서던 블롯
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1. 개요
서던 블롯은 DNA를 분석하는 분자생물학 기술로, 1973년 에드윈 서던에 의해 개발되었다. 이 기술은 제한 효소로 DNA를 절단하고, 전기영동으로 크기별로 분리한 후, 막에 옮겨 특정 DNA 서열을 탐침으로 확인하는 과정을 거친다. 서던 블롯은 유전체 연구, 질병 진단, 법의학 등 다양한 분야에서 활용되며, 유전자 변이, 메틸화 부위, 특정 유전자 존재 여부 등을 분석하는 데 사용된다. 하지만 복잡하고 시간이 오래 걸리며, 고품질의 DNA가 필요하다는 한계를 지닌다.
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| 서던 블롯 | |
|---|---|
| 개요 | |
 | |
| 유형 | 분자생물학 기술 |
| 개발자 | 에드윈 멜러 서던 |
| 개발 연도 | 1975년 |
| 원리 및 방법 | |
| 목적 | 특정 DNA 서열 검출 |
| 과정 | DNA 절단: 제한 효소를 사용하여 DNA를 절단한다. 겔 전기영동: DNA 조각들을 크기별로 분리한다. 블로팅: DNA를 겔에서 막으로 옮긴다. 혼성화: 표지된 DNA 프로브를 사용하여 특정 서열을 검출한다. 검출: 프로브에 결합된 DNA 서열을 확인한다. |
| 응용 | |
| 용도 | 유전자 지도 작성 유전자 복제 및 변형 식별 질병 진단 범죄 수사 |
| 관련 기술 | |
| 노던 블롯 | RNA 분석 |
| 웨스턴 블롯 | 단백질 분석 |
| 이스턴 블롯 | 지질 분석 |
2. 역사
서던 블롯은 1970년대 분자생물학의 발전에 힘입어 탄생했다. 이 기술은 존스 홉킨스 대학교의 톰 켈리, 해밀턴 O. 스미스, 대니얼 나단스, 프레데릭 생어 등의 과학자들이 개발한 여러 기술을 바탕으로 한다.
2. 1. 개발 배경
서던 블롯은 세 가지 혁신적인 기술을 결합하여 발명되었다.- 첫 번째는 존스 홉킨스 대학교의 톰 켈리와 해밀턴 O. 스미스가 개발한 제한 효소이다. 이 제한 효소는 DNA를 특정 서열에서 절단하는 데 사용된다. 케네스 머레이와 노린 머레이는 이 기술을 서던에게 소개했다.
- 두 번째 혁신은 1971년 존스 홉킨스 대학교의 대니얼 나단스와 캐슬린 다나가 개발한 젤 전기영동으로, DNA, RNA 또는 단백질 혼합물을 분자 크기에 따라 분리하는 기술이다.
- 세 번째 혁신은 프레데릭 생어가 RNA 분자를 DEAE 종이로 옮길 때 개발한 블로팅 방식을 이용한 방법이다.
서던 블롯은 1973년에 발명되었지만 1975년에야 출판되었다. 비록 늦게 출판되었지만, 서던이 콜드 스프링 하버 연구소의 과학자 마이클 매튜스에게 종이에 이 기술을 그려서 소개했을 때 이 기술이 널리 알려지게 되었다.
2. 2. 서던 블롯의 탄생
에드윈 서던은 1973년 서던 블롯 기술을 고안했고, 1975년에 발표했다. 이 기술은 콜드 스프링 하버 연구소의 과학자 마이클 매튜스에게 소개되면서 널리 알려지게 되었다.3. 방법
서던 블롯은 DNA를 분석하는 실험 방법으로, 다음과 같은 여러 단계를 거쳐 수행된다.
1. 젤 전기 영동: DNA를 크기별로 분리한다. 젤 전기 영동은 시료 용액을 젤 위에서 흘려보내 전하를 가진 용질을 크기, 모양, 전하 밀도에 따라 분리하는 방법이다. DNA는 모양과 전하 밀도가 일정하므로 길이에 따라 분리할 수 있다.
