공초점 현미경
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1. 개요
공초점 현미경은 1957년 마빈 민스키가 특허를 낸 현미경으로, 형광 현미경의 화질 저하 문제를 해결하기 위해 개발되었다. 레이저 빔을 사용하여 표본의 특정 지점에서 발생하는 형광만을 측정하는 방식으로, 두께가 있는 시료에서 선명한 이미지를 얻고 3차원 이미지를 생성하는 데 사용된다. 공초점 현미경은 다양한 기술 방식을 통해 해상도를 향상시키며, 세포 생물학, 유전학, 미생물학 등 다양한 분야에서 활용된다. 1940년대부터 여러 연구자들의 노력을 통해 발전해 왔으며, 현재는 다양한 상업적 모델이 존재한다.
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| 공초점 현미경 | |
|---|---|
| 기본 정보 | |
 | |
| 정의 | 광학 이미징 기술 |
| 활용 | |
| 용도 | 생물학 및 의학 연구 |
2. 원리
thumb 융합 단백질. 공초점 현미경으로 형광을 관찰할 수 있다.]]
공초점 현미경은 1957년 마빈 민스키가 처음으로 특허를 낸 기술이다.[50] 기존의 형광현미경은 표본 전체를 동시에 활성화시키는 방식이었는데, 관찰하고자 하는 부분 외에서도 형광이 일어나 이미지의 화질이 저해되는 문제가 있었다.
마빈 민스키는 이 문제를 해결하고자 형광빛을 한 점에 쏘고, 동시에 핀홀을 사용하여 그 한 점에서 발생하는 형광만 측정할 수 있게 하였다. 이때 핀홀과 관찰하고자 하는 부위의 초점을 동시에 맞추기 때문에 '공초점'이라는 이름이 붙었다.
이러한 방식으로 화질은 좋아졌지만, 빛의 양을 한 점으로 한정하여 카메라가 측정하는 밝기가 낮아지는 현상이 발생한다. 낮아진 밝기를 보완하기 위해 더 오래 노출시키는 대신 애벌랜치 광다이오드를 사용하는 등의 다른 방법들이 제시되었다.[51]
공초점 레이저 현미경의 작동 원리는 다음과 같다. 레이저 빔이 광원의 개구부에서 발사되어 대물렌즈를 통해 표본에 초점을 맞춘다. 표본에서 발산되는 형광과 레이저 반사광이 혼합된 빛은 대물렌즈에 의해 다시 모아진다. 이 혼합된 빛은 빔 스플리터에 의해 분리되어 레이저 반사광은 통과시키고 형광만 검출 장치로 보낸다. 핀홀을 통과한 형광은 광전자 증배관 또는 애벌런치 포토다이오드가 검출하여 빛 신호를 전기 신호로 변환, 컴퓨터에 기록한다.
검출 장치의 핀홀은 초점이 맞춰진 위치에서 발산되는 형광 이외의 빛이 내부로 들어가는 것을 방지한다. 그 결과 두께가 있는 시료에서 기존의 현미경보다 선명한 이미지를 얻을 수 있으며(광학적 절편), 두께가 없는 시료에서도 이론상 약간 분해능이 향상된 이미지를 얻을 수 있다.
레이저는 시료를 주사하여 최종 이미지를 얻는다. 각 픽셀의 밝기는 일반적으로 얻어진 형광의 세기에 거의 비례한다. 빔 주사는 서보 제어 미러로 수행되며, 반응 지연이 작다. 주사 속도를 늦추면 노이즈가 적고 고해상도 이미지를 얻을 수 있다. 현미경 스테이지를 상하로 움직여 여러 초점면에서 정보를 수집, 여러 초점면의 2차원 이미지를 중첩함으로써 컴퓨터는 표본의 3차원 이미지를 생성할 수 있다.
