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뷰렛 반응

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목차

1. 개요

뷰렛 반응은 단백질 또는 펩타이드의 존재를 확인하는 데 사용되는 화학 반응이다. 이 반응은 수용액 시료에 강염기(수산화나트륨 또는 수산화칼륨)와 황산구리(II)를 첨가하여 수행하며, 단백질이 존재하면 용액이 보라색으로 변한다. 뷰렛 반응은 펩타이드 결합이 두 개 이상 존재하는 구조와 2가 구리 이온의 반응을 통해 보라색 착화합물을 형성하는 원리를 이용한다. 뷰렛 시약은 수산화나트륨, 수화된 황산구리(II), 주석산 칼륨 나트륨으로 구성되며, 뷰렛 반응은 단백질 정량법에 활용된다. 뷰렛 반응의 변형으로 비신코닌산 분석법과 로우리 분석법이 있으며, 이들은 뷰렛 반응에서 생성된 Cu⁺를 다른 시약과 반응시켜 색 변화를 증폭시켜 단백질 검출의 민감도를 높인다.

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뷰렛 반응
일반 정보
이름뷰렛 반응
다른 이름Piotrowski의 반응
발견자Ferdinand Rose]] (1833년) 및 구스타프 피오트로프스키 (1857년)
설명펩타이드 결합의 존재를 나타내는 화학적 테스트
감지 대상단백질 및 폴리펩타이드
양성 반응구리 이온과의 착물 형성에 의해 유발되는 용액의 보라색 변색
상세 정보
시약강한 알칼리성 수용액 (수산화 칼륨 또는 수산화 나트륨) 및 황산구리 (II)
사용법단백질 농도 측정
간섭암모늄염
수정BCA 단백질 분석법 및 로리 단백질 정량법

2. 실험 방법

뷰렛 반응 실험 방법은 다음과 같다. 먼저, 수용액 시료에 같은 부피의 1% 강염기(주로 수산화나트륨 또는 수산화칼륨)를 넣는다. 그 후, 수용액 황산구리(II)를 몇 방울 떨어뜨린다. 용액이 보라색으로 변하면 시료에 단백질이 포함되어 있다는 것을 의미한다.[6][16] 이 방법으로 5~160 mg/mL 농도의 단백질까지 정량할 수 있다. 유의미한 색 변화를 관찰하려면 최소 3개 이상의 아미노산으로 구성된 펩타이드가 필요하다.[6][16]

2. 1. 시약 제조

1L들이 부피 플라스크에 CuSO4 1.6g을 넣고 눈금선까지 증류수를 채워 0.01M의 황산구리 수용액을 만든다.

1L들이 부피 플라스크에 NaOH 400g을 넣고 마찬가지로 눈금선까지 증류수를 채워 10M의 수산화나트륨 수용액 1L를 만든다.

반응을 진행하기 전에 수산화나트륨 수용액 1L와 황산구리 수용액 약 25ml를 섞어 뷰렛 시약을 만들어 사용하거나 실험을 두 과정으로 나누어서 진행한다. 더 간단하게는 5% 수산화나트륨 용액과 1% 황산구리 용액을 각각 몇 방울씩 시료에 떨어뜨려 검사하기도 한다. 두 용액을 미리 섞어 두면 반응이 일어나므로 검출 직전에 혼합하여 사용하는 것이 좋다.[17] 시료를 물에 녹이고, 그와 같은 부피의 1% 질량 퍼센트 농도 강염기(대개 NaOH 또는 KOH) 수용액을 준비한다. 강염기 수용액에 수산화구리(II) 수용액을 수 방울 넣고, 시료 수용액과 섞는다.

