칼슘 이미징
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1. 개요
칼슘 이미징은 형광 지시약이나 유전자 암호화 칼슘 지시자(GECI)를 사용하여 세포 내 칼슘 이온 농도 변화를 시각화하는 기술이다. 화학 지시약은 칼슘과 결합하여 형광 특성이 변하는 저분자 물질이며, GECI는 유전적으로 세포에 도입되어 칼슘과 결합하면 형광을 내는 단백질이다. 칼슘 이미징은 형광 현미경, 공초점 현미경, 2광자 현미경 등을 사용하여 신경 과학, 심장학, 면역학 등 다양한 생명 과학 분야에서 세포의 기능과 생리적 과정을 연구하는 데 활용된다.
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2. 화학적 지시약
화학적 지시약은 칼슘 이온과 킬레이트할 수 있는 작은 분자이다. 이들은 마그네슘 이온과 달리 칼슘 이온에 대해 높은 선택성을 가지는 BAPTA라는 EGTA 유사체를 기반으로 한다. Ca2+ 이온이 형광 지시약 분자에 결합하면 형광의 양자 수율 증가 또는 방출/여기 파장 이동이 일어난다.
최초의 실시간(비디오 속도) Ca2+ 이미징은 1986년에 증폭 비디오 카메라를 사용하여 심장 세포에서 수행되었다.[3] 나중에 레이저 주사 공초점 현미경을 사용한 기술 개발을 통해 Ca2+ 스파크 및 Ca2+ 블립 형태의 세포 내 Ca2+ 신호가 밝혀졌다. 화학적 Ca2+ 형광 지시약의 조합으로부터의 상대적 반응은 미토콘드리아와 같은 세포 내 소기관에서 칼슘 과도 현상을 정량화하는 데 사용되었다.[4]
칼슘 매핑이라고도 하는 칼슘 이미징은 심근 조직 연구에도 사용된다.[5] 칼슘 매핑은 마우스, 쥐, 토끼 종과 같은 전체 고립 심장에 사용되는 보편적인 기술이다.
2. 1. 화학적 지시약의 종류
화학 지시약은 칼슘 이온을 킬레이트할 수 있는 작은 분자이다. 이들 분자는 모두 칼슘(Ca2+) 이온에 대한 높은 선택성을 가진 BAPTA라는 EGTA 유사체를 기반으로 하며, 마그네슘 (Mg2+) 이온과는 반대된다.이 지시약 그룹에는 fura-2, indo-1, fluo-3, fluo-4, Calcium Green-1이 포함된다.
이 염료는 분자를 친유성으로 만들고 세포 내로 쉽게 들어갈 수 있도록 하기 위해 아세톡시메틸 에스터로 가려진 카복실기와 함께 자주 사용된다. 이 형태의 지시약이 세포 내에 들어가면 세포 에스테라제가 카복실기를 방출하고 지시약이 칼슘에 결합할 수 있다. 염료의 유리산 형태(즉, 아세톡시메틸 에스터 변형이 없는 형태)는 또한 염료를 담고 있는 세포 구획에 대한 불확실성을 제거하는 미세전극 또는 미세 피펫을 통해 세포에 직접 주입될 수도 있다(아세톡시메틸 에스터는 또한 소포체 및 미토콘드리아에도 들어갈 수 있다). Ca2+ 이온이 형광 지시약 분자에 결합하면 형광의 양자 수율 증가 또는 방출/여기 파장 이동으로 이어진다. 개별 화학적 Ca2+ 형광 지시약은 다양한 세포 제제에서 세포질 칼슘 측정을 위해 사용된다.[3][4]
2. 2. 화학적 지시약의 활용
화학적 지시약은 칼슘 이온을 킬레이트할 수 있는 작은 분자이다. 이들 분자는 모두 마그네슘 (Mg2+) 이온과 달리 칼슘(Ca2+) 이온에 대해 높은 선택성을 가진 BAPTA라는 EGTA 유사체를 기반으로 한다.이 지시약 그룹에는 fura-2, indo-1, fluo-3, fluo-4, Calcium Green-1이 포함된다.
