두 락토스 분해 산물에 의존하므로, ''lacZ'' 유전자와 ''lacY'' 유전자 모두의 존재가 필요하다. 따라서 ''lacZ'' 유전자만 포함하는 많은 ''lac'' 융합 기술은 X-gal 배지^[16] 또는 ONPG 액체 배지에 적합하다.^[24]

참조

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