디스크 확산 검사
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1. 개요
디스크 확산 검사는 항생제 감수성 검사 방법 중 하나로, 항생제가 포함된 디스크를 세균이 배양된 배지에 올려두고, 디스크 주변에 형성되는 세균 생장 억제 영역의 크기를 측정하여 세균의 항생제 감수성을 평가한다. 1889년 마르티누스 베이예링크에 의해 처음 사용되었으며, 조지 F. 레디시, 노먼 히틀리, 윌리엄 M.M. 커비 등의 과학자들에 의해 발전되어 커비-바우어 검사로 표준화되었다. 검사 과정은 배지 준비, 세균 접종, 디스크 부착, 배양, 억제대 측정 순으로 이루어지며, 억제대 크기를 통해 최소억제농도(MIC)를 추정한다.
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| 디스크 확산 검사 | |
|---|---|
| 개요 | |
 | |
| 유형 | 미생물학적 분석 |
| 목적 | 실험실에서 항생제 및 기타 항균제를 평가하는 데 사용 |
| 다른 이름 | KB 테스트 디스크 민감도 테스트 디스크 항생제 감수성 테스트 디스크 확산 항생제 감수성 테스트 |
| 세부 사항 | |
| 절차 | 표준화된 수의 박테리아를 포함하는 액체 배양액으로 한천 플레이트 표면 전체를 접종한다. 테스트할 약물로 함침된 페이퍼 디스크를 한천 위에 놓는다. 약물은 한천으로 확산되어 농도 구배를 형성한다. 플레이트를 적절한 온도에서 적절한 시간 동안 배양한다. 약물에 민감한 박테리아는 디스크 주위에 성장하지 않는다. 디스크 주위의 성장 억제 영역(억제대)의 직경을 측정한다. |
| 결과 해석 | 억제대 크기를 표준화된 표와 비교하여 박테리아를 약물에 민감성, 중간 내성 또는 내성으로 분류한다. |
| 적용 | 임상 환경에서 박테리아 감염 치료를 위한 최적의 항생제를 선택하는 데 도움을 준다. 새로운 항균제를 발견하는 데 사용된다. |
| 변형 | |
| 스톡스 방법 | 알려진 민감성을 가진 제어 균주와 함께 임상 균주를 단일 한천 플레이트에서 테스트한다. |
| Etest | 항생제 농도 구배가 있는 플라스틱 스트립을 사용한다. |
| 표준 | |
| 규정 기관 | 유럽 항균 감수성 테스트 위원회(EUCAST) 임상 및 실험실 표준 연구소(CLSI) |
2. 역사
마르티누스 베이예링크는 1889년 세균 성장에 대한 옥신의 영향을 연구하기 위해 한천 확산법을 처음 사용했다. 이후 조지 F. 레디시, 노먼 히틀리, 제임스 G. 빈센트,[12] 앨프리드 W. 바우어, 윌리엄 M.M. 커비, 존 C. 셰리스,[4][5] 한스 마틴 에릭슨 등 여러 과학자와 세계 보건 기구, 임상 및 실험 표준 연구소, 스웨덴 항생제 참조 그룹, 독일 표준 협회, 영국 항균 화학 요법 학회 등의 과학 단체에 의해 수년에 걸쳐 개발, 개선 및 표준화되었다.[12]
2. 1. 커비-바우어 검사 이전
한천 확산법은 1889년 마르티누스 베이예링크가 세균 성장에 대한 옥신의 영향을 연구하기 위해 처음 사용했다.[12] 이후 조지 F. 레디시, 노먼 히틀리, 제임스 G. 빈센트,[12] 앨프리드 W. 바우어, 윌리엄 M.M. 커비, 존 C. 셰리스,[4][5] 한스 마틴 에릭슨, 세계 보건 기구, 임상 및 실험 표준 연구소, 스웨덴 항생제 참조 그룹, 독일 표준 협회, 영국 항균 화학 요법 학회 등 여러 과학자와 과학 단체에 의해 수년에 걸쳐 개발, 개선 및 표준화되었다.[12]2. 1. 1. 베이예링크의 옥신 연구 (1889)
