질소고정효소

3. 분류

질소고정효소는 활성 중심에 포함된 금속 종류에 따라 세 가지로 분류된다.^[10]

• 몰리브덴(Mo) 함유 질소고정효소: 가장 일반적인 유형으로, 대부분의 질소고정세균이 가지고 있으며 자연계 질소 고정의 대부분을 담당한다.^[62]
• 바나듐(V) 함유 질소고정효소: 몰리브덴이 부족한 환경에서 대체 질소고정효소로 작용한다.^[63]
• 철(Fe) 함유 질소고정효소: 몰리브덴이 부족한 환경에서 대체 질소고정효소로 작용한다.^[63]

모든 질소고정세균은 몰리브덴 함유 질소고정효소를 가지며, 바나듐 및 철 함유 질소고정효소만 갖는 경우는 아직 발견되지 않았다.^[62]

방선균의 일종인 ''Streptomyces thermoautotrophicus''에서는 기존 질소고정효소와 전혀 다른 네 번째 그룹이 발견되었는데, 이 효소는 몰리브도프테린을 활성 중심으로 가지며 서브 유닛 구성 등이 다르다.^[69]

4. 구조

질소 고정 효소는 크게 두 가지 단백질 복합체로 구성된다. 활성 중심을 가진 질소 고정 효소 이량체(Dinitrogenase, Mo-Fe 단백질, component I)와 질소 고정 효소 이량체를 환원하는 질소 고정 효소 환원 효소(Dinitrogenase reductase, Fe 단백질, component II)가 그것이다.^[62] 기능 단위는 질소 고정 효소 이량체 및 질소 고정 효소 환원 효소 이량체의 헤테로 사량체를 이루지만, 생체 내에서는 헤테로 사량체 2개가 결합하여 헤테로 팔량체 구조로 기능한다.

4. 1. 질소 고정 효소 이량체 (Dinitrogenase)

• P-클러스터의 코어(Fe₈S₇)는 중심 황 원자에 의해 연결된 두 개의 [Fe₄S₃] 큐브 형태를 취한다. 각 P-클러스터는 6개의 시스테인 잔기에 의해 MoFe 단백질에 연결되어 있다.
• 각 FeMo 보조 인자(Fe₇MoS₉C)는 두 개의 비동일 클러스터([Fe₄S₃] 및 [MoFe₃S₃])로 구성되며, 이들은 3개의 황화 이온에 의해 연결된다. 각 FeMo 보조 인자는 하나의 시스테인 잔기와 하나의 히스티딘 잔기에 의해 단백질의 α 서브유닛에 공유 결합되어 있다.

4. 2. 질소 고정 효소 환원 효소 (Dinitrogenase reductase)

전자의 전달에는 ATP의 결합 및 가수분해로부터 오는 화학 에너지의 투입이 필요하다. ATP의 가수분해는 또한 질소고정효소 복합체 내에서 입체 구조 변화를 일으켜, Fe 단백질과 MoFe 단백질을 더 가깝게 하여 전자 전달을 용이하게 한다.^[4]

질소 고정 효소 환원 효소의 유전자는 ''nifH''이다. 기능 단위는 호모 이량체이며, 분자량은 120 kDa이다. 니트로게나제 환원 효소 내에는 1개의 [4Fe-4S] 클러스터 및 2개의 Mg-ATP 결합 부위를 가지고 있다. [4Fe-4S] 클러스터는 호모 이량체 각각의 시스테인에 의해 배위되며, P-클러스터와 마찬가지로 서브 유닛 사이에 배치되어 있다. 한편, Mg-ATP 결합 부위에 대해서는, 호모 이량체의 서브 유닛 각각에 존재한다.

