형광현미경

3. 광원

형광 현미경에는 강력하고 거의 단색에 가까운 조명이 필요하며, 제논 아크 램프, 수은 증기 램프, 레이저, 슈퍼컨티늄 광원, 고출력 LED 등이 사용된다.^[4] 레이저는 공초점 현미경 및 전반사 형광 현미경(TIRF)과 같은 복잡한 형광 현미경 기술에 주로 사용되는 반면, 제논 램프, 수은 램프 및 이색성 거울 여기 필터가 장착된 LED는 광시야 집광 형광 현미경에 일반적으로 사용된다.^[4] 광시야 집광 형광 현미경의 조명 경로에 두 개의 마이크로렌즈 어레이를 배치하면^[5] 변동 계수가 1~2%인 매우 균일한 조명을 얻을 수 있다.

4. 시료 준비

형광 현미경을 사용하려면 샘플이 형광성을 띠어야 한다. 형광 샘플을 만드는 방법에는 크게 세 가지가 있다. 첫째, 형광 염료로 샘플을 표지하는 방법, 둘째, 생물학적 샘플의 경우 형광 단백질을 발현시키는 방법, 셋째, 샘플 고유의 형광, 즉 자가형광을 이용하는 방법이다.^[1]

일반적인 광학 현미경은 텅스텐 램프나 할로겐 램프 등을 광원으로 사용하지만, 형광 현미경은 초고압 수은등, 제논 램프, 자외선 LED, 레이저 광 등을 사용하여 형광 물질을 여기시킨다. 여기에는 근자외선, 청색광, 녹색광 등이 사용되며, 초고압 수은등이 주로 사용된다. 하지만 초고압 수은등은 전용 고압 전원 장치와 정기적인 수은 전구 교체가 필요하므로, 최근에는 자외선 LED를 사용한 제품도 개발되고 있다. 자외선을 사용할 때는 인체에 해로울 수 있으므로 자외선 차단 필터를 설치하는 등 안전에 유의해야 한다.

형광 현미경은 크게 투과형과 낙사형으로 나뉜다. 투과형은 구조가 간단하고 저렴하지만, 여기광 강도를 높이기 어렵고, 위상차 관찰과 결합할 수 없으며, 두꺼운 시료는 접안 렌즈 쪽에서 형광을 발생시키기 어렵다는 단점이 있다. 따라서 현재는 낙사형 형광 현미경이 주로 사용된다.

낙사형 형광 현미경의 원리는 다음과 같다.

• 낙사 조명(동축 조명)으로 여기광을 조사한다. 다이크로익 미러를 사용하여 여기광 파장만을 시료에 조사한다.
• 시료에서 발생한 형광과 산란된 여기광만이 접안부로 향한다.
• 목적 형광 파장만을 투과하는 흡수 필터를 사용하여 형광만을 추출한다.
• 형광을 관찰한다.

4. 1. 생물학적 형광 염색

4. 2. 면역 형광 염색법 (Immunofluorescence)

5. 한계

형광 물질은 광표백이라는 현상 때문에 빛을 받으면 형광 능력을 잃게 된다. 광표백은 형광 분자가 형광 과정에서 여기된 전자로부터 화학적 손상을 축적하면서 발생한다. 이는 형광 현미경으로 샘플을 관찰할 수 있는 시간을 제한한다. 광표백을 줄이기 위해 더 튼튼한 형광 물질을 사용하거나, 조명을 최소화하거나, 광보호 스캐빈저 화학 물질을 사용하는 등의 방법이 있다.

형광 리포터 단백질을 사용한 형광 현미경은 살아있는 세포를 분석할 수 있게 해주지만, 세포는 특히 단파장 빛에 의해 광독성에 취약하다. 또한, 형광 분자는 빛을 받으면 반응성 화학 종을 생성하는 경향이 있어 광독성 효과를 더 크게 만든다.

형광 현미경은 형광 표지된 특정 구조만 관찰할 수 있다는 한계가 있다. 예를 들어, 형광 DNA 염료로 준비된 조직 샘플을 형광 현미경으로 관찰하면 세포 내 DNA 배열만 보이고, 세포 형태에 대한 다른 정보는 전혀 알 수 없다.

6. 초고해상도 기술

빛의 파동 성질은 회절 한계를 일으켜 빛을 집속할 수 있는 점의 크기를 제한한다. 19세기에 에른스트 아베는 이 제한을 설명하며, "광학 현미경의 분해능을 사용된 빛의 파장의 약 절반으로 제한한다"라고 하였다.^[9] 형광 현미경은 특수 광학 구성을 통해 이 한계를 극복하는 다양한 기술의 핵심이다.

1978년, 4Pi 현미경을 사용하여 이 장벽을 깨는 최초의 이론적 아이디어가 개발되었다. 4Pi 현미경은 공초점 레이저 주사 형광 현미경으로, 빛이 이상적으로 모든 면에서 공통 초점으로 집속되어 '점별' 여기와 '점별' 감지를 결합하여 물체를 주사한다.^[9] 1994년에 4Pi 현미경의 첫 번째 실험적 시연이 이루어졌다.^[10] 4Pi 현미경은 두 개의 대물렌즈를 사용하거나 2 광자 여기 현미경을 통해 적색 이동된 빛과 다광자 여기를 사용하여 사용 가능한 집속 방향의 양을 최대화한다.

