집락형성단위

1. 개요

집락형성단위(CFU, Colony-forming unit)는 특정 조건에서 콜로니를 형성하는 미생물의 수를 추정하는 데 사용되는 단위이다. 이론적으로 하나의 생존 가능한 세포가 콜로니를 형성할 수 있지만, 실제로는 함께 뭉쳐진 세포 덩어리가 콜로니의 조상인 경우가 많다. CFU는 주입 배지법, 도말 배지법, 막 여과법 등 다양한 배양 및 계수 방법을 통해 측정되며, 로그 표기법을 사용하여 농도를 표현하기도 한다. 집락 계수는 수동으로 수행하거나, 소프트웨어 도구 또는 자동화 시스템을 사용하여 수행할 수 있다. 미생물학 외에도 세포 배양 등 다른 분야에서도 사용되며, 최대 가능 수(MPN) 또는 변형 피쉬만 단위(MFU)와 같은 다른 방법으로 대체될 수 있다.

2. 이론

평판 계수법의 목적은 온도, 시간, 영양 배지 등 특정 조건에서 콜로니를 생성하는 능력을 바탕으로 존재하는 세포 수를 추정하는 것이다. 이론적으로 하나의 생존 가능한 세포는 복제를 통해 콜로니를 생성할 수 있다. 그러나 단독 세포는 자연에서 예외적이며, 대부분의 경우 콜로니를 만든 세포는 함께 침전된 세포 덩어리이다. 또한, 많은 세균은 사슬(예: 연쇄상구균) 또는 덩어리(예: 포도상구균) 형태로 성장한다. 이러한 이유로 CFU에 의한 미생물 수 추정은 대부분의 경우 샘플에 존재하는 살아있는 세포의 수를 과소평가한다. 이는 CFU 계수가 모든 콜로니가 개별적이며 단일 생존 가능한 미생물 세포에 의해 만들어졌다고 가정하기 때문이다.

평판 계수법은 표준 크기의 페트리 접시에서 30에서 300 CFU 범위의 대장균에 대해 선형이다. 따라서 샘플이 이 범위의 CFU를 생성하도록 하려면 샘플을 희석하고 여러 희석액을 도말해야 한다. 일반적으로 10배 희석액을 사용하며, 희석 계열은 선택된 희석 범위에서 2개 또는 3개의 복제본으로 도말된다. 종종 100 μL이 도말되지만 최대 1 mL까지 더 많은 양이 사용될 수 있다. 더 높은 도말량은 건조 시간을 증가시키지만 추가 희석 단계가 필요할 수 있으므로 종종 더 높은 정확도를 얻지 못한다. CFU/평판은 선형 범위의 평판에서 읽고, 도말된 양과 희석 인수를 고려하여 원래 샘플의 CFU/g (또는 CFU/mL)을 수학적으로 유추한다.

이 방법의 장점은 서로 다른 미생물 종이 서로 뚜렷하게 다른 콜로니를 생성할 수 있다는 것이다. 현미경적 및 거시적으로 모두 그렇다. 콜로니 형태는 존재하는 미생물 식별에 매우 유용할 수 있다.

2.1. CFU 측정의 한계

평판 계수의 목적은 온도, 시간, 영양 배지 등 특정 조건에서 콜로니를 생성하는 능력을 기반으로 존재하는 세포 수를 추정하는 것이다. 이론적으로 하나의 생존 가능한 세포는 복제를 통해 콜로니를 생성할 수 있다. 그러나 단독 세포는 자연에서 예외적이며, 대부분의 경우 콜로니를 만든 세포는 함께 침전된 세포 덩어리이다. 또한, 많은 세균은 사슬(예: 연쇄상구균) 또는 덩어리(예: 포도상구균) 형태로 성장한다. 이러한 이유로 CFU에 의한 미생물 수 추정은 대부분의 경우 샘플에 존재하는 살아있는 세포의 수를 과소평가한다. 이는 CFU 계수가 모든 콜로니가 개별적이며 단일 생존 가능한 미생물 세포에 의해 만들어졌다고 가정하기 때문이다.

평판 배양법은 배양 조건에 따라 특정 미생물만 선택적으로 성장할 수 있다는 한계도 있다. 예를 들어, 사용되는 배지의 종류, 배양 온도, 시간 등에 따라 특정 미생물은 잘 자라지만, 다른 미생물은 성장하지 못할 수 있다.

유기체의 현미경적 구조에 대해 미리 알고 있다면, 관찰된 CFU/mL가 밀리리터당 생존 가능한 세포 수와 어떻게 관련되는지에 대해 더 잘 이해할 수 있다. 경우에 따라 희석을 수행하기 전에 샘플을 볼텍스 믹서로 혼합하여 CFU당 평균 세포 수를 줄일 수도 있다. 그러나 많은 미생물은 섬세하여 볼텍스에 넣으면 생존 가능한 세포의 비율이 감소할 수 있다.

2.2. 로그 표기법

집락형성단위의 농도는 로그 표기법을 사용하여 표현할 수 있으며, 표시되는 값은 농도의 상용로그이다. 이렇게 하면 제염 공정의 로그 감소를 간단한 뺄셈으로 계산할 수 있다.