2. 1. 광학적 절편 (Optical Sectioning)
공초점 현미경의 광학적 절편(Optical Sectioning) 능력은 기존 형광현미경의 한계를 극복하기 위해 고안되었다. 일반적인 형광 현미경은 표본 전체를 빛으로 균일하게 채우기 때문에, 초점이 맞지 않는 부분에서도 형광이 발생하여 이미지의 질이 저하된다.[3]반면, 공초점 현미경은 점 조명(point illumination)과 검출기 앞 핀홀을 사용하여 초점이 맞지 않는 신호를 제거한다.[4] 초점면에 매우 가까운 형광에 의해 생성된 빛만 감지될 수 있으므로, 이미지의 광학 해상도, 특히 표본 깊이 방향의 해상도가 광시야 현미경보다 훨씬 뛰어나다. "공초점"이라는 이름은 초점면과 핀홀의 초점을 동시에 맞추기 때문에 붙여졌다.[50]
하지만, 표본 형광에서 나오는 빛의 대부분이 핀홀에서 차단되므로 신호 강도가 감소한다. 이를 보완하기 위해 긴 노출이 필요할 수 있다.[4] 빛의 강도는 광전자 증배관(PMT) 또는 애벌런치 포토다이오드와 같은 민감한 검출기로 측정하여 빛 신호를 전기 신호로 변환한다.[51][4]
표본에서 한 번에 한 점만 조명되므로, 2D 또는 3D 이미징에는 표본에서 정규 래스터(평행 스캔 라인의 직사각형 패턴)를 스캔해야 한다. 빔은 하나 이상의 (서보 제어) 진동 거울을 사용하여 수평면에서 표본을 가로질러 스캔한다. 느린 스캔은 더 나은 신호 대 잡음비를 제공하여 더 나은 대비를 얻을 수 있다.[1]
달성 가능한 초점면의 두께는 주로 사용된 빛의 파장을 대물 렌즈의 개구수로 나눈 값에 의해 정의되지만, 표본의 광학적 특성에 의해서도 정의된다. 얇은 광학 단층 촬영은 표본의 3D 이미징 및 표면 프로파일링에 특히 적합하다.
공초점 현미경은 최소한의 표본 준비와 약간의 측면 해상도 개선과 함께, 손상되지 않은 두꺼운 살아있는 표본의 직접적이고 비침습적인 연속 광학 단층 촬영 능력을 제공한다.[4]
3. 기술 방식
공초점 현미경은 1957년 마빈 민스키가 처음으로 특허를 냈다.[50] 기존의 형광현미경은 표본 전체를 동시에 활성화시키는 방식이었는데, 관찰하고자 하는 부분 외에서도 형광이 일어나 모든 형광이 겹쳐져 이미지의 화질이 저해되는 문제가 있었다.
마빈 민스키는 이 문제를 해결하기 위해 형광빛을 한 점에 쏘며 동시에 핀홀로 그 한 점에서 발생하는 형광만 측정할 수 있게 하였다. 이때 핀홀과 관찰하고자 하는 부위의 초점을 동시에 맞추기 때문에 '공초점'이라는 이름이 붙었다.
이로써 화질은 좋아졌지만, 빛의 양을 한 점으로 한정하여 카메라가 측정하는 밝기가 낮아지는 현상이 발생한다. 낮아진 밝기를 보완하기 위해 더 오래 노출시킴으로써 시간 분해능이 낮아지는 문제를 막기 위해 애벌랜치 광다이오드를 사용하는 등 다른 방법들이 제시되었다.[51]
공초점 레이저 현미경에서는 레이저 빔이 광원의 개구부에서 발사되어 대물렌즈로 표본에 초점을 맞추고, 그 표본에서 발산되는 형광을 얻는다. 형광과 레이저 반사광이 혼합된 빛은 빔 스플리터에 의해 분리되어 레이저 반사광은 통과시키고 형광만 검출 장치로 보낸다. 핀홀을 통과한 형광은 광 검출 장치(광전자 증배관 또는 애벌런치 포토다이오드)가 검출하여 빛 신호를 전기 신호로 변환하여 컴퓨터에 기록한다.
검출 장치의 핀홀은 초점이 맞춰진 위치에서 발산되는 형광 이외의 빛이 들어가는 것을 방지한다. 그 결과 두께가 있는 시료에서 기존 현미경보다 선명한 이미지를 얻을 수 있으며(광학적 슬라이스 상), 두께가 없는 시료에서도 이론상 약간 분해능이 향상된 이미지를 얻을 수 있다.
