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프라이머

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목차

1. 개요

프라이머는 DNA 또는 RNA 합성을 시작하는 데 사용되는 짧은 핵산 서열이다. 생체 내에서는 RNA 프라이머가 DNA 복제 과정에서 DNA 중합효소에 의해 사용되며, 역전사 효소에 의해서도 사용된다. 합성 프라이머는 DNA 염기서열 분석, 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 등 다양한 분자 생물학적 기법에 활용된다. PCR에서는 특정 DNA 단편을 증폭하기 위해 프라이머가 사용되며, 프라이머 설계는 PCR 성공에 중요한 요소이다.

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프라이머
개요
정의DNA 합성의 시작점 역할을 하는 짧은 RNA 또는 DNA 가닥
길이2~5개 염기 또는 5~8개 염기 (진핵생물), 18~22개 염기 (일반적인 DNA 프라이머)
유형RNA 프라이머, DNA 프라이머
기능DNA 중합 효소가 DNA 합성을 시작할 수 있도록 3'-OH 그룹 제공
RNA 프라이머
합성데 노보 합성으로 DNA 주형에 상보적인 짧은 RNA 서열 첨가
효소프리마제
제거DNA 중합 효소 I (박테리아), 플랩 엔도뉴클레아제 또는 RNAseH 효소 (진핵생물 및 고세균)
대체DNA 중합 효소에 의해 DNA로 대체
DNA 프라이머
합성화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 사용
용도중합효소 연쇄 반응(PCR), DNA 시퀀싱, 유전자 클로닝
장점높은 특이성 및 제어 가능성
기타
중요성DNA 복제, PCR, DNA 시퀀싱, 유전자 클로닝 등 다양한 분자 생물학적 과정에 필수적임
주의사항프라이머 설계 시 비특이적 결합을 피하기 위해 신중하게 선택해야 함

2. 프라이머의 정의 및 기본 원리

프라이머는 DNA 중합효소가 새로운 DNA 가닥을 합성하기 위한 시작점을 제공하는 짧은 핵산 서열이다. DNA 또는 RNA 가닥에 상보적으로 결합하여 DNA 복제 또는 RNA로부터 DNA를 합성하는 역전사 과정을 개시한다.[1]

DNA 염기서열은 DNA 가닥의 뉴클레오타이드를 결정하는 데 사용된다. 생어 사슬 종결법과 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에서는 프라이머를 사용하여 반응을 시작하거나 증폭될 DNA 조각을 결정한다. PCR에서 프라이머의 길이는 대개 30개(일반적으로 18~24개) 뉴클레오타이드보다 길지 않다. DNA 조각의 시작과 끝 부분을 증폭시키는데, 이때 중합 효소에 의해 확장된 프라이머는 다른 프라이머의 주형이 되어 표적 조각이 기하급수적으로 증가한다.

프라이머는 DNA 합성에만 사용되는 것은 아니며, 인플루엔자 바이러스 등 일부 바이러스 유래 중합효소는 RNA 합성에 프라이머를 사용하기도 한다.

2. 1. 프라이머의 구성

프라이머는 일반적으로 18~24개(최대 30개)의 뉴클레오타이드로 구성된 짧은 핵산 서열이다. DNA 또는 RNA로 구성될 수 있는데, 자연 상태에서는 RNA 프라이머가 주로 사용되지만, 실험실에서는 DNA 중합효소가 DNA만을 합성할 수 있기 때문에 주로 DNA 프라이머가 사용된다.[1]

DNA 염기서열 분석 방법 중 하나인 생어 사슬 종결법은 연쇄 반응을 시작하기 위해 프라이머를 사용한다. 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에서는 증폭될 DNA 조각을 결정하는 데 프라이머가 사용된다. 프라이머는 증폭할 DNA 조각의 시작과 끝 부분에 결합하여 해당 부분을 복제한다. 이때, 하나의 프라이머가 DNA 중합 효소에 의해 확장되면, 확장된 가닥이 다시 다른 프라이머의 주형이 되면서 기하급수적으로 DNA가 증폭된다.[1]