5. 반응 메커니즘

질소 고정 효소의 반응 메커니즘은 복잡하며, 여러 단계의 전자 전달과 양성자 이동을 포함한다. 1960년에 Carnahan 등은 ''C. pasteurianum'' 무세포 표본으로 질소 고정 반응에 성공했다.^[70][71] 이후 연구를 통해 질소 고정 효소가 두 가지 구성 요소, 즉 질소 고정 효소 이량체와 질소 고정 효소 환원 효소에 의해 기능한다는 것이 밝혀졌다.^[72]

질소 고정 효소는 아래의 5가지 성분이 있을 때 질소 고정 반응을 수행한다.^[73][74][75]

이 성분들은 순서대로 전자를 전달한다. 질소 고정 반응의 순서는 다음과 같다.

# 질소 고정 효소 환원 효소에 ATP와 마그네슘이 결합하여 복합체를 형성하고, 표준 산화 환원 전위가 -400 mV 부근까지 낮아진다.

# 전자 공여체에서 질소 고정 효소 환원 효소-MgATP 복합체로 전자가 전달되어 복합체가 환원된다.

# 복합체의 ATP가 가수분해되어 더 낮은 전위의 전자가 되고, 결합된 ATP는 ADP가 된다.

# 질소 고정 효소 환원 효소-MgADP 복합체의 4Fe-4S 클러스터를 통해 질소 고정 효소 이량체의 P-cluster로 전자가 전달된다.

# 질소 고정 효소 이량체의 P-cluster에서 FeMo-co로 전자가 전달된다.

# FeMo-co가 질소를 2전자 환원하여 N₂H₂을 생성한다.

# FeMo-co가 N₂H₂를 추가로 2전자 환원하여 N₂H₄을 생성한다.

# FeMo-co가 N₂H₄를 추가로 2전자 환원하여 2개의 암모니아를 생성한다.

# 질소 환원과 동시에 양성자도 환원되어 수소가 발생한다.

Lowe-Thorneley(LT) 모델은 이러한 실험에서 개발되었으며, 반응에 필요한 8개의 상관된 양성자 및 전자 이동을 설명한다.^[9][16][17] 각 중간 단계는 E_n (n = 0–8)으로 표시되며, 이동된 당량 수를 나타낸다. 질소 환원은 균형 화학 반응에서 예측된 6당량과 달리 8당량의 양성자와 전자를 필요로 한다.^[18]

5. 1. 일반적인 메커니즘

5. 2. Lowe-Thorneley 동역학 모델

5. 3. 중간체 E₀부터 E₄까지

위의 중간체는 금속 클러스터가 원래의 산화 상태와 단일 환원 상태 사이에서 순환하며, 추가 전자가 수소화물에 저장됨을 시사한다. 각 단계에서 수소화물이 형성되고 금속 클러스터가 실제로 원래의 산화 상태와 단일 산화 상태 사이에서 순환한다는 대안적인 제안도 있다.^[9]

5. 4. N₂ 고정을 위한 말단 및 교번 경로

• 말단 경로: 말단 질소가 먼저 수소화되어 암모니아를 방출하고, 그 후 금속에 직접 결합된 질소가 수소화된다.
• 교번 경로: 수소가 말단 질소에 추가된 다음, 금속에 직접 결합된 질소에 추가된다. 이 과정은 암모니아가 방출될 때까지 반복된다.^[9][24][25]

• 철 단독 모델 클러스터가 N₂를 촉매적으로 환원하는 것으로 나타났다.^[27][28]
• 작은 텅스텐 클러스터도 질소 고정을 위해 교번 경로를 따르는 것으로 나타났다.^[30]
• 바나듐 질소 고정효소는 교번 메커니즘에 특정한 중간 생성물인 히드라진을 방출한다.^[9][31]