이 염료는 분자를 친유성으로 만들어 세포 내로 쉽게 들어갈 수 있도록 하기 위해 아세톡시메틸 에스터로 가려진 카복실기와 함께 자주 사용된다. 이러한 형태의 지시약이 세포 내에 들어가면 세포 에스테라제가 카복실기를 방출하고 지시약이 칼슘에 결합할 수 있게 된다. 염료의 유리산 형태(아세톡시메틸 에스터 변형이 없는 형태)는 미세전극 또는 미세 피펫을 통해 세포에 직접 주입될 수도 있다. 이는 염료를 담고 있는 세포 구획에 대한 불확실성을 제거한다. (아세톡시메틸 에스터는 소포체 및 미토콘드리아에도 들어갈 수 있다.) Ca2+ 이온이 형광 지시약 분자에 결합하면 형광의 양자 수율 증가 또는 방출/여기 파장 이동이 일어난다.
개별 화학적 Ca2+ 형광 지시약은 다양한 세포 제제에서 세포질 칼슘 측정을 위해 사용된다. 최초의 실시간(비디오 속도) Ca2+ 이미징은 1986년에 증폭 비디오 카메라를 사용하여 심장 세포에서 수행되었다.[3] 이후 레이저 주사 공초점 현미경을 사용한 기술 개발을 통해 Ca2+ 스파크 및 Ca2+ 블립 형태의 세포 내 Ca2+ 신호가 밝혀졌다. 화학적 Ca2+ 형광 지시약의 조합으로부터의 상대적 반응은 미토콘드리아와 같은 세포 내 소기관에서 칼슘 과도 현상을 정량화하는 데에도 사용되었다.[4]
칼슘 매핑이라고도 하는 칼슘 이미징은 심근 조직에 대한 연구를 수행하는 데에도 사용된다.[5] 칼슘 매핑은 마우스, 쥐, 토끼 종과 같은 전체 고립 심장에 사용되는 보편적인 기술이다.
3. 유전자 암호화 칼슘 지시자 (GECI)
유전자 암호화 칼슘 지시자(GECI)는 세포, 발달 및 생리적 과정의 생체 내 이미징에 유용한 강력한 도구이다.[6][7][8][9] GECI는 유전적으로 세포에 도입되어 칼슘 이온과 결합하면 형광을 발하는 단백질이다. 화학적 지시약과 달리 세포에 장기간 안정적으로 발현될 수 있으며, 특정 세포 유형에 특이적으로 발현시킬 수 있다는 장점이 있다.
GECI는 형질 감염 방법을 통해 개별 세포 또는 세포주에 도입될 수 있다. 또한 모든 세포에서 또는 특정 세포 아형에서 지시자를 발현하는 형질전환 동물을 만들 수도 있다. GECI는 뉴런,[10][11] T 세포,[12] 심근 세포,[13] 및 기타 세포 유형을 연구하는 데 사용된다.
형광 리포터 중에서 칼슘 지시자 시스템은 단일 형광 단백질(FP) 시스템과 쌍을 이루는 형광 단백질 시스템으로 분류할 수 있다. Camgaroo, GCaMP, CatchER 등은 단일 단백질 시스템을 기반으로 한다. 카멜레온과 같은 전형적인 쌍을 이루는 형광 단백질 시스템도 있다.
칼슘 감지에서 점점 더 중요해지고 있는 것은 근적외선(NIR) GECI이다. NIR GECI는 박테리아 피토크롬에서 파생된 빌리베르딘 결합 형광 단백질에 의존한다. GECI의 특별한 종류는 활성 뉴런에서 영구적인 형광 태그를 형성하도록 설계되었다. 이들은 광전환성 단백질인 Eos를 기반으로 한다. CaM과 결합하면 자색광은 칼슘 수준이 상승한 뉴런만 광전환한다.
형광 시스템이 널리 사용되는 반면, 생물 발광 Ca2+ 리포터는 더 높은 신호 대 잡음비를 가질 수 있다는 점에서 잠재력이 있다.[24] 이러한 시스템은 아쿠오린과 루시페린 코엘렌테라진에 의존할 수 있다. Ca2+ 결합은 코엘렌테라진 산화를 촉진하는 형태 변화를 일으킨다.