살아있는 유기체에서 DNA 가닥의 합성을 시작할 때 RNA 프라이머가 사용된다. 프라이메이스라는 효소는 선도 가닥과 지연 가닥 모두에 상보적인 RNA 프라이머를 ''드 노보'' 방식으로 추가한다. DNA 중합효소는 이 프라이머의 3'-OH 말단에서 시작하여 새로운 DNA 가닥을 합성한다. DNA 복제에서 선도 가닥은 복제 분기점을 따라 연속적으로 합성되므로 하나의 RNA 프라이머만 필요하지만, 지연 가닥은 오카자키 절편이라는 짧은 조각으로 합성되므로 여러 개의 RNA 프라이머가 필요하다.[1]

역전사 과정에서도 프라이머가 사용된다. 역전사 효소는 RNA 주형 가닥을 이용하여 상보적인 DNA 가닥을 합성하는데, 이때 DNA 중합 효소는 합성을 시작하기 위해 3' 말단을 가진 프라이머가 필요하다.[1]

합성 프라이머는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드로, 특정 DNA 부위에 어닐링되도록 맞춤 제작할 수 있다. 이러한 합성 프라이머는 DNA 분석과 관련된 다양한 분자 생물학적 방법에 필수적인 도구이다. 생어 사슬 종결법과 차세대 DNA 시퀀싱 모두 반응을 시작하기 위해 프라이머가 필요하다.[1]

표준적인 PCR에서의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 도식화한 것.


한편, 프라이머가 항상 DNA 합성에만 사용되는 것은 아니다. 인플루엔자 바이러스 등 일부 바이러스 유래 중합효소는 RNA 합성에 프라이머를 사용하기도 한다.

2. 2. 프라이머의 작동 원리

프라이머는 살아있는 유기체가 DNA 가닥의 합성을 개시할 때 사용된다. 프라이메이스라고 불리는 효소는 선도가닥과 지연가닥 모두에 대해 ''드 노보'' 방식으로 읽기 템플릿에 상보적인 RNA 프라이머를 첨가한다. 프라이머의 자유로운 3'-OH(프라이머 말단)에서 시작하여 DNA 중합효소는 새로 합성된 가닥을 연장할 수 있다.[1]

DNA 복제에서 선도가닥은 복제분기점과 함께 움직이면서 하나의 연속적인 조각으로 DNA 합성되므로 합성을 시작하기 위해 초기 RNA 프라이머만 필요하다. 지연 가닥에서 템플릿 DNA는 5'→3' 방향으로 실행된다. DNA 중합효소는 템플릿 가닥에 상보적인 3'→5' 방향으로 염기를 추가할 수 없기 때문에 DNA는 오카자키 절편이라고 알려진 복제 분기점에서 멀어지면서 짧은 조각으로 '역방향'으로 합성된다. 선도 가닥과 달리 이 방법은 DNA 합성이 반복적으로 시작되고 중지되어 여러 개의 RNA 프라이머가 필요하다. DNA 템플릿을 따라 프라이메이스는 DNA 중합효소가 5'→3' 방향으로 DNA를 합성하는 데 사용하는 RNA 프라이머를 섞는다.[1]

프라이머가 DNA 합성을 가능하게 하는 또 다른 예는 역전사이다. 역전사 효소는 RNA의 템플릿 가닥을 사용하여 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 효소이다. 역전사 효소의 DNA 중합효소 구성 요소는 합성을 시작하기 위해 기존의 3' 말단이 필요하다.[1]