레이저는 시료를 주사하여 최종 이미지를 얻는다. 각 픽셀의 밝기는 일반적으로 얻어진 형광의 세기에 거의 비례한다. 빔 주사는 서보 제어 미러로 수행되며, 반응 지연이 작다. 주사 속도를 늦추면 노이즈가 적고 고해상도 이미지를 얻을 수 있다. 현미경 스테이지를 상하로 움직여 여러 초점면에서 정보를 수집할 수 있으며, 여러 초점면의 2차원 이미지를 중첩하여 표본의 3차원 이미지를 생성할 수 있다.
3. 1. 수평 스캔 기술
상업적으로 판매되는 공초점 현미경에는 다음과 같은 네 가지 유형이 있다.- '''공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)''': 여러 개의 거울을 사용하여 레이저를 표본 위로 주사하고 고정된 핀홀과 검출기 위로 이미지를 "재주사"한다. 이 과정은 일반적으로 느리지만, 고정된 표본의 고해상도 이미지를 만드는 데 유용하다.
- '''스피닝 디스크'''(니프코 디스크) 공초점 현미경: 디스크의 일련의 움직이는 핀홀을 사용하여 빛의 점을 주사한다. 여러 핀홀이 영역을 병렬로 주사하기 때문에 각 핀홀은 특정 영역 위에 더 오랜 시간 동안 머무를 수 있으며, 이는 레이저 주사 현미경에 비해 표본을 조명하는 데 필요한 여기 에너지를 줄여준다. 여기 에너지가 감소하면 표본의 광독성 및 광퇴색이 감소하므로 살아있는 세포나 유기체를 이미징하기 위한 선호되는 시스템인 경우가 많다.
- '''마이크로렌즈 강화''' 또는 '''듀얼 스피닝 디스크''' 공초점 현미경: 스피닝 디스크 핀홀을 포함하는 스피닝 디스크 앞에 마이크로렌즈를 포함하는 두 번째 스피닝 디스크를 배치한다는 점을 제외하면 스피닝 디스크 공초점 현미경과 동일한 원리로 작동한다. 각 핀홀에는 관련 마이크로렌즈가 있어 광대역 빛을 포착하여 각 핀홀에 집중시켜 빛의 양을 크게 증가시키고 스피닝 디스크에 의해 차단되는 빛의 양을 줄인다. 따라서 마이크로렌즈 강화 공초점 현미경은 표준 스피닝 디스크 시스템보다 훨씬 더 민감하다. 요코가와 전기는 1992년에 이 기술을 발명했다.[5]
- '''프로그래밍 가능한 어레이 현미경(PAM)''': 전자적으로 제어되는 공간 광 변조기(SLM)를 사용하여 일련의 움직이는 핀홀을 생성한다. SLM은 개별 픽셀의 불투명도, 반사율 또는 광학 회전과 같은 속성을 전자적으로 조정할 수 있는 픽셀 배열을 포함하는 장치이다. SLM에는 미세 전자기계 거울 또는 액정 구성 요소가 포함되어 있다. 이미지는 일반적으로 전하 결합 소자(CCD) 카메라로 획득한다.
이러한 각 공초점 현미경은 특정 장점과 단점을 가지고 있다. 대부분의 시스템은 기록 속도(비디오 캡처) 또는 높은 공간 해상도에 최적화되어 있다. 공초점 레이저 주사 현미경은 프로그래밍 가능한 샘플링 밀도와 매우 높은 해상도를 가질 수 있는 반면, 니프코 및 PAM은 카메라의 해상도에 의해 정의된 고정된 샘플링 밀도를 사용한다. 프레임 속도 이미징은 일반적으로 스피닝 디스크 또는 PAM 시스템보다 단일 지점 레이저 주사 시스템에서 더 느리다. 상업용 스피닝 디스크 공초점 현미경은 초당 50개 이상의 프레임 속도를 달성하는데,[6] 이는 살아있는 세포 이미징과 같은 동적 관찰에 바람직한 기능이다.
니프코 및 PAM은 핀홀이 충분히 멀리 떨어져 있는 한 여러 핀홀이 동일한 영역을 병렬로 주사할 수 있도록 한다.[7]
공초점 레이저 주사 현미경의 최첨단 개발을 통해 이제 여러 미세 전자기계 주사 거울을 사용하여 표준 비디오 속도(초당 60프레임)보다 나은 이미징이 가능하다.