2. 변성 및 막으로 이동: 분리된 DNA를 나일론 등의 막에 옮긴다. 젤을 강염기 용액에 담가 DNA를 단일 가닥으로 변성시킨다. 막은 단일 가닥 DNA에 대한 흡착성이 강한 것을 사용하며, 모세관 현상을 이용하여 DNA를 막으로 이동시킨다.
3. 고정: DNA를 막에 고정하기 위해 UV를 쬐거나 끓인다.
4. 하이브리드 형성: 확인하고자 하는 염기 서열과 상보적인 단일 가닥 DNA에 표지를 한 탐침(프로브)을 이용하여 막에 고정된 DNA와 결합시킨다. 표지로는 인의 방사성 동위원소나 디기톡신(DIG), 알칼리 포스파타아제 부가 등이 사용된다.
5. 검출: 탐침이 표적 DNA와 결합하면 이중 나선 DNA가 형성되는데, 이를 오토라디오그래피 등으로 확인하여 염기 서열을 동정한다.
이러한 과정을 통해 시료에 수많은 DNA가 섞여 있어도 특정 서열의 유무를 정확하게 판별할 수 있다.[11]
3. 1. DNA 분리 및 소화
연구를 위해 DNA는 모발, 정액, 타액 등 다양한 조직에서 분리할 수 있다. 이 중 혈액 조직이 DNA를 얻기에 가장 적합하다고 알려져 있다.[8] 제한 엔도뉴클레아제를 사용하면 고분자량 DNA 가닥을 더 작은 조각으로 자를 수 있다. 이 과정은 사용되는 프로브와 DNA의 복잡성에 따라 달라질 수 있으며, 원하는 양의 DNA를 제한 효소, 효소 완충액, 정제수와 함께 섞어 37°C에서 하룻밤 동안 배양하는 방식으로 진행된다.[8]3. 2. 젤 전기영동
제한 핵산 중간 분해 효소는 고분자 DNA 가닥을 더 작은 단편으로 절단하는 데 사용된다. 이어서 DNA 단편을 아가로스 젤 상에서 전기영동하여 크기별로 분리한다.[8] DNA 조각들 중 일부가 15kb보다 크면, 블로팅 전에 젤을 희석된 염산과 같은 산으로 처리할 수 있다. 이는 DNA 단편을 탈퓨린화하여 DNA를 더 작은 조각으로 분해함으로써 젤에서 막으로 보다 효율적으로 전달할 수 있게 한다.[8]3. 3. 변성
DNA 젤을 알칼리성 용액(주로 수산화 나트륨 포함)에 넣어 이중 가닥 DNA를 단일 가닥으로 변성시킨다.[8] 알칼리성 환경에서의 변성은 DNA의 음전하를 띤 티민 잔기가 막의 양전하를 띤 아미노 그룹에 결합하는 것을 개선하고, 나중에 탐침과의 핵산 혼성화를 용이하게 하며, DNA에 남아 있을 수 있는 잔류 RNA를 파괴한다.[7] 중성 전이 방법보다 알칼리성 전이 방법을 선택하는 것은 종종 경험적이며 동등한 결과를 초래할 수 있다.막은 이중 나선보다 단일 가닥 DNA에 대한 흡착성이 강한 것을 선택한다. 젤은 다공성 구조를 하고 있기 때문에 강염기 용액에 담긴 젤의 DNA에 모세관 현상이 작용한다. 따라서 DNA는 변성되어 단일 가닥으로 막으로 이동한다.[11]