합성 프라이머는 때때로 올리고스라고도 하며, 일반적으로 DNA로 구성된 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드이며, 주형 DNA의 특정 부위에 어닐링되도록 맞춤화할 수 있다. 용액에서 프라이머는 DNA 중합 효소에 의해 확장되기 전에 염기 쌍을 통해 주형과 자발적으로 왓슨-크릭 염기쌍을 형성한다. 합성 프라이머를 생성하고 맞춤화하는 능력은 DNA 분석과 관련된 다양한 분자 생물학적 접근 방식에 필수적인 매우 귀중한 도구임이 입증되었다. 생어 사슬 종결법과 "차세대" DNA 시퀀싱 방법 모두 반응을 시작하기 위해 프라이머가 필요하다.[1]

3. 생체 내 프라이머 (''in vivo'')

생체 내(in vivo) 프라이머는 살아있는 유기체가 DNA 가닥의 합성을 시작할 때 사용된다. 프라아제는 ''드 노보'' 방식으로 선도 가닥과 지연 가닥 모두에 읽기 템플릿에 상보적인 RNA 프라이머를 첨가한다. DNA 중합효소는 프라이머의 자유로운 3'-OH(프라이머 말단)에서 시작하여 새로 합성된 가닥을 연장할 수 있다.

DNA 이중 나선에서 지연 가닥은 5' 말단에서 3' 방향으로 진행되는 분자 사슬이다. 따라서 이에 상보적인 분자 사슬은 3'→5' 방향으로 합성되어야 한다. DNA 중합효소는 3'→5' 방향으로 합성할 수 없기 때문에, 지연 가닥의 복제는 오카자키 절편이라는 짧은 조각으로 합성된다. DNA 프라이머제는 지연 가닥의 주형을 따라 RNA 프라이머를 일시적으로 구축한다. 그 후, DNA 중합효소는 RNA 프라이머의 유리 3'-OH기에서 5'→3' 방향으로 DNA 합성을 수행한다.

이후, RNA 절편은 원핵생물의 경우 DNA 중합효소 I에 의해, 진핵생물의 경우 DNA 중합효소 δ에 의해 제거되어 RNA가 존재했던 부분의 틈을 메우는 새로운 데옥시리보뉴클레오티드가 도입된다. 그리고 DNA 연결효소가 데옥시리보뉴클레오티드를 결합시켜 지연 가닥의 합성을 완료한다.[1]

3. 1. DNA 복제에서의 역할

프라아제는 DNA 가닥의 합성을 개시할 때 사용되는 RNA 프라이머를 선도 가닥과 지연 가닥 모두에 ''드 노보'' 방식으로 템플릿에 상보적으로 첨가한다.[1] DNA 중합효소는 프라이머의 3'-OH 말단에서 시작하여 새로운 가닥을 연장할 수 있다.

역전사는 프라이머가 DNA 합성을 가능하게 하는 또 다른 예시이다. 역전사 효소는 RNA 템플릿 가닥을 사용하여 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 효소이다. 역전사 효소의 DNA 중합효소 구성 요소는 합성을 시작하기 위해 기존의 3' 말단이 필요하다.[1]

3. 1. 1. 선도 가닥과 지연 가닥

DNA 복제에서 선도 가닥은 복제 분기점과 함께 움직이며 하나의 연속적인 조각으로 DNA 합성되므로 합성을 시작하기 위해 초기 RNA 프라이머만 필요하다. 지연 가닥에서 템플릿 DNA는 5'→3' 방향으로 진행된다. DNA 중합효소는 템플릿 가닥에 상보적인 3'→5' 방향으로 염기를 추가할 수 없기 때문에 DNA는 오카자키 절편이라고 알려진 복제 분기점에서 멀어지면서 짧은 조각으로 '역방향'으로 합성된다.[1] 선도 가닥과 달리 이 방법은 DNA 합성이 반복적으로 시작되고 중지되어 여러 개의 RNA 프라이머가 필요하다. DNA 템플릿을 따라 프라아제는 DNA 중합효소가 5'→3' 방향으로 DNA를 합성하는 데 사용하는 RNA 프라이머를 합성한다.[1]