5. 5. MgATP 결합 메커니즘

• 잔기 15 (라이신): MgATP가 없을 때 잔기 125인 아스파르트산 사이에 염다리가 존재한다.^[33] 결합 시 이 염다리는 끊어진다.
• 부위 지향적 돌연변이 유발 결과, 라이신이 글루타민으로 대체되면 단백질의 MgATP에 대한 친화력이 크게 감소한다.^[34]
• 라이신이 아르기닌으로 대체되면 염다리가 너무 강해져 MgATP가 결합할 수 없다.^[35]
• 잔기 125 (아스파르트산): 글루탐산으로 돌연변이되었을 때 변경된 반응성이 관찰되어 해당 잔기의 필요성이 나타났다.^[36]
• 잔기 16 (세린): MgATP에 결합하는 것으로 나타났으며, 부위 지향적 돌연변이 유발로 증명되었다.^[36] 세린은 인산염 가수분해 후 Mg²⁺ 이온에 계속 배위되어 현재 ADP 분자의 다른 인산염과의 연관성을 촉진한다는 모델이 제시되었다.^[37]

6. 관련 유전자 및 기능

니트로게나아제 이량체의 유전자는 ''nifD'' 및 ''nifK''이며, 각각 α 및 β 서브유닛을 암호화한다.^[62] αβ 구조가 기능 단위이지만, 생체 내에서는 α₂β₂ 구조를 가지며, 분자량은 220 - 240 kDa 정도이다. αβ 구조 내에는 활성 중심인 철-몰리브덴 보조 인자(FeMo-co) 및 전자 전달을 담당하는 P-cluster가 하나씩 배위하고 있다.

니트로게나아제 환원 효소의 유전자는 ''nifH''이다.^[62] 기능 단위는 호모 이량체이며, 분자량은 120 kDa이다. 니트로게나아제 환원 효소 내에는 1개의 [4Fe-4S] 클러스터 및 2개의 Mg-ATP 결합 부위를 가지고 있다.

P 클러스터나 FeMo-co와 같은 복잡한 금속 클러스터는 자발적으로 구축되지 않으며, 다양한 단백질이 구축에 관여한다. 질소 고정 효소 구조 유전자 발현 후, 단백질 내에 클러스터가 배위되는 발현 후 프로세싱을 거쳐 활성을 발휘하는데, 이 일련의 현상을 성숙화(maturation)라고 한다. 또한, 질소 고정 효소는 발현에 있어서 다양한 조절을 받으며, 이에 관련된 유전자도 다수 존재한다. ''A. vinelandii''나 ''K. pneumoniae''의 질소 고정 효소 유전자 기능 분석을 통해, 질소 고정 효소와 관련된 유전자 전체의 모습이 밝혀지고 있다.^[77][78][79]

지금까지 밝혀진 질소 고정 효소 관련 유전자군(''nif'' 유전자)의 명칭 및 기능은 다음과 같다.

바나듐 함유 및 철형 질소 고정 효소도, 각각 ''vnf'' 유전자군(Vanadium Nitrogen Fixation) 및 ''anf'' 유전자군(Alternative Nitrogen Fixation)을 각각 가지고 있으며, 유사한 기전으로 발현에 관여하는 것으로 생각된다.^[80] 몇몇 'nif' 유전자는 바나듐 함유 및 철형 질소 고정 효소에서 공유된다.^[81]

7. 발현 조절

질소고정효소 계는 다량의 ATP를 요구하기 때문에, 산화적 인산화 또는 광인산화가 일어나는 조건에서만 질소 고정 반응이 나타난다. 게다가 질소고정효소 활성은 효소 발현량의 조절 및 ADP의 길항 억제에 의해 이루어진다.^[82] 질소고정효소는 생산물인 암모니아의 존재에 의해 발현량이 감소한다. 암모니아 자체는 질소고정효소 반응의 저해 물질이 되지 않는다. ADP의 길항 억제에 관하여, 리보실화된 ADP가 질소고정효소 환원 효소의 강력한 억제제가 된다는 것이 밝혀졌다.^[82] ADP의 리보실화는 질소고정효소 환원 효소 ADP 리보실 전이 효소(DRAT)가 관여하고 있으며, 이 효소는 암조건(광인산화가 일어나지 않는 조건)이나 암모늄염의 첨가에 의해 유도된다. 리보실화 ADP에 의해 억제된 질소고정효소 환원 효소는 질소고정효소 환원 효소 활성화 글리코히드로라제(DRAG)에 의해 부활되어 재활성화된다. DRAT 및 DRAG는 모두 정제되어 성상 분석이 이루어지고 있다.^[83]