3. 4. 블로팅
나이트로셀룰로스 또는 나일론 막을 젤 위에 놓고, 모세관 현상, 진공 또는 전기영동 등의 방법을 사용하여 DNA 단편을 젤에서 막으로 이동시킨다. DNA 단편을 막으로 이동시키는 방법은 다음과 같다:[7]| 방법 | 설명 |
|---|---|
| 상향 모세관 이동 | DNA 단편을 젤에서 막으로 상향 이동시키며, 액체 또는 완충액의 흐름은 상향이다. |
| 하향 모세관 이동 | 젤을 막(일반적으로 나일론 전하 막) 표면에 놓고 DNA 단편은 알칼리 완충액의 흐름과 함께 하향 방향으로 이동한다. |
| 두 막으로의 동시 이동 | 높은 농도의 DNA 단편을 젤에서 두 개의 막으로 동시에 이동시키는 데 사용된다. |
| 전기영동 이동 | 대량의 전류를 사용하므로 사용된 완충액의 온도 때문에 DNA를 효율적으로 이동시키기 어렵다. 따라서 이러한 기계에는 냉각 장치가 장착되거나 추운 지역에서 사용될 수 있다. |
| 진공 이동 | 상부 챔버에서 완충액을 사용하여 DNA를 젤에서 니트로셀룰로스 또는 나일론 막으로 이동시키며, 젤은 막 위에 직접 놓고 막은 진공 챔버의 다공성 스크린에 놓인다. |
모세관 현상에 의한 완충액 이동은 높은 수분 포텐셜 영역에서 낮은 수분 포텐셜 영역(일반적으로 여과지 및 종이 조직)으로 DNA를 젤에서 막으로 이동시키는 데 사용된다. 이온 교환 상호작용은 DNA의 음전하와 막의 양전하로 인해 DNA를 막에 결합시킨다.[7]
만약 DNA 조각들 중 일부가 15kb보다 크면, 블로팅 전에 젤을 희석된 염산과 같은 산으로 처리할 수 있다. 이는 DNA 단편을 탈퓨린화하여 DNA를 더 작은 조각으로 분해함으로써 젤에서 막으로 보다 효율적으로 전달할 수 있게 한다. 알칼리성 전이 방법을 사용하는 경우, DNA 젤을 알칼리성 용액(일반적으로 수산화 나트륨 함유)에 넣어 이중 가닥 DNA를 변성시킨다. 알칼리성 환경에서의 변성은 DNA의 음으로 하전된 티민 잔기와 양으로 하전된 막의 아미노기에 결합하는 것을 향상시킬 수 있으며, 나중에 이를 탐침에 혼성화하기 위해 단일 DNA 가닥으로 분리하고, 잔류 RNA를 파괴한다.
젤과 막 사이에 균일한 접촉을 보장하기 위해 젤에 균일하게 압력을 가한다(흡입기를 사용하거나 종이 타월과 무거운 물체를 막과 젤 위에 놓음). 흡입기를 이용하는 경우, 20X SSC 버퍼를 사용하여 밀봉하고 젤 건조를 방지한다.
그런 다음 막을 80°C의 진공 또는 일반 오븐에서 2시간 동안 굽는다. 옮긴 DNA를 막에 영구적으로 부착시키기 위해 자외선 (나일론 막)에 노출시킨다.