통합된 상관 현미경은 형광 현미경과 전자 현미경을 결합한다. 이를 통해 전자 현미경으로 초미세 구조와 문맥 정보를 시각화하고, 형광 현미경의 데이터를 라벨링 도구로 사용할 수 있다.^[11]

1994년에 제안된 STED 현미경은 실제로 회절 이하 분해능을 달성한 최초의 기술이었다. 이 방법과 RESOLFT 개념을 따르는 모든 기술은 빛과 형광 분자 사이의 강력한 비선형 상호 작용에 의존한다. 분자는 각 특정 위치에서 구별 가능한 분자 상태 사이에서 강력하게 구동되므로, 빛은 공간의 작은 부분에서만 방출될 수 있어 분해능이 향상된다.

1990년대에는 광시야 현미경을 기반으로 한 또 다른 초고해상도 현미경 방법이 개발되었다. SPDM 국소화 현미경과 구조화된 레이저 조명(공간 변조 조명, SMI)의 개발을 통해 형광 표지자로 염색된 세포 나노구조의 크기 분해능이 실질적으로 개선되었다.^[12] SPDM의 원리와 SMI를 결합하여 Vertico SMI 현미경이 개발되었다.^[13][14] 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 일반적인 형광 간헐성 형광 염료의 단일 분자 검출은 SPDMphymod 기술(SPDM의 추가 개발)을 사용하여 달성할 수 있으며, 이는 두 가지 다른 형광 분자 유형을 분자 수준에서 감지하고 계산할 수 있게 해준다(2색 국소화 현미경 또는 2CLM).^[15]

광활성화 국소화 현미경은 각 시간마다 형광 분자의 비율이 매우 적은 단일 분자의 깜박임 또는 스위칭에 의존하여 유사한 결과를 얻는다. 적용된 빛에 대한 분자의 이러한 확률적 반응은 고도로 비선형적인 상호 작용에 해당하며, 이는 회절 이하 분해능으로 이어진다.

7. 응용

공초점 레이저 현미경은 레이저를 이용해 다단계 스캔 조사를 실시하고, 얻어진 형광을 합성하여 시료의 3차원 구조를 관찰할 수 있게 해준다.

전반사 조명 형광 현미경은 에바네센트장을 이용한 국소적인 여기를 통해 극히 얕은 초점 심도를 얻는다. 이는 단분자 세포 생물학 및 생리학 발전에 기여하며, 경우에 따라서는 한 분자의 형광 분자 거동 관측도 가능하다.

8. 기타

시료에서 발생하는 형광은 일반적으로 여기광에 비해 매우 미약하므로 신호 대 잡음비를 향상시키기 위해 관찰 장소를 암흑 상태로 만드는 등의 작업이 필요하다. 최근에는 냉각 CCD 카메라 등의 관측 장치를 이용하여 장시간 노출을 통해 극히 미약한 형광도 관찰하고, 이미지 처리를 통해 높은 해상도와 콘트라스트를 얻을 수 있게 되었다.^[1]

시료에 따라서는 관찰 대상 부위 이외에서 형광이 발생하여 배경 노이즈가 되어 관찰을 방해하는 경우가 있는데, 이 현상을 "자가 형광"이라고 부른다. 생물 시료에서 특히 문제가 되는 것은 클로로필 ''b'', 콜라겐, 피브릴린, 플라빈, 인돌아민류, NADH, NADPH, 폴리페놀류, 트립토판 등이다. 이 현상을 해결하기 위해, 대상 물질을 화학적으로 제거하거나, 문제가 되는 물질이 형광을 내지 않는 파장에서 여기를 수행하는 등의 방법이 있다.^[1]

또한, 시료에 혼재된 물질 외에도 슬라이드 글라스, 커버 글라스, 유침용 오일, 현미경에 사용되는 렌즈 재료 등이 자가 형광을 일으키는 경우도 있다. 형광이 미약한 시료를 다루는 경우에는 저형광성 유리를 사용한 슬라이드 글라스와 커버 글라스를 사용하는 것이 요구된다.^[1]

참조

_[1] 웹사이트 Introduction to Fluorescence Microscopy http://www.microscop[...] 2024-10-24
_[2] 웹사이트 The Fluorescence Microscope http://nobelprize.or[...] The Nobel Foundation 2008-09-28
_[3] 서적 Fluorescence Microscopy in Life Sciences https://ebooks.benth[...] Bentham Science Publishers 2017-12-17
_[4] 논문 Super resolution fluorescence microscopy 2010-03
_[5] 논문 Flat-top illumination profile in an epi-fluorescence microscope by dual micro lens arrays
_[6] 논문 Quantitative 3D-imaging for cell biology and ecology of environmental microbial eukaryotes 2017
_[7] 논문 Fluorescence Visualization of Cellulose and Pectin in the Primary Plant Cell Wall 2020-05
_[8] 논문 Phase imaging with computational specificity (PICS) for measuring dry mass changes in sub-cellular compartments
_[9] 논문 Considerations on a laser-scanning-microscope with high resolution and depth of field http://www.kip.uni-h[...] 1978
_[10] 논문 Confocal microscopy with an increased detection aperture: type-B 4Pi confocal microscopy 1994
_[11] 뉴스 Correlative microscopy: Opening up worlds of information with fluorescence http://blog.delmic.c[...] 2017-02-16
_[12] 간행물 Optical Biopsies and Microscopic Techniques II 1997
_[13] 논문 High-precision structural analysis of subnuclear complexes in fixed and live cells via spatially modulated illumination (SMI) microscopy 2008
_[14] 논문 Nanostructure analysis using spatially modulated illumination microscopy http://www.kip.uni-h[...] 2003
_[15] 논문 Dual color localization microscopy of cellular nanostructures http://www.kip.uni-h[...] 2009