마르티누스 베이예링크는 1889년에 세균 성장에 대한 옥신의 영향을 연구하기 위해 한천 확산을 처음 사용했다.[12]2. 1. 2. 기타 연구자들
한천 확산법은 1889년 마르티누스 베이예링크가 세균 성장에 대한 옥신의 영향을 연구하기 위해 처음 사용하였다. 그러나 이 방법은 조지 F. 레디시, 노먼 히틀리, 제임스 G. 빈센트,[12] 앨프리드 W. 바우어, 윌리엄 M.M. 커비, 존 C. 셰리스,[4][5] 한스 마틴 에릭슨, 세계 보건 기구(WHO), 임상 및 실험 표준 연구소(CLSI), 스웨덴 항생제 참조 그룹, 독일 표준 협회(DIN), 영국 항균 화학 요법 학회(BSAC) 등 여러 과학자와 과학 단체에 의해 수년에 걸쳐 개발, 개선 및 표준화되었다.[12]2. 2. 관련 기관 및 단체
마르티누스 베이예링크, 조지 F. 레디시, 노먼 히틀리, 제임스 G. 빈센트,[12] 앨프리드 W. 바우어, 윌리엄 M.M. 커비, 존 C. 셰리스,[4][5] 한스 마틴 에릭슨, 세계 보건 기구(WHO), 임상 및 실험 표준 연구소(CLSI), 스웨덴 항생제 참조 그룹, 독일 표준 협회(DIN), 영국 항균 화학 요법 학회(BSAC) 등 여러 과학자와 과학 단체에 의해 디스크 확산 검사가 개발, 개선 및 표준화되었다.[12]3. 원리
세균 감염을 치료하기 위해 어떤 항생제를 사용할지 결정하려면, 해당 세균이 특정 항생제에 대해 얼마나 민감하게 반응하는지(감수성) 알아야 한다. CLSI 기준에 따르면 항생제 감수성은 크게 세 단계로 나뉜다.[13]
- 감수성을 가짐 (S, Susceptible)
- 어느 정도 감수성을 가짐 (I, Intermediate)
- 내성을 가짐 (R, Resistant)
표준화된 디스크 확산법을 사용하면 항생제 감수성을 기준에 따라 판별할 수 있다.
| 항생제 | 성분량 | 억제반경(mm) | ||
|---|---|---|---|---|
| R ≤ | I | S ≥ | ||
| 노보바이오신 | 30µg | 17 | — | 22 |
| 반코마이신 | 30µg | 9 | — | 12 |
| 겐타마이신 | 10µg | 12 | — | 15 |
| 시프로플록사신 | 5µg | 15 | — | 21 |
| 클린다마이신 | 2µg | 15 | — | 19 |
순수한 세균 배양액을 생리 식염수에 섞어 탁도를 표준화한 후, 한천 배지에 균일하게 바른다. 항생제나 추출액이 스며든 여과지 디스크를 한천 표면에 놓으면, 디스크 속 물질은 여과지에서 한천으로 퍼져나가며 농도 기울기가 형성된다. 항생제나 추출액이 특정 농도에서 세균에 효과가 있다면, 한천 내 농도가 유효 농도 이상인 곳에서는 세균 군집(콜로니)이 자라지 못해 생장 억제대가 나타난다.
3. 1. 최소억제농도(MIC)와의 관계
항생제가 포함된 디스크를 배지에 올려두면 디스크 주위로 항생제 성분이 농도 기울기를 형성하면서 확산된다. 세균이 항생제 감수성을 가질 경우, 항생제 성분이 특정 농도 이상인 부분에서 세균의 생장이 억제되어 고리 모양의 억제 영역을 관찰할 수 있다. 억제 영역의 지름을 측정하여 세균이 항생제에 어느 정도의 감수성을 가지는지 판별할 수 있다.일반적으로 생장 억제대가 클수록 해당 세균주의 항생제 또는 추출액의 최소억제농도(MIC)는 낮아진다.[2] 항생제 또는 추출액의 분자가 크거나 소수성인 경우에는 예외가 있는데, 이는 이들이 한천을 통해 천천히 확산되기 때문이다.