공초점 X선 형광 이미징은 수평 및 수직 조준 외에도 깊이를 제어할 수 있는 새로운 기술로, 예를 들어 그림의 매몰된 층을 분석할 때 사용된다.[8]
공초점 레이저 현미경에서는 레이저 빔이 광원의 개구부에서 발사되어 대물렌즈로 표본에 초점을 맞추고, 그 표본에서 발산되는 형광을 얻는다. 형광과 레이저 반사광이 혼합된 빛이 대물렌즈에 의해 다시 모인다. 이 혼합된 빛은 빔 스플리터에 의해 분리되어 레이저 반사광은 통과시키고 형광만 검출 장치로 보낸다. 핀홀을 통과한 형광은 광 검출 장치 (광전자 증배관 또는 애벌런치 포토다이오드)가 검출하여 빛 신호를 전기 신호로 변환하여 컴퓨터에 기록한다.
검출 장치의 핀홀은 초점이 맞춰진 위치에서 발산되는 형광 이외의 빛이 내부로 들어가는 것을 방지한다. 그 결과 두께가 있는 시료에서 기존의 현미경보다 선명한 이미지를 얻을 수 있으며(광학적 슬라이스 상), 두께가 없는 시료에서도 이론상 약간 분해능이 향상된 이미지를 얻을 수 있다.
레이저는 시료를 주사하여 최종적으로 전체 이미지를 얻는다. 각 픽셀의 밝기는 일반적으로 얻어진 형광의 세기에 거의 비례한다. 빔 주사는 서보 제어 미러로 수행된다. 이 주사 방식은 반응 지연이 작다. 주사 속도를 늦추면 노이즈가 적고 고해상도 이미지를 얻을 수 있다. 현미경 스테이지를 상하로 움직여 여러 초점면에서 정보를 수집할 수 있다. 여러 초점면의 2차원 이미지를 중첩함으로써 컴퓨터는 표본의 3차원 이미지를 생성할 수 있다.
3. 2. 해상도 향상
공초점 영상 기술의 원리는 1957년 마빈 민스키가 특허를 냈으며,[2] 기존 형광 현미경의 몇 가지 제한 사항을 극복하는 것을 목표로 했다.[3] 일반적인(광시야) 형광 현미경에서는 표본 전체가 빛으로 균일하게 채워진다. 표본의 모든 부분이 동시에 여기(excitation)될 수 있으며, 그 결과 발생하는 형광은 초점이 맞지 않는 넓은 배경을 포함하여 현미경의 광 검출기나 카메라에 의해 감지된다.이와 대조적으로, 공초점 현미경은 점 조명(point illumination)과 검출기 앞에 광학적으로 켤레 평면(conjugate plane)에 있는 핀홀을 사용하여 초점이 맞지 않는 신호를 제거한다. "공초점"이라는 이름은 이러한 구성에서 유래되었다. 초점면에 매우 가까운 형광에 의해 생성된 빛만 감지될 수 있으므로, 이미지의 광학 해상도, 특히 표본 깊이 방향의 해상도는 광시야 현미경보다 훨씬 뛰어나다. 그러나 표본 형광에서 나오는 빛의 대부분이 핀홀에서 차단되므로, 이러한 해상도 증가는 신호 강도 감소라는 대가를 치른다. 따라서 종종 긴 노출이 필요하다. ''핀홀'' 이후의 신호 감소를 상쇄하기 위해, 빛의 강도는 광전자 증배관 (PMT) 또는 애벌런치 포토다이오드와 같은 민감한 검출기에 의해 감지되어 빛 신호를 전기 신호로 변환한다.[4]
표본에서 한 번에 한 점만 조명되므로, 2D 또는 3D 이미징에는 표본에서 정규 래스터(즉, 평행 스캔 라인의 직사각형 패턴)를 스캔해야 한다. 빔은 하나 이상의 (서보 제어) 진동 거울을 사용하여 수평면에서 표본을 가로질러 스캔한다. 이 스캔 방식은 일반적으로 낮은 반응 지연 시간을 가지며 스캔 속도를 변경할 수 있다. 느린 스캔은 더 나은 신호 대 잡음비를 제공하여 더 나은 대비를 얻을 수 있다.