2. 2. 검출 과정

검사하고자 하는 단백질 시약을 준비한다.[6][16] 5%(10M) 수산화 나트륨 수용액과 1%(0.01M) 황산구리 수용액을 넣는다.[6] 색이 보라색으로 바뀌면 단백질이 검출된 것이다.[6]

수용액 시료에 같은 부피의 1% 강염기(수산화나트륨 또는 수산화칼륨)를 첨가한 후, 수용액 황산구리(II)를 소량 떨어뜨린다. 용액이 보라색으로 변하면 단백질이 포함되어 있는 것이다. 5~160 mg/mL까지 정량할 수 있다. 이러한 시약으로 측정 가능한 유의미한 색 변화를 위해서는 최소 3개 이상의 아미노산으로 구성된 적절한 길이의 펩타이드가 필요하다.[6][16]

시료를 물에 녹이고, 그와 같은 부피의 1% 질량 퍼센트 농도 강염기(대개 NaOH 또는 KOH) 수용액을 준비한다. 강염기 수용액에 수산화구리(II) 수용액을 수 방울 넣고, 시료 수용액과 섞는다. 수용액이 보라색으로 변하면 시료 중에 단백질 또는 폴리펩티드가 존재하는 것이다.[16]

3. 원리

뷰렛 용액에 단백질을 넣으면 단백질의 작용기인 펩티드사슬이 구리 및 나트륨과 결합하여 비스뷰타렛구리(II)산 나트륨(수산화 칼륨의 경우 비스뷰타렛구리(II)산 칼륨)을 생성하면서 색이 보라색으로 변한다. 펩티드결합이 두 개 이상 존재하는 구조를 뷰렛이라 하는데, 이 뷰렛구조가 2가의 구리 이온과 반응하여 보라색의 착화합물을 형성하기 때문이다.

모든 단백질은 기본적으로 무수히 많은 펩티드결합으로 이루어져 있기 때문에 뷰렛반응으로 검출할 수 있다. 단백질 뿐 아니라 단 몇 개의 펩티드결합을 가지고 있는 펩티드도 검출할 수 있다.[17] 뷰렛 시약은 수산화나트륨(NaOH)과 수화된 황산구리(II), 그리고 酒石酸カリウムナトリウム|주석산 칼륨 나트륨일본어[7](세 번째 물질은 킬레이트화하여 구리 이온을 안정화시키기 위해 첨가됨)으로 구성되어 있다. 알칼리성 조건 하에서 펩타이드 결합에 관여하는 질소 원자와 구리 이온의 반응으로 펩타이드의 수소 원자가 치환된다. 펩타이드 질소와의 삼좌 또는 사좌 킬레이트화가 특징적인 색을 생성한다. 이는 이펩타이드에서 발견된다.[8]

시료를 물에 녹이고, 그와 같은 부피의 1% 질량 퍼센트 농도 강염기(NaOH 또는 KOH) 수용액을 준비한다. 강염기 수용액에 수산화구리(II) 수용액을 수 방울 넣고, 시료 수용액과 섞는다. 수용액이 보라색으로 변하면 시료 중에 단백질 또는 폴리펩타이드가 존재하는 것이다. 검출되는 펩티드는 적어도 3개의 아미노산 분자가 축합된 것이다. 검출 가능한 펩티드의 농도는 5mg/mL ~ 160mg/mL이다.[16]

4. 뷰렛 시약

뷰렛 시약은 수산화나트륨(NaOH)과 수화된 황산구리(II), 그리고 타타르산 칼륨 나트륨[7](구리 이온을 킬레이트화하여 안정화하기 위해 첨가됨)으로 구성되어 있다. 알칼리성 조건에서 펩타이드 결합에 관여하는 질소 원자와 구리 이온이 반응하여 펩타이드의 수소 원자가 치환된다. 펩타이드 질소와 삼좌 또는 사좌 킬레이트화가 이루어지면 특징적인 색이 나타나는데, 이는 이펩타이드에서 발견된다.[8]

이 시약은 UV-Vis 분광법을 이용하여 단백질 농도를 결정하는 데 사용되는 색도 분석법인 뷰렛 단백질 정량법에 사용되며, 일반적으로 540 nm 파장에서 측정한다.