8. 산소 내성 기작

질소고정효소는 산소의 산화적 특성으로 인해 이산소에 의해 비가역적으로 억제되며, 이는 Fe-S 보조 인자를 분해적으로 산화시킨다.^[39] 따라서 질소 고정 박테리아는 질소고정효소를 ''생체 내''에서 산소로부터 보호하기 위한 메커니즘이 필요하다. 이러한 문제에도 불구하고, 많은 종들은 호흡을 위한 최종 전자 수용체로 산소를 사용한다.

Azotobacteraceae와 같은 일부 질소 고정 박테리아가 호기성 조건에서 산소에 불안정한 질소고정효소를 사용할 수 있는 능력은 높은 대사율에 기인하며, 이는 세포막에서 산소 환원을 가능하게 한다. 하지만 이러한 메커니즘의 효율성은 70μM 이상의 산소 농도(주변 농도는 230μM O₂)뿐만 아니라 추가적인 영양분 제한 시에도 의문이 제기되었다.^[40]

근류균은 산소에 높은 친화성을 가진 레그헤모글로빈을 근류 주변에 배치하여 니트로게나아제 계열에서 산소를 제거한다. 레그헤모글로빈에 포획된 산소는 니트로게나아제 계열에 닿지 않고 식물의 뿌리를 통해 흡수되어 체내에서 산화적 인산화에 사용된다.^[53] 콩과 식물의 질소 고정 결절에서 발견되는 분자인 레그헤모글로빈은 헴 보조기를 통해 이산소에 결합할 수 있으며, 질소고정효소의 활성 부위에서 O₂를 완충하는 데 중요한 역할을 하는 동시에 효율적인 호흡을 가능하게 한다.^[41]

시아노박테리아는 광화학계 I과 II를 동시에 가지고 있으며, 산소 발생형 광합성을 수행한다. 따라서, 니트로게나아제 계열과는 매우 상성이 좋지 않다. 그러나 ''Anabaena'' 속과 같은 섬유상 시아노박테리아는 산소를 발생하는 광화학계 II를 세포에서 제거한 헤테로시스트 (이질 세포)에서 니트로게나아제를 발현하여 질소 고정 반응을 수행한다.^[61] 그러나, 섬유상 형태를 취하지 않는 단세포 시아노박테리아 (''Trichodesmium'' 속 등)에서도 니트로게나아제 계열 및 질소 고정 반응이 확인되었다. 이러한 시아노박테리아는 낮에 광합성을 수행하여 ATP를 축적한 후, 밤에 질소 고정 반응을 수행하는 방법을 사용한다.^[53] 다만, 광합성과 질소 고정을 동시에 수행하는 시아노박테리아도 발견되었으며, 그 기작에 대해서는 아직 수수께끼에 싸여 있다.^[85]

''A. vinelandii''와 같은 호기성 세균은 자체의 높은 산소 호흡 활성을 통해 세포 주변의 산소를 최대한 제거하고, 니트로게나아제의 입체 구조 차이로 산소의 영향을 회피한다.^[53][84]

9. 분포

질소고정효소는 세균, 고세균 등 다양한 원핵생물에 널리 분포하며, 게놈 분석과 미생물 생태학적 접근 방식을 통해서도 그 분포 범위가 확대되고 있다.^[60] 질소 고정 연구가 특히 진전된 미생물군에 관해서는 혐기성 세균, 시아노박테리아, 그리고 근류균이 주로 언급된다. 또한, 그 생활 양식에 따라 공생 질소 고정 생물과 비공생 질소 고정 생물로 분류된다.^[61]