달성 가능한 초점면의 두께는 주로 사용된 빛의 파장을 대물 렌즈의 개구수로 나눈 값에 의해 정의되지만, 표본의 광학적 특성에 의해서도 정의된다. 얇은 광학 단층 촬영은 이러한 유형의 현미경을 표본의 3D 이미징 및 표면 프로파일링에 특히 적합하게 만든다.
공초점 현미경은 광시야 현미경에 비해 최소한의 표본 준비와 약간의 측면 해상도 개선과 함께, 손상되지 않은 두꺼운 살아있는 표본의 직접적이고 비침습적인 연속 광학 단층 촬영 능력을 제공한다.[4]
CLSM(공초점 레이저 스캐닝 현미경)은 스캐닝 이미징 기술로, 얻을 수 있는 해상도는 주사 전자 현미경(SEM)과 같은 다른 스캐닝 기술과 비교하여 가장 잘 설명된다. CLSM은 원자력 현미경(AFM) 또는 주사 터널링 현미경(STM)과 같이 탐침을 표면에서 나노미터 단위로 띄워둘 필요가 없다는 장점이 있다. 대물 렌즈에서 표면까지의 거리(이를 ''작동 거리''라고 함)는 일반적으로 기존의 광학 현미경과 유사하다. 이는 시스템의 광학 설계에 따라 다르지만, 수백 마이크로미터에서 수 밀리미터까지의 작동 거리가 일반적이다.
CLSM에서는 시료가 점 레이저 광원에 의해 조명되며, 각 부피 요소는 개별적인 산란 또는 형광 강도와 관련된다. 여기서 스캐닝 부피의 크기는 광학 시스템의 점 크기(회절 한계에 근접)에 의해 결정되는데, 이는 스캐닝 레이저의 이미지가 무한히 작은 점이 아니라 3차원 회절 패턴이기 때문이다. 이 회절 패턴의 크기와 그에 의해 정의되는 초점 부피는 시스템의 대물 렌즈의 수치 구경과 사용된 레이저의 파장에 의해 제어된다. 이는 광시야 조명을 사용하는 기존 광학 현미경의 고전적인 해상도 한계로 볼 수 있다.
그러나 공초점 현미경을 사용하면 회절 패턴의 고차 모드를 제거하기 위해 공초점 조리개를 닫을 수 있기 때문에 광시야 조명 기술의 해상도 한계를 개선하는 것도 가능하다. 예를 들어 핀홀 직경을 1 에어리 단위로 설정하면 회절 패턴의 1차 모드만 조리개를 통과하여 검출기에 도달하고 고차 모드는 차단되어 밝기가 약간 감소하는 대신 해상도가 향상된다. 형광 관찰에서 공초점 현미경의 해상도 한계는 일반적으로 형광 현미경에서 사용 가능한 광자 수가 적기 때문에 발생하는 신호 대 잡음비에 의해 제한된다. 보다 민감한 광 검출기를 사용하거나 조명 레이저 점 광원의 강도를 높여 이러한 효과를 보상할 수 있다. 조명 레이저의 강도를 높이면 시료의 과도한 표백 또는 기타 손상 위험이 있다.
신호의 간섭 특성을 통해 핀홀 직경을 0.2 에어리 단위까지 줄일 수 있으므로 공초점 형광 현미경에서와 같이 신호 대 잡음비를 희생하지 않고 이상적인 √2의 해상도 향상을 가능하게 한다.[10]
핀홀의 점 퍼짐 함수는 타원체이며, 너비보다 길이가 몇 배 더 길다. 이는 현미경의 축 방향 해상도를 제한한다. 이를 극복하는 한 가지 기술은 4Pi 현미경이다. 또 다른 기술은 '''공초점 세타 현미경'''으로, 조명광과 감지광의 원뿔이 서로 각도를 이룬다. 두 점 퍼짐 함수의 교차점은 훨씬 작은 유효 표본 부피를 제공한다. 여기에서 단일 평면 조명 현미경이 발전했다. 또한 실험적으로 유도된 점 퍼짐 함수를 사용하여 초점이 맞지 않는 빛을 제거하여 축 방향 및 측면 평면 모두에서 대비를 개선하는 디컨볼루션을 사용할 수 있다.