3. 5. 고정
옮긴 DNA를 막에 영구적으로 부착시키기 위해 80°C에서 2시간 동안 진공 또는 일반 오븐에서 굽거나(표준 조건: 나이트로셀룰로스 또는 나일론 막), 자외선에 노출시킨다(나일론 막).[8]3. 6. 혼성화
막을 혼성화 탐침(표적 DNA에 존재하는 특정 서열을 가진 단일 DNA 단편)에 노출시킨다. 탐침 DNA는 방사능을 통합하거나 분자를 형광 또는 크로모젠성 제자리 혼성화 염료로 표지하여 검출한다.[8] 경우에 따라 혼성화 탐침은 DNA가 아닌 RNA로 만들어진다. 탐침이 샘플 DNA에 특이적으로 결합하도록 하기 위해, 막 표면과 표적 DNA의 블로킹, 탈이온화된 포름아미드, SDS와 같은 세제를 사용하여 프로브의 비특이적 결합을 줄인다.[8] 혼성화 후, 과도한 프로브는 막에서 씻어내고(일반적으로 SSC 완충액 사용), 방사성 또는 형광 프로브의 경우 자동 방사선 촬영법으로 X선 필름에서 혼성화 패턴을 시각화하거나, 크로모젠성 검출 방법이 사용되는 경우 막에서 색상이 나타나도록 한다.[7]확인하고자 하는 염기 서열과 상보적인 단일 가닥에 표지를 한 것을 스폿에 부착시킨다. 표지에는 인의 방사성 동위원소나 디기톡신 (DIG), 알칼리 포스파타아제 부가 등이 사용된다. 스폿에 그 서열을 포함하는 DNA가 있다면 이중 나선 DNA가 발생한다. 따라서 오토라디오그래피 등으로 이중 나선을 확인함으로써 동정할 수 있다.[11]
3. 7. 검출
혼성화 후, 과량의 탐침(프로브)은 SSC 완충액을 사용하여 막에서 씻어낸다.[7] 방사성 또는 형광 탐침을 사용한 경우에는 자동 방사선 촬영법으로 X선 필름에서 혼성화 패턴을 시각화한다.[7] 크로모젠성 검출 방법을 사용한 경우에는 막에서 색상이 나타나는 것을 확인한다.[7]하이브리드 형성을 통해 확인하고자 하는 염기 서열과 상보적인 단일 가닥에 표지를 한 것을 스폿에 부착시킨다. 표지에는 인의 방사성 동위원소나 디기톡신(DIG), 알칼리 포스파타아제 부가 등이 사용된다. 해당 스폿에 특정 서열을 포함하는 DNA가 있다면 이중 나선 DNA가 형성된다. 따라서 오토라디오그래피 등으로 이중 나선을 확인함으로써 염기 서열을 동정할 수 있다.
서던 블롯 방법을 사용하면 시료에 100만 개나 되는 DNA가 있어도 그 중에서 특정 서열의 유무를 쉽게 판정할 수 있는데,[11] 이는 젤 전기 영동의 정밀도가 뛰어나기 때문이다.
4. 결과 해석
필터 막에 있는 특정 DNA 단편에 대한 탐침의 혼성화는 이 단편이 탐침에 상보적인 DNA 염기서열을 포함하고 있음을 의미한다.[11] DNA를 전기영동 젤에서 막으로 옮기는 단계는 크기별로 분획된 DNA에 표지된 혼성화 탐침이 쉽게 결합하도록 하며, 오토라디오그래피 또는 다른 검출 방법으로 분석하는 데 필요한 표적-탐침 혼성체의 고정을 가능하게 한다.
제한 효소로 소화된 유전체 DNA로 수행된 서던 블롯은 유전체 내 염기서열(예: 유전자 복제본)의 수를 결정하는 데 사용될 수 있다. 제한 효소에 의해 절단되지 않은 단일 DNA 세그먼트에만 혼성화되는 탐침은 서던 블롯에서 단일 밴드를 생성하는 반면, 탐침이 여러 개의 매우 유사한 염기서열(예: 염기서열 중복의 결과일 수 있음)에 혼성화될 때 여러 개의 밴드가 관찰될 가능성이 높다.
서던 블롯 방법을 사용하면 시료에 100만 개나 되는 DNA가 있어도 그 중에서 특정 서열의 유무를 쉽게 판정할 수 있다.[11] 이는 젤 전기 영동의 정밀도가 뛰어나기 때문이다. 젤 전기 영동에서는 수백 개의 뉴클레오티드로 이루어진 핵산에서 뉴클레오티드 수가 단 하나만 달라도 이를 구별할 수 있다.
서던 블롯 방법은 어떤 유전자가 변이된 것으로 생각될 때, 그것이 사실인지 확인하는데 사용될 수 있다. 만약 그 유전자에 변이가 일어나면 그 부위가 절단되지 않으므로 그 부위를 포함하는 단편은 길어진다. 이 때문에 젤 전기 영동에서 생기는 그 단편의 스폿 위치가 변화한다.