오카자키 절편이 삽입된 후, RNA 프라이머가 제거되고(제거 메커니즘은 원핵생물과 진핵생물 사이에서 다름) RNA 프라이머가 있던 틈을 채우는 새로운 데옥시리보뉴클레오티드로 대체된다. 그 다음 DNA 연결 효소가 조각난 가닥을 함께 연결하여 지연 가닥의 합성을 완료한다.[1]

원핵생물에서 DNA 중합효소 I은 이전 RNA 프라이머에 도달할 때까지 오카자키 절편을 합성한다. 그런 다음 효소는 동시에 5′→3′ 엑소뉴클레아제 역할을 하여 앞쪽의 프라이머 리보뉴클레오티드를 제거하고 뒤쪽에 데옥시리보뉴클레오티드를 추가한다. 중합 및 RNA 프라이머 절제의 두 가지 활동 모두 5′→3′ 방향으로 발생하며, 중합효소 I은 이러한 활동을 동시에 수행할 수 있다. 이것을 "닉 번역"이라고 한다.[3] 닉 번역은 RNA 프라이머를 제거하고 데옥시리보뉴클레오티드를 추가하는 중합효소 I의 동기화된 활동을 의미한다. 나중에 가닥 사이에 닉이라고 하는 틈이 형성되며, 이는 DNA 연결 효소를 사용하여 봉합된다.

진핵생물에서 지연 가닥의 RNA 프라이머 제거는 복제를 완료하는 데 필수적이다. DNA 중합효소 δ에 의해 합성되는 지연 가닥은 5′→3′ 방향으로 오카자키 절편이 형성되어 DNA의 불연속 가닥이 된다. 그런 다음 DNA 중합효소가 이전 오카자키 절편의 RNA 프라이머의 5' 말단에 도달하면 프라이머의 5' 말단을 단일 가닥 RNA 플랩으로 이동시키고, 이 플랩은 뉴클레아제 절단에 의해 제거된다. RNA 플랩의 절단에는 세 가지 RNA 프라이머 제거 방법이 포함된다.[4]

진핵생물에서 RNA 프라이머를 제거하는 방법은 다음과 같다.

  • 짧은 플랩 경로: 플랩 구조 특이적 엔도뉴클레아제 1 (FEN-1)이 5' 돌출 플랩을 절단하여 짧은 플랩을 제거한다.[5]
  • RNase H2 사용: RNase를 사용하여 RNA 가닥을 분해하며, 진핵생물에서는 RNase H2라고 한다. 이 효소는 프라이머의 5' 말단 근처의 뉴클레오티드를 제외하고 대부분 어닐링된 RNA 프라이머를 분해한다. 나머지 뉴클레오티드는 FEN-1을 사용하여 절단되는 플랩으로 표시된다.
  • 긴 플랩 경로:[5] 여러 효소가 RNA 프라이머를 연장한 다음 절단하도록 모집된다. 플랩은 Pif1로 알려진 5'에서 3' 헬리케이즈에 의해 연장된다. Pif1에 의해 플랩에 뉴클레오티드가 추가된 후, 긴 플랩은 복제 단백질 A (RPA)에 의해 안정화된다. RPA 결합 DNA는 FEN1의 활성 또는 모집을 억제하므로, 플랩을 절단하기 위해 다른 뉴클레아제를 모집해야 한다.[4] 이 뉴클레아제는 DNA2 뉴클레아제로, 헬리케이즈-뉴클레아제 활성을 가지고 있으며, RNA 프라이머의 긴 플랩을 절단하여 FEN1에 의해 절단되는 몇 개의 뉴클레오티드를 남긴다.


모든 RNA 프라이머가 제거되면 오카자키 절편 사이에 닉이 형성되고, 이는 ligase1로 알려진 효소를 사용하여 데옥시리보뉴클레오티드로 채워진다. 이 과정을 연결이라고 한다.