3. 측정 방법

집락형성단위는 다음과 같은 여러 미생물 배양 및 계수 방법에서 결과를 정량화하는 데 사용된다.

* 주입 배지법: 시료를 약 40°C~45°C로 냉각된 용융 한천을 사용하여 페트리 접시에 현탁한다(열로 인한 세포 사멸을 최소화하기 위해 응고점 바로 위). 영양 한천이 응고된 후 플레이트를 배양한다.
* 도말 배지법: 시료(소량)를 영양 한천 플레이트 표면에 도말하고 배양하기 전에 건조시킨다.
* 막 여과법: 시료를 막 필터를 통해 여과한 다음 필터를 영양 한천 플레이트 표면에 놓는다. 배양하는 동안 영양분이 필터를 통해 침출되어 성장하는 세포를 지원한다. 대부분의 필터 표면적은 표준 페트리 접시보다 작으므로 플레이트 계수의 선형 범위는 더 작다.
* [[마일스 앤드 미스라 방법]](드롭 플레이트 방법): 일련의 각 희석액에서 매우 작은 분취량(일반적으로 약 10 마이크로리터)의 시료를 페트리 접시에 떨어뜨린다. 집락이 함께 자라면서 집락형성단위(CFU) 손실을 방지하기 위해 집락이 매우 작을 때 드롭 접시를 읽어야 한다.

그러나 한천 플레이트를 사용해야 하는 기술의 경우, 시료의 순도를 확인할 수 없고 액체에서 세포를 하나씩 셀 수 없기 때문에 액체 용액을 사용할 수 없다.

4. 집락 계수 도구

집락 계수 도구에는 전통적인 수동 계수 방식과 자동화된 계수 시스템이 있다.

전통적으로 집락 계수는 펜과 클릭 카운터를 사용하여 수동으로 수행되었다. 이 방법은 간단하지만, 많은 배양판을 계수해야 할 때는 매우 힘들고 시간이 오래 걸린다.

이러한 단점을 극복하기 위해 반자동(소프트웨어) 및 자동(하드웨어+소프트웨어) 솔루션이 개발되었다.

4.1. 수동 계수

집락을 세는 것은 전통적으로 펜과 클릭 카운터를 사용하여 수동으로 수행된다. 이것은 일반적으로 간단한 작업이지만, 세어야 할 플레이트가 많을 때는 매우 힘들고 시간이 많이 걸릴 수 있다.

4.2. 소프트웨어 도구

전통적으로 실험자는 펜과 클릭 카운터를 사용하여 집락 계수를 수동으로 수행해왔으나, 이는 많은 시간이 소요되는 작업이었다. 이를 개선하기 위해 반자동(소프트웨어) 및 자동(하드웨어 + 소프트웨어) 솔루션이 개발되었다.

소프트웨어 도구를 사용하면 배양 접시 사진에서 집락 수를 계산할 수 있다. 실험자는 계수할 배양 접시의 사진을 찍은 후, 소프트웨어를 이용하여 분석한다. 이 방식은 수동 계수에 비해 시간을 절약해주고, 객관적인 데이터(집락 크기, 색상 등)를 얻을 수 있게 해준다.

다음은 집락 계수에 사용되는 주요 소프트웨어 도구들이다.

이 외에도, 데스크톱 컴퓨터 기반 소프트웨어 외에 안드로이드 및 iOS 기기용 앱을 이용하여 반자동 및 자동 집락 계수를 수행할 수 있다. 스마트폰 카메라로 사진을 찍고, 앱 내부 또는 외부 알고리즘을 통해 집락 수를 추정한다.

4.3. 자동화 시스템

자동 집락 계수 시스템은 인적 오류를 줄이고 효율성을 높이기 위해 사용된다. 연구자들이 투과광을 이용하여 세포를 수동으로 계수하는 과정에서 오류가 발생할 가능성이 높기 때문에, 자동화 시스템은 이러한 오류를 줄이는 데 도움을 준다. 특히 세포 수가 적을 때 수동 계수는 농도 계산에 큰 영향을 미칠 수 있다.

일부 생명 공학 제조업체에서는 완전 자동화 시스템을 제공한다. 이러한 시스템은 일반적으로 하드웨어와 소프트웨어가 특정 설정을 위해 함께 작동하도록 설계되어 유연성이 떨어지고 가격이 비싸다.

일부 자동 시스템은 나선 도말 방식을 사용한다. MATLAB과 같은 자동화 시스템은 세포를 염색하지 않고도 계수할 수 있게 하여, 집락을 다른 실험에 재사용할 수 있도록 한다. 그러나 이러한 시스템은 먼지나 흠집이 있는 혈액 한천 배지에서 미생물을 구별하기 어렵다는 단점이 있다. 먼지와 흠집은 다양한 모양과 외관을 가질 수 있기 때문이다.

5. 기타 의미

세포 배양 등 일부 분야에서는 CFU라는 단어가 미생물학 외의 의미로 사용된다. 예를 들어, 조혈모세포 연구 분야에서는 CFU가 세포 수의 지표가 아닌, 줄기세포의 종류를 나타내는 데 사용된다.

6. 같이 보기

* 최대 가능 수
* MFU