시료를 물에 녹이고, 그와 같은 부피의 1% 질량 퍼센트 농도 강염기(대개 NaOH 또는 KOH) 수용액을 준비한다. 강염기 수용액에 수산화구리(II) 수용액을 수 방울 넣고, 시료 수용액과 섞는다. 수용액이 보라색으로 변하면 시료 중에 단백질 또는 폴리펩티드가 존재하는 것이다. 검출되는 펩티드는 적어도 3개의 아미노산 분자가 축합된 것이다. 검출 가능한 펩티드의 농도는 5mg/mL ~ 160mg/mL이다.[16]

5. 뷰렛 반응의 변형

뷰렛 반응의 주요 변형에는 BCA 분석법과 로우리 단백질 분석법이 있으며, 이들은 펩타이드의 비색 분석에 사용된다. 이 검사법들에서는 뷰렛 반응으로 생성된 Cu⁺가 다른 시약과 추가로 반응하여 더 진한 색을 낸다.

5. 1. 비신코닌산 분석법(BCA 분석법)

BCA 분석법에서는 Cu⁺가 비신코닌산(BCA)과 반응하여 약 562nm에서 흡광도를 보이는 진한 자주색 복합체를 형성하는데, 이것이 특징적인 자주색을 만드는 것이다.[9] 물에 녹는 BCA/구리 복합체는 펩타이드/구리 복합체보다 훨씬 강하게 흡수하므로 뷰렛 반응의 민감도가 약 100배 증가한다. BCA 분석법을 사용하면 0.0005~2mg/mL 범위의 단백질을 검출할 수 있다. 또한 BCA 단백질 분석법은 단백질 샘플에 최대 5%의 계면활성제가 포함된 물질과 호환된다는 중요한 장점을 제공한다.

5. 2. 로우리 분석법(Lowry 분석법)

뷰렛 반응의 주요 변형법으로 비신코닌산 분석법(BCA)과 로우리 단백질 분석법이 있다. 이 방법들에서는 뷰렛 반응으로 생성된 Cu⁺가 다른 시약과 추가 반응하여 더 진한 색을 띤다.

로우리 단백질 분석법에서는 Cu⁺가 폴린-시오칼토 시약의 Mo⁶⁺에 의해 다시 Cu²⁺로 산화되고, 몰리브덴 블루(Mo⁴⁺)를 형성한다. 이때 단백질의 티로신 잔기도 몰리브덴 블루를 형성한다. 이 방법으로 0.005~2mg/mL 농도의 단백질을 검출할 수 있다.[10] 몰리브덴 블루는 말라카이트 그린이나 오라민 O와 같은 특정 유기 염료와 결합하여 신호를 더 강하게 만들 수 있다.[11]

참조

[1] 웹사이트 Definition of biuret Dictionary.com https://www.dictiona[...] 2021-03-11
[2] 논문 Über die Verbindungen des Eiweiss mit Metalloxyden https://books.google[...] J.A. Barth
[3] 논문 Eine neue Reaction auf Eiweisskörper und ihre näheren Abkömmlinge https://books.google[...]
[4] 웹사이트 Chemistry of Protein Assay https://www.thermofi[...] Thermo Fisher Scientific Protein Methods Library 2022-05-08
[5] 서적 Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology https://books.google[...] Wiley 2022-05-09
[6] 논문
[7] 웹사이트 Chemical Reagents https://web.archive.[...] 2010-01-30
[8] 논문 The chelation of metal ions by dipeptides and related substances. Part 5.—Cupric complexes of sarcosyl and leucyl ligands http://xlink.rsc.org[...] 2020-08-29
[9] 논문 Measurement of protein using bicinchoninic acid
[10] 논문 Protein Measurement With the Folin Phenol Reagent
[11] 논문 Fiftyfold amplification of the Lowry protein assay
[12] 논문 Über die Verbindungen des Eiweiss mit Metalloxyden
[13] 논문 Eine neue Reaction auf Eiweisskörper und ihre näheren Abkömmlinge
[14] 간행물 第15改正日本薬局方 http://jpdb.nihs.go.[...] 2009-07-04
[15] 웹사이트 Chemistry of Protein Assay http://www.piercenet[...]
[16] 논문
[17] 웹인용 [네이버 지식백과] 뷰렛반응 [biuret reaction] (두산백과) https://terms.naver.[...] 2022-02-02


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