3. 1. 2. 프라이머 제거

DNA 복제가 완료되면 RNA 프라이머는 제거되고 DNA로 대체된다.[1]

원핵생물에서 DNA 중합효소 I은 이전 RNA 프라이머에 도달할 때까지 오카자키 절편을 합성한다. 그런 다음 효소는 동시에 5′→3′ 엑소뉴클레아제 역할을 하여 앞쪽의 프라이머 리보뉴클레오티드를 제거하고 뒤쪽에 데옥시리보뉴클레오티드를 추가한다. 중합 및 RNA 프라이머 절제의 두 가지 활동 모두 5′→3′ 방향으로 발생하며, 중합효소 I은 이러한 활동을 동시에 수행할 수 있는데, 이를 "닉 번역"이라고 한다.[3] 닉 번역은 RNA 프라이머를 제거하고 데옥시리보뉴클레오티드를 추가하는 중합효소 I의 동기화된 활동을 의미한다. 나중에 가닥 사이에 닉이라고 하는 틈이 형성되며, 이는 DNA 연결 효소를 사용하여 봉합된다.

진핵생물에서 지연 가닥의 RNA 프라이머 제거는 복제를 완료하는 데 필수적이다. DNA 중합효소 δ에 의해 합성되는 지연 가닥은 5′→3′ 방향으로 오카자키 절편이 형성되어 DNA의 불연속 가닥이 된다. 그런 다음 DNA 중합효소가 이전 오카자키 절편의 RNA 프라이머의 5' 말단에 도달하면 프라이머의 5' 말단을 단일 가닥 RNA 플랩으로 이동시키고, 이 플랩은 뉴클레아제 절단에 의해 제거된다. RNA 플랩의 절단에는 세 가지 방법이 있다.[4]

  • 짧은 플랩 경로: 플랩 구조 특이적 엔도뉴클레아제 1(FEN-1)이 5' 돌출 플랩을 직접 절단한다.[5]
  • RNase H2를 이용한 분해: RNase를 사용하여 RNA 가닥을 분해하는 방법으로, 진핵생물에서는 RNase H2를 사용한다. 이 효소는 프라이머의 5' 말단 근처의 뉴클레오티드를 제외한 대부분의 어닐링된 RNA 프라이머를 분해한다. 나머지 뉴클레오티드는 FEN-1을 사용하여 절단되는 플랩으로 표시된다.[5]
  • 긴 플랩 경로: 여러 효소가 RNA 프라이머를 연장한 다음 절단한다. Pif1로 알려진 5'에서 3' 헬리케이즈가 플랩을 연장하고, 복제 단백질 A(RPA)가 긴 플랩을 안정화시킨다. RPA 결합 DNA는 FEN1의 활성을 억제하므로, DNA2 뉴클레아제가 긴 플랩을 절단하여 FEN1에 의해 절단되는 몇 개의 뉴클레오티드를 남긴다.[4]


모든 RNA 프라이머가 제거되면 오카자키 절편 사이에 닉이 형성되고, ligase1 효소를 사용하여 데옥시리보뉴클레오티드로 채워진다. 이 과정을 연결이라고 한다.[4]

3. 2. 역전사에서의 역할

역전사 효소는 RNA를 주형으로 사용하여 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 효소이다. 역전사 효소의 DNA 중합효소 구성 요소는 합성을 시작하기 위해 프라이머의 3' 말단이 필요하다.[1]

인간 면역 결핍 바이러스(HIV)는 이 메커니즘을 통해 자신의 RNA 게놈을 역전사하여 RNA-DNA를 거쳐 이중 가닥 DNA로 변환한다. HIV에 의해 암호화된 역전사 효소는 센스 cDNA 가닥으로부터 안티센스 DNA 가닥을 복제하여 이중 가닥 DNA 중간체를 만드는 DNA 의존성 DNA 중합효소 활성을 갖는다. 또한, cDNA 합성 중에 바이러스 유래 RNA를 자체적으로 분해하는 리보뉴클레아제 활성도 가지고 있다.[12]