자극 방출 감소 현미경 (STED)과 같은 회절 한계 이하의 해상도를 달성하는 변형 기술도 있다.
4. 응용 분야
공초점 현미경은 세포 생물학, 유전학에서부터 미생물학, 발생 생물학에 이르기까지 다양한 생명 과학 분야에서 널리 사용된다.[11] 또한 양자 광학 및 나노 결정 영상 및 분광학에도 사용된다.
임상적으로, CLSM은 다양한 안과 질환의 평가에 사용되며, 특히 각막의 내피 세포의 이미징, 질적 분석 및 정량화에 유용하다.[12] 진균증의 경우, 각막 기질에서 필라멘트 형태의 진균 성분의 위치를 파악하고 식별하여 신속한 진단과 함께 조기에 확정적인 치료를 시작할 수 있게 한다. 내시경 절차(내시경 현미경)에 대한 CLSM 기술 연구 역시 유망한 결과를 보이고 있다.[13] 제약 산업에서는 얇은 필름 제형의 제조 공정을 따라 약물 분포의 품질과 균일성을 관리하는 것이 권장된다.[14] 공초점 현미경은 미생물의 선호 서식지인 복잡한 다공성 구조인 생물막을 연구하는 데에도 사용된다. 생물막의 시간적 및 공간적 기능의 일부는 미세 및 중간 규모의 구조를 연구해야만 이해할 수 있다. 미세 규모 연구는 단일 미생물의 활동과 조직을 감지하는 데 필요하다.[15]
공초점 현미경(CLSM)은 일부 3차원 광학 데이터 저장 시스템에서 데이터 검색 메커니즘으로 사용되며, 막달렌 파피루스의 연대 측정에 기여했다.
아이린 시스템은 손상된 역사적 오디오의 광학적 스캔 및 복구를 위해 공초점 현미경을 사용한다.[16]
5. 역사
형광현미경은 표본 전체를 동시에 활성화시키는 방식이었는데, 관찰하고자 하는 부분 외에서도 형광이 일어나 모든 형광이 겹쳐져 이미지의 화질이 저해되는 문제가 있었다. 이 문제를 해결하고자 1957년 마빈 민스키는 형광빛을 한 점에 쏘며 동시에 핀홀로 그 한 점에서 발생하는 형광만 측정할 수 있게끔 하여 공초점 현미경의 특허를 냈다.[50] 이때 핀홀과 관찰하고자 하는 부위의 초점을 동시에 맞추기 때문에 '공초점'이라는 이름이 붙었다.
이로서 화질은 좋아졌지만 빛의 양을 한 점으로 한정하기 때문에 카메라가 측정하는 밝기가 낮아지는 현상이 발생한다. 낮아진 밝기를 보완하기 위해 더 오래 노출시킴으로써 시간분해능이 낮아지는 문제를 막기 위해 애벌랜치 광다이오드를 사용하는 등 다른 방법들이 제시되었다.[51]
1940년 스위스 베른의 안과의사 한스 골드만은 눈 검사를 기록하기 위한 세극등 시스템을 개발했는데,[19] 일부 후대 저자들은 이 시스템을 최초의 공초점 광학 시스템으로 간주한다.[20][21] 1943년 즈윤 코아나는 공초점 시스템을 발표했고,[22][20] 1951년 코아나의 동료인 히로토 나오라는 분광 광도법을 위한 공초점 현미경을 사이언스지에 발표했다.[23]
최초의 공초점 ''주사'' 현미경은 1955년 마빈 민스키에 의해 제작되었고, 1957년 특허가 출원되었다. 초점면에 있는 조명점의 주사는 스테이지를 움직여서 구현되었다. 다만, 학술 논문은 제출되지 않았고, 이 현미경으로 촬영된 이미지는 보존되지 않았다.[2][24]
1960년대에 체코슬로바키아 프라하 카렐 대학교 의과대학의 모이미르 페트란은 최초의 상업화된 공초점 현미경인 Tandem-Scanning-Microscope를 개발했다. 이 현미경은 체코슬로바키아의 작은 회사와 미국에서는 Tracor-Northern(후에 Noran)에서 판매되었으며, 회전하는 Nipkow disk를 사용하여 여러 개의 여기 및 방출 핀홀을 생성했다.[21][25]