시각화된 세포에 대한 손상을 최소화하기 위해, 종종 2광자 현미경 검사가 리포터로부터의 형광을 감지하는 데 사용된다.[26]
3. 1. GECI의 종류
GECI(Genetically Encoded Calcium Indicators, 유전자 암호화 칼슘 지시자)는 크게 단일 형광 단백질 기반 지시자와 두 개의 형광 단백질 기반 지시자로 나눌 수 있다.- 단일 형광 단백질 기반 지시자:
- Camgaroo: 칼모듈린(CaM)을 활용하며, 칼슘 결합 시 형광이 증가한다.
- GCaMP: 순환적으로 치환된 GFP를 사용하며, 칼슘 결합에 의해 형태 변화와 크로모포어 조절이 일어나 형광이 증가한다. 나노몰 결합 친화도를 가진다.
- CatchER: 낮은 친화도 지시자로, 칼슘 결합 시 형광이 회복된다.
- 두 개의 형광 단백질 기반 지시자:
- 카멜레온: 두 개의 다른 형광 단백질, CaM, M13 등으로 구성된다. 칼슘 결합에 의해 FRET 현상이 일어나 비율 측정 신호를 생성한다.
다음은 주요 GECI의 종류와 특징을 정리한 표이다.
근적외선(NIR) GECI: 조직 투과성이 높아 심부 조직의 칼슘 신호를 측정하는 데 유용하다. 박테리아 피토크롬에서 파생된 빌리베르딘 결합 형광 단백질을 사용한다.
활성 뉴런에서 영구적인 형광 표지를 형성하는 GECI:
- CaMPARI, SynTagMA: 광전환성 단백질인 Eos를 기반으로 하며, 칼슘 수준이 상승한 뉴런만 광전환한다.
3. 2. GECI의 활용
GECI는 뉴런,[10][11] T 세포,[12] 심근 세포,[13] 등 다양한 세포 유형을 연구하는 데 사용된다.[6][7][8][9] GECI는 유전자 코드로 만들어져 세포에 직접 주입할 필요가 없다. 대신, GECI를 만드는 유전자를 형질 감염 방법을 통해 세포나 세포주에 넣을 수 있다. 또한, 특정 세포에서 GECI를 발현하는 형질전환 동물을 만들 수도 있다.3. 3. GECI의 발전
GECI(유전자 암호화 칼슘 지시자)는 세포 내 칼슘 이온(Ca2+) 농도 변화를 형광으로 나타내는 단백질이다. GECI는 세포 활동을 실시간으로 관찰하는 데 유용하며, 더 밝고, 칼슘 민감도가 높으며, 다양한 파장대의 형광을 발하는 GECI가 지속적으로 개발되고 있다.[6][7][8][9]초기 GECI 중 하나인 Camgaroo는 칼모듈린(CaM)을 이용하며, 노란색 형광 단백질(YFP) 중간에 CaM을 삽입하는 방식으로 만들어졌다. CaM이 Ca2+와 결합하면 형광이 증가한다.[14] 이후 개발된 GCaMP는 CaM과 미오신 경쇄 키나아제의 M13 도메인을 융합하여 Ca2+ 결합 시 형광이 증가하도록 설계되었다.[16]
카멜레온은 두 개의 다른 형광 단백질, CaM, M13 등을 사용하여 Ca2+가 없을 때는 청색 형광을, Ca2+ 결합 시에는 FRET 현상을 통해 적색 형광을 나타낸다.[15] 초기 카멜레온은 Ca2+ 민감도가 높았으나 산성에 약했지만, 이후 돌연변이를 통해 개선되었다.[19]
최근에는 근적외선(NIR) 영역에서 작동하는 GECI가 개발되어, 다른 지시자와 함께 사용하거나 조직 깊은 곳을 관찰하는 데 활용될 수 있다. NIR GECI는 박테리아 피토크롬에서 유래한 빌리베르딘 결합 형광 단백질을 이용한다.[20][21]
활성 뉴런에 영구적인 형광 표지를 남기는 GECI도 개발되었다. 이들은 광전환성 단백질인 Eos를 기반으로 하며, CaM과 결합하여 칼슘 농도가 높은 뉴런만 광변환시킨다.[22]
4. 칼슘 이미징 기술
칼슘 이미징은 일반적으로 형광 현미경을 사용하여 수행된다.[42] 칼슘 지표로 로딩된 세포나 유전자 변형 칼슘 지표(GECI)를 발현하는 세포는 형광 현미경, sCMOS(Scientific CMOS) 카메라[43], CCD 카메라 등으로 관찰할 수 있다. 공초점 현미경과 2광자 여기 현미경은 광학 단층 촬영 기능을 제공하여 두꺼운 샘플에서도 수상 돌기나 시냅스 단추와 같은 미세 영역의 칼슘 신호를 확인할 수 있도록 돕는다. 광장 현미경[44]은 3차원 부피에서 신경 활동을 기능적으로 판독하는 기능을 확장한다.