4. 과정 (표준 방법, 커비-바우어 검사)
세균의 감수성을 정량적으로 측정하고 다른 실험 결과와 비교하기 위해서는 일관된 기준이 필요하다. 정확하고 재현 가능한 실험을 위해 실험실에서는 바우어(Bauer)와 커비(Kirby)가 표준화한 방법을 따라야 한다. 커비-바우어 검사의 과정은 다음과 같다.[16]
- 세균 시료: 액체배지를 0.5 McFarland 기준에 맞추어 희석하는데, 이 농도는 1mL당 약 1억 5000만 개의 세포가 있는 것과 비슷하다.[2]
- 배지: 배지는 100mm 또는 150mm 페트리 접시에 뮐러-힌톤 한천을 4mm 두께로 부어 만든다. 한천의 pH는 7.2~7.4 사이여야 한다.[2]
- 접종 및 배양: 무균 조작을 사용하여 특정 미생물의 배지 세포 배양액을 멸균된 면봉으로 채취한다. 그람 음성 세균의 경우 면봉을 튜브 안쪽에 살짝 눌러주거나 돌려서 과도한 액체를 제거한다. 그런 다음 면봉으로 뮐러 힌튼 배지에 획선도말하여 세균 층을 형성한다. 균일한 성장을 얻기 위해 한천 배지를 면봉으로 한 방향으로 획선하고 120° 회전하여 다시 획선하고, 다시 120° 회전하여 획선한다. 항생제 디스크 분배기를 사용하여 특정 항생제가 포함된 디스크를 배지에 적용한다. 이것은 접종 후 15분 이내에 수행해야 한다. 화염 멸균된 족집게를 사용하여 각 디스크를 한천에 부드럽게 눌러 부착되도록 한다. 그런 다음 배지를 하룻밤 동안, 일반적으로 35°C의 온도에서 배양기에서 배양한다. 항생제 디스크를 적용한 후 15분 이내에 배지를 배양해야 한다.[2]
구체적인 배양 과정은 다음과 같다.
1. 세균이 배양된 액체배지에 멸균한 면봉을 담근 후, 여분의 배지를 튜브의 벽을 눌러 제거한다.
2. 면봉으로 뮐러 힌튼 배지에 획선도말한다. 이때 배지 전체에 균일하게 미생물이 자라도록 한 번에 배지 전체에 도말하고, 90° 회전하여 다시 도말한다. 모든 방향에서 이 과정을 반복한다.
3. 배지가 마르도록 5분 동안 가만히 둔다.
4. 배지에 디스크를 올린다. 각 디스크 사이에 24mm 정도의 간격을 둔다.
5. 배양기에서 37°C에서 18~24시간 동안 배양한다.
6. 억제대의 지름을 mm 단위로 측정한다.
4. 1. 준비
키르비-바우어 검사는 일관되고 정확한 결과를 얻기 위해 모든 과정이 표준화되어 있다. 따라서 실험실에서는 다음 표준을 준수해야 한다.무균 조작을 사용하여 특정 미생물의 배지 세포 배양액을 멸균된 면봉으로 채취한다. 그람 음성 세균의 경우 면봉을 튜브 안쪽에 살짝 눌러 과도한 액체를 제거한다. 뮬러-힌턴 한천 배지에 면봉으로 획선하여 세균 층을 형성하는데, 균일한 성장을 위해 한 방향으로 획선하고 120° 회전하여 다시 획선하는 과정을 반복한다. 항생제 디스크 분배기를 사용하여 특정 항생제가 포함된 디스크를 배지에 놓는다. 이 과정은 접종 후 15분 이내에 수행해야 한다. 화염 멸균된 족집게를 사용하여 각 디스크를 한천에 부드럽게 눌러 부착시킨다. 이후 배지를 35°C의 배양기에서 하룻밤 동안 배양한다. 항생제 디스크를 놓은 후 15분 이내에 배지를 배양해야 한다.[2]
4. 1. 1. 세균 시료
액체배지를 0.5 McFarland 기준에 맞추어 희석하는데, 이 농도는 1mL당 약 1억 5000만 개의 세포가 있는 것과 비슷하다.[2]4. 1. 2. 배지
배지는 100mm 또는 150mm 페트리 접시에 뮐러-힌톤 한천을 4mm 두께로 부어 만든다. 한천의 pH는 7.2~7.4 사이여야 한다.[2]4. 2. 접종 및 배양
무균 조작을 사용하여 특정 미생물의 배지 세포 배양을 멸균된 면봉으로 채취한다. 그람 음성 세균의 경우 면봉을 튜브 안쪽에 살짝 눌러주거나 돌려서 과도한 액체를 제거한다. 그런 다음 면봉으로 뮐러 힌튼 배지에 획선도말하여 세균 층을 형성한다. 균일한 성장을 얻기 위해 한천 배지를 면봉으로 한 방향으로 획선하고 120° 회전하여 다시 획선하고, 다시 120° 회전하여 획선한다. 항생제 디스크 분배기를 사용하여 특정 항생제가 포함된 디스크를 배지에 적용한다. 이것은 접종 후 15분 이내에 수행해야 한다. 화염 멸균된 족집게를 사용하여 각 디스크를 한천에 부드럽게 눌러 부착되도록 한다. 그런 다음 배지를 하룻밤 동안, 일반적으로 35°C의 온도에서 배양기에서 배양한다. 항생제 디스크를 적용한 후 15분 이내에 배지를 배양해야 한다.배양 과정은 다음과 같다.