1966년 페트란과 그의 체코슬로바키아 동료인 밀란 하드라브스키는 체코슬로바키아 특허를 출원했다. 이 현미경으로 생성된 데이터와 이미지가 포함된 첫 번째 과학 출판물은 1967년 저널 Science에 게재되었으며, 예일 대학교의 M. 데이비드 에거와 페트란이 공동 저술했다.[26] 이 논문의 각주에는 페트란이 현미경을 설계하고 제작을 감독했으며 예일에서 "연구 협력자"의 역할을 했다고 언급되어 있다. 1968년의 두 번째 출판물은 이 기기의 이론과 기술적 세부 사항을 설명했으며 하드라브스키와 예일 그룹의 책임자인 로버트 갈람보스가 공동 저자로 참여했다.[27] 1970년에는 미국 특허가 승인되었다. 이는 1967년에 출원되었다.[28]
1969년과 1971년에 예일 대학교의 M. 데이비드 에거와 폴 다비도비츠는 최초의 공초점 ''레이저'' 주사 현미경에 대해 설명하는 두 편의 논문을 발표했다.[29][30] 이 현미경은 점 주사 방식으로, 단 하나의 조명 지점만 생성했다. 신경 조직 관찰을 위해 상부 조명-반사 현미경법을 사용했다. 633nm 파장의 5mW 헬륨-네온 레이저 광선이 반투명 거울에 반사되어 대물렌즈로 향했다. 대물렌즈는 초점 거리 8.5mm의 단순한 렌즈였다. 이전의 모든 시스템과 이후 대부분의 시스템과 달리, 이 렌즈(대물렌즈 주사)의 움직임으로 시료를 주사하여 초점의 이동을 유도했다. 반사된 빛은 반투명 거울로 되돌아왔고, 투과된 부분은 또 다른 렌즈에 의해 광전자 증배관이 위치한 검출 핀홀에 초점을 맞췄다. 신호는 오실로스코프의 CRT에 의해 시각화되었으며, 음극선은 대물렌즈와 동시에 움직였다. 특수 장치를 사용하여 폴라로이드 사진을 찍을 수 있었고, 1971년 출판물에 세 장의 사진이 실렸다.
저자들은 ''생체 내'' 조사를 위한 형광 염료에 대해 추측했다. 그들은 민스키의 특허를 인용하고, 당시 뉴욕시 알버트 아인슈타인 의과대학에서 공초점 선 주사 현미경을 개발한 스티브 베어에게 '민스키의 현미경'에 레이저를 사용할 것을 제안해 준 것에 대해, 그리고 그들의 현미경 개발로 이어진 논의에 대해 갈람보스, 하드라브스키, 페트란에게 감사를 표했다.[31] 그들의 개발 동기는 탠덤 주사 현미경에서는 조명광의 10−7 부분만이 접안렌즈에서 이미지를 생성하는 데 참여한다는 것이었다. 따라서 대부분의 생물학적 조사에 이미지 품질이 충분하지 않았다.[20][32]
1977년, 영국 옥스퍼드의 콜린 J. R. 셰퍼드와 아마르조티 차우두리는 공초점 및 레이저 주사 현미경에 대한 이론적 분석을 발표했는데,[33] 이는 "공초점 현미경"이라는 용어를 사용한 최초의 출판물일 가능성이 높다.[20][32]
1978년, 크리스토프 크레머와 토마스 크레머 형제는 전자식 자동 초점 기능을 갖춘 형광 여기를 사용하는 공초점 레이저 주사 현미경 설계를 발표했다. 그들은 또한 "4π점-홀로그램"을 사용하여 레이저 점 조명을 제안했다.[32][34] 이 CLSM 설계는 레이저 주사 방식과 형광 표지로 표지된 생물학적 물체의 3D 감지를 처음으로 결합했다.