섬유 광도법[45][46], 미니스코프[47], 2광자 여기 현미경[48][49]과 같은 방법을 통해 자유롭게 행동하거나 머리가 고정된 동물 모델에서 칼슘 이미징을 수행할 수 있다.
4. 1. 현미경 기술
지표 유형에 관계없이, 이미징 절차는 일반적으로 매우 유사하다. 지표로 로딩된 세포, 또는 GECI의 경우 이를 발현하는 세포[42]는 형광 현미경을 사용하여 관찰할 수 있으며, sCMOS(Scientific CMOS)[43] 카메라 또는 CCD 카메라로 캡처할 수 있다. 공초점 현미경과 2광자 여기 현미경은 광학 단층 촬영 기능을 제공하므로 포유류 뇌와 같이 두꺼운 샘플에서도 수상 돌기 또는 시냅스 단추와 같은 미세 영역에서 칼슘 신호를 확인할 수 있다. 이미지는 단일 파장 또는 비율로 표시되는 두 파장의 형광 강도 변화를 측정하여 분석한다(비율 지표). 필요한 경우, 파생된 형광 강도와 비율을 알려진 Ca2+ 수준에 대한 보정된 값에 대해 플롯하여 절대 Ca2+ 농도를 측정할 수 있다. 광장 현미경 방법[44]은 3D 볼륨에서 신경 활동의 기능적 판독 기능을 확장한다.섬유 광도법[45][46], 미니스코프[47] 및 2광자 여기 현미경[48][49]과 같은 방법은 자유롭게 행동하는 동물 모델과 머리가 고정된 동물 모델에서 칼슘 이미징을 제공한다.
4. 2. 이미징 기법
지표 유형과 관계없이, 이미징 절차는 일반적으로 매우 유사하다. 지표로 로딩된 세포, 또는 GECI의 경우 이를 발현하는 세포[42]는 형광 현미경을 사용하여 관찰할 수 있으며, sCMOS(Scientific CMOS)[43] 카메라 또는 CCD 카메라로 캡처할 수 있다. 공초점 현미경과 2광자 여기 현미경은 광학 단층 촬영 기능을 제공하므로 포유류 뇌와 같이 두꺼운 샘플에서도 수상 돌기 또는 시냅스 단추와 같은 미세 영역에서 칼슘 신호를 확인할 수 있다. 이미지는 단일 파장 또는 비율로 표시되는 두 파장의 형광 강도 변화를 측정하여 분석한다(비율 지표). 필요한 경우, 파생된 형광 강도와 비율을 알려진 Ca2+ 수준에 대한 보정된 값에 대해 플롯하여 절대 Ca2+ 농도를 측정할 수 있다. 광장 현미경 방법[44]은 3D 볼륨에서 신경 활동의 기능적 판독 기능을 확장한다.섬유 광도법[45][46], 미니스코프[47] 및 2광자 여기 현미경[48][49]과 같은 방법은 자유롭게 행동하는 동물 모델과 머리가 고정된 동물 모델에서 칼슘 이미징을 제공한다.
5. 칼슘 이미징의 응용
칼슘 이미징은 신경 과학, 심장학, 면역학 등 다양한 생명 과학 분야에서 세포의 기능과 생리적 과정을 연구하는 데 필수적인 기술로 활용되고 있다.
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