# 세균이 배양된 액체배지에 멸균한 면봉을 담근 후, 여분의 배지를 튜브의 벽을 눌러 제거한다.
# 면봉으로 뮐러 힌튼 배지에 획선도말한다.
#* 배지 전체에 균일하게 미생물이 자라도록 한번에 배지 전체에 도말하고, 90° 회전하여 다시 도말한다. 모든 방향에서 이 과정을 반복한다.
# 배지가 마르도록 5분동안 가만히 둔다.
# 배지에 디스크를 올린다. 각 디스크 사이에 24mm정도의 간격을 둔다.
# 배양기에서 37°C에서 18~24시간동안 배양한다.
# 억제대의 지름을 mm단위로 측정한다.
4. 3. 결과 판독
CLSI가 설정한 기준에 따르면, 항생제 감수성은 크게 세 단계로 분류된다.[13]# 감수성을 가짐(S, Susceptible)
# 어느 정도 감수성을 가짐(I, Intermediate)
# 내성을 가짐(R, Resistant)
표준화된 디스크 확산법을 이용하면 기준에 따라 항생제 감수성을 판별할 수 있다.
| 항생제 | 성분량 | 억제반경(mm) | ||
|---|---|---|---|---|
| R ≤ | I | S ≥ | ||
| 노보바이오신 | 30µg | 17 | — | 22 |
| 반코마이신 | 30µg | 9 | — | 12 |
| 겐타마이신 | 10µg | 12 | — | 15 |
| 시프로플록사신 | 5µg | 15 | — | 21 |
| 클린다마이신 | 2µg | 15 | — | 19 |
다음 과정을 따른다.
# 세균이 배양된 액체배지에 멸균한 면봉을 담근 후, 여분의 배지를 튜브의 벽을 눌러 제거한다.
# 면봉으로 뮐러 힌튼 배지에 획선도말한다.
#* 배지 전체에 균일하게 미생물이 자라도록 한번에 배지 전체에 도말하고, 90° 회전하여 다시 도말한다. 모든 방향에서 이 과정을 반복한다.
# 배지가 마르도록 5분동안 가만히 둔다.
# 배지에 디스크를 올린다. 각 디스크 사이에 24mm 정도의 간격을 둔다.
# 배양기에서 37°C에서 18~24시간동안 배양한다.
# 억제대의 지름을 mm단위로 측정한다.
5. 기타 방법
디스크 확산법에는 여러 변형이 개발되었다. 여기에는 병원 진단 실험실에서 사용되는 옥스퍼드 페니실린 컵과 Etest 방법[8], 그리고 신약 발굴 및 개발 실험실에서 사용되는 웰 확산법, 실린더 확산법, 생물 자가 크로마토그래피 방법 등이 있다.[6][9]
항생제 농도가 증가하는 디스크를 한천 표면의 세균 배양액 위에 놓고 배양한다. 투명 구역의 가장자리에서 투명 구역 끝까지 구역 크기를 측정한다. 혼합된 감수성 집단에서는 해석이 더 복잡하다. 이들은 디스크 내 항생제 농도의 자연 로그를 기준으로 거리의 선형 차원 또는 제곱으로 표시된다. MIC는 데이터를 통해 선형 회귀 적합의 0 절편에서 결정된다.[10] 절편 자체는 MIC의 로그이다. 회귀선의 기울기는 한천 내 특정 항생제의 확산 계수와 관련이 있다.[11]
참조
[1]
논문
Antimicrobial properties of aerial part of ''Sesbania grandiflora'' (Linn.)
The Pharmaceutical College Barpali, India
2013
[2]
웹사이트
Antimicrobial susceptibility testing: EUCAST disk diffusion method
https://www.eucast.o[...]
EUCAST
2021-03-16
[3]
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1975-10
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2011-08
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2020-04
[9]
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2020-11
[10]
웹사이트
Analysis of bacterial sensitivity to antibiotics by the agar diffusion method
http://www.agardiffu[...]
2021-03-16
[11]
간행물
Principles of assessing bacterial susceptibility to antibiotics using the agar diffusion method.
2008-06
[12]
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History and development of antimicrobial susceptibility testing methodology
2001-07
[13]
저널
http://dx.doi.org/10[...]
[14]
저널
https://academic.oup[...]
[15]
웹인용
http://www.vetlab.co[...]
[16]
저널
https://academic.oup[...]
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