이처럼 검출되는 변이에는 질병의 원인이 되는 경우나 질병의 원인이 되는 변이와 밀접하게 관련된 경우도 있다. 예를 들어, 겸형 적혈구 빈혈증, 낭포성 섬유증, 헌팅턴병 등의 유전병은 서던 블롯 방법을 이용한 제한 단편 길이 다형성 분석에 의해 진단할 수 있다.[11]
5. 응용
서던 블롯은 유전체 연구, 질병 진단, 법의학 등 다양한 분야에서 활용된다. 유전체 연구에서는 특정 유전자의 존재, 구조 변화, 메틸화 상태 분석, 제한 효소 지도 작성, 단일 염기 다형성(SNP) 확인 등에 사용된다.[8] 질병 진단에는 겸형 적혈구 빈혈증, 낭성 섬유증, 헌팅턴병과 같은 유전 질환 진단에 활용될 수 있다.[11] 법의학 분야에서는 지문 감식을 통한 개인 식별에 사용된다.[10]
5. 1. 유전체 연구
서던 블롯 트랜스퍼는 표적 유전자의 단백질 생성물의 아미노산 서열을 기반으로 상동성 클로닝을 하는 데 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 표적 서열과 유사하도록 설계된다. 올리고뉴클레오타이드는 화학적으로 합성되고, 방사성 표지되며, DNA 라이브러리 또는 클론된 DNA 단편의 다른 콜렉션을 스크리닝하는데 사용된다. 혼성화 탐침과 혼성화하는 서열은 표적화된 유전자의 서열을 얻기 위해 추가로 분석된다.[13]이 기술을 사용하여 정상적인 염색체 또는 유전자 재배열을 연구할 수 있다.[8] 또한, 유전자에서 발생하는 변화를 식별하는 데 유용하며,[8] 특정 제한 효소를 변경하는 단일 염기 다형성(SNP)으로 인해 어떤 인식 부위가 변경되었는지 확인하는 데 사용된다.[8]
5. 2. 질병 진단
서던 블롯은 유전 질환 진단에 사용될 수 있다. 예를 들어, 겸형 적혈구 빈혈증, 낭성 섬유증, 헌팅턴병과 같은 유전병은 서던 블롯 방법을 이용한 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 분석을 통해 진단할 수 있다.[11]또한, 서던 블롯을 사용하여 특정 유전자에서 메틸화된 부위를 식별할 수 있다.[13] 특히 ''MspI''와 ''HpaII''라는 제한 효소는 동일한 서열을 인식하고 절단하지만, ''HpaII''는 해당 부위 내의 C (시토신)가 메틸화되어야 절단하는 반면, ''MspI''는 메틸화되지 않은 DNA만 절단한다.[9] 따라서 특정 탐침으로 분석된 서열 내의 메틸화된 부위는 ''MspI''에 의해 절단되지만, ''HpaII''에 의해서는 절단되지 않는다.[9]
5. 3. 법의학
서던 블롯은 지문 감식을 통해 개인을 식별하는 데 사용할 수 있다.[10]6. 한계
서던 블롯은 여러 단계를 거치는 복잡한 기술이며, 고가의 장비와 시약이 필요하다.[10] 또한 고품질의 다량의 DNA가 필요하며,[10] 시간이 오래 걸리는 방법이다.[10] 반정량적인 방법이기 때문에 DNA의 크기만 추정할 수 있고,[10] 염기쌍 수준의 돌연변이를 검출하는 데는 사용할 수 없다.[10]
참조
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Western Blotting: Electrophoretic Transfer of Proteins from Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels to Unmodified Nitrocellulose and Radiographic Detection with Antibody and Radioiodinated Protein A
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Edwin Southern, DNA blotting, and microarray technology: A case study of the shifting role of patents in academic molecular biology
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Southern Blot- Definition, Principle, Steps, Results, Applications
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서적
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