'''비공생 질소 고정 생물'''

'''공생 질소 고정 세균'''

한편 진핵생물에서는 질소 고정 효소계를 포함한 질소 고정계가 발견되지 않았다.^[62]

10. 다른 단백질과의 유사성

질소 고정 효소의 세 소단위체는 프로토클로로필라이드를 엽록소로 전환하는 프로토클로로필라이드 환원효소의 광 비의존성 버전의 세 소단위체와 상당한 서열 유사성을 나타낸다. 이 단백질은 겉씨식물, 조류, 광합성 세균에 존재하지만, 진화 과정에서 속씨식물에서는 소실되었다.^[47]

별도로, 질소 고정 효소의 두 소단위체(NifD와 NifH)는 질소를 고정하지 않는 메탄 생성균 (예: ''Methanocaldococcus jannaschii'')에서 상동체(homologue)를 가진다.^[48] 이 "4군" ''nif'' 유전자의 기능에 대해서는 거의 알려진 바가 없지만,^[49] 많은 메탄 생성균에서 발견된다. ''M. jannaschii''에서 이들은 서로 상호 작용하는 것으로 알려져 있으며, 구성적으로 발현된다.^[48]

11. 질소 고정 효소 활성 측정

많은 효소 활성 측정법과 마찬가지로, 질소고정효소 활성은 기질(N₂)이 생성물(NH₃)로 전환되는 속도를 측정하여 추정할 수 있다. NH₃는 세포 내 다른 반응에도 관여하므로, 첨가된 기질의 회계 또는 "질량 균형"을 제공하기 위해 기질에 ¹⁵N을 표지하는 것이 종종 바람직하다. 보다 흔한 검정법인 아세틸렌 환원 검정법(ARA)은 효소가 아세틸렌 가스를 에틸렌 가스로 환원시키는 능력을 이용하여 질소고정효소의 활성을 추정한다. 이러한 가스는 기체 크로마토그래피를 사용하여 쉽게 정량화할 수 있다.^[50] 이 방법은 처음에는 ''클로스트리디움 파스퇴리아눔(Clostridium pasteurianum)'' 세포 추출물에서 질소고정효소 활성을 측정하기 위해 실험실에서 사용되었지만, 다른 기술을 적용하기 어려운 현장 연구를 포함하여 광범위한 시험 시스템에 적용되었다. 예를 들어, ARA는 벼 뿌리와 관련된 박테리아가 식물에 의해 조절되는 것으로 보이는 질소고정효소 활성의 계절적 및 일주기 리듬을 겪는다는 것을 증명하는 데 성공적으로 사용되었다.^[51]

불행히도, 질소고정효소 검정법에서 얻은 데이터를 실제 환원된 N₂의 몰수로 변환하는 것은(특히 ARA의 경우) 항상 간단하지 않으며, 다양한 이유로 실제 속도를 과소평가하거나 과대평가할 수 있다. 예를 들어, H₂는 질소고정효소에 대해 N₂와 경쟁하지만 아세틸렌과는 경쟁하지 않아(ARA에 의한 질소고정효소의 과대평가로 이어진다). 병이나 챔버 기반 검정법은 미생물 시스템에 담김 또는 취급을 통한 미세 환경 교란의 결과로 부정적인 영향을 미쳐 질소고정효소의 과소평가를 초래할 수 있다. 이러한 약점에도 불구하고, 이러한 검정법은 질소고정효소 활성의 상대적 속도 또는 시간적 패턴을 평가하는 데 매우 유용하다.

아세틸렌 환원 반응은 질소 고정 효소의 간이 측정법으로 유효하며, 생성된 에틸렌을 기체 크로마토그래피로 분석함으로써 질소 고정 효소 활성을 검출할 수 있다.

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