1978년과 1980년, 콜린 셰퍼드와 토니 윌슨을 중심으로 한 옥스퍼드 그룹은 에피-레이저 조명, 스테이지 스캔 및 광전자 증배관을 검출기로 사용하는 공초점 현미경을 설명했다. 스테이지는 광축(z축)을 따라 이동할 수 있어 광학적 연속 절편을 가능하게 했다.[32]
1979년 프레드 브라켄호프와 동료들은 광학 절편 및 해상도 개선의 이론적 장점이 실제로 실현 가능하다는 것을 증명했다. 1985년, 이 그룹은 기술적 한계로 인해 그 당시까지 미스터리로 남아있던 생물학적 질문에 답할 수 있는 공초점 현미경으로 촬영한 설득력 있는 이미지를 처음으로 발표했다.[35] 그 직후, 많은 그룹들이 공초점 현미경을 사용하여 과학적 질문에 답하기 시작했다.
1983년 옥스퍼드의 I. J. 콕스와 C. 셰퍼드는 공초점 현미경을 컴퓨터로 제어하는 최초의 연구를 발표했다. 최초의 상업용 레이저 주사 현미경인 스테이지 스캐너 SOM-25는 1982년부터 옥스퍼드 광전자(BioRad에 인수된 후)에서 출시되었는데, 이는 옥스퍼드 그룹의 설계를 기반으로 했다.[21][36]
1980년대 중반, 윌리엄 브래드쇼 아모스와 존 그래험 화이트 및 동료들은 케임브리지에 있는 분자생물학 연구소에서 최초의 공초점 빔 스캐닝 현미경을 제작했다.[37][38] 샘플이 있는 스테이지는 움직이지 않았고, 대신 조명 지점이 움직여 초당 4개의 이미지를 512개 라인으로 더 빠르게 이미지를 획득할 수 있었다. 1~2미터 길이의 빔 경로로 인해 중간 이미지가 매우 확대되어, 직경이 약 1mm인 일반적인 홍채 조리개를 '핀홀'로 사용할 수 있었다. 디지털 카메라가 추가되기 전에는 필름에 장기간 노출하여 최초의 현미경 사진을 찍었다. 이후 개선을 통해 처음으로 시료를 확대할 수 있었다. 자이스(Zeiss), 라이츠(Leitz) 및 케임브리지 인스트루먼츠(Cambridge Instruments)는 상업적 생산에 관심이 없었다.[39] 영국 의학 연구 위원회(MRC)는 마침내 프로토타입 개발을 후원했다. 이 설계는 바이오래드(Bio-Rad)가 인수하여 컴퓨터 제어를 통해 수정되었고 'MRC 500'으로 상업화되었다. 후속 모델인 MRC 600은 이후 1990년 코넬 대학교에서 개발된 최초의 2광자 여기 현미경의 개발 기반이 되었다.[35]
스톡홀름의 KTH 왕립 기술 연구소에서 비슷한 시기에 개발된 기술은 스웨덴 회사 사라스토(Sarastro)에 의해 유통되는 상업용 CLSM으로 이어졌다.[40] 이 회사는 1990년에 Molecular Dynamics에 인수되었지만, 결국 CLSM은 단종되었다. 독일에서는 1984년에 설립된 하이델베르그 인스트루먼츠(Heidelberg Instruments)가 생물학보다는 산업용으로 개발된 CLSM을 개발했다. 이 기기는 1990년에 라이카 레이저테크닉에 인수되었다. 자이스는 이미 비공초점 플라잉 스폿 레이저 스캐닝 현미경을 시장에 출시했고, 이를 공초점으로 업그레이드했다. 1990년 보고서[42]에는 공초점 현미경 제조업체로 사라스토, 테크니컬 인스트루먼트, 메리디안 인스트루먼츠, 바이오래드, 라이카, 트레이서-노던, 자이스가 언급되었다.[35]
1989년, 프리츠 칼 프라이크샤트는 아들 에크하르트 프라이크샤트와 함께 입자 크기 분석을 위한 스캐닝 레이저 다이오드 현미경을 발명했고,[43][44] 이를 상업화하기 위해 Lasentec을 공동 설립했다. 2001년, Lasentec은 메틀러 톨레도에 인수되었다.[45] 이들은 주로 제약 산업에서 대규모 정제 시스템의 결정화 과정을 현장에서 제어하는 데 사용된다.
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