4. 합성 프라이머의 이용

합성 프라이머는 올리고스라고도 하며, DNA로 구성된 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드이다. 주형 DNA의 특정 부위에 어닐링되도록 맞춤화할 수 있다. 용액에서 프라이머는 DNA 중합 효소에 의해 확장되기 전에 염기 쌍을 통해 주형과 자발적으로 왓슨-크릭 염기쌍을 형성한다. 합성 프라이머를 생성하고 맞춤화하는 능력은 DNA 분석과 관련된 다양한 분자 생물학적 접근 방식에 필수적인 도구이다. 생어 사슬 종결법과 차세대 DNA 시퀀싱 방법 모두 반응을 시작하기 위해 프라이머가 필요하다.[1]

프라이머는 DNA 합성에만 사용되는 것은 아니며, 인플루엔자 바이러스 등 바이러스 유래 중합효소에서 RNA 합성에 사용되기도 한다.

4. 1. DNA 염기서열 분석 (Sequencing)

DNA 염기서열 분석은 DNA 가닥 내에 존재하는 뉴클레오티드를 결정하는 기법이다. 생어 사슬 종결법에서는 프라이머를 연쇄 반응의 시작에 사용한다.[1]

4. 2. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)



PCR은 한 쌍의 맞춤형 프라이머를 사용하여 증폭하려는 서열의 반대쪽 끝에서 서로를 향해 DNA 신장을 유도한다. 이러한 프라이머는 일반적으로 길이가 18~24개 염기이며, 증폭하려는 서열의 특정 상류 및 하류 부위만을 코딩해야 한다.[1] DNA를 따라 여러 영역에 결합할 수 있는 프라이머는 모든 영역을 증폭하여 PCR의 목적을 무효화한다.

프라이머 결합을 위해 DNA의 특정 영역을 선택하는 것과 더불어, 모노뉴클레오타이드 및 디뉴클레오타이드 반복이 높은 영역은 루프 형성이 발생하여 잘못된 혼성화에 기여할 수 있으므로 피해야 한다. 프라이머는 혼합물 내의 다른 프라이머와 쉽게 어닐링되어서는 안 되며, 이 현상은 최종 용액을 오염시키는 '프라이머 이량체' 생성물을 생성할 수 있다. 또한 프라이머는 자체적으로 강하게 어닐링되어서는 안 되며, 내부 헤어핀 및 루프가 템플릿 DNA와의 어닐링을 방해할 수 있다.

프라이머를 설계할 때 각 프라이머의 뒷부분에 추가적인 뉴클레오타이드 염기를 추가하여 증폭된 영역의 각 끝에 맞춤형 캡 서열을 만들 수 있다. 이 방법의 한 가지 응용 분야는 PCR과 유사한 특수한 서브클로닝 기술인 TA 클로닝에 사용하기 위한 것이며, 5′ 및 3′ 말단에 AG 꼬리를 추가하여 효율성을 높일 수 있다.[10]

어떤 상황에서는 ''디제너레이트 프라이머''의 사용이 필요할 수 있다.

4. 2. 1. PCR 프라이머 설계

중합 효소 연쇄 반응(PCR) 프라이머는 증폭하려는 DNA 영역에 특이적으로 결합하도록 설계되어야 한다. 프라이머 쌍은 증폭하려는 서열의 양쪽 끝에서 서로를 향하도록 DNA 신장을 유도한다. 이러한 프라이머는 일반적으로 길이가 18~24개의 염기이며, 증폭하려는 서열의 특정 상류 및 하류 부위만을 코딩해야 한다. DNA를 따라 여러 영역에 결합할 수 있는 프라이머는 모든 영역을 증폭하여 PCR의 목적을 무효화한다.[1]

프라이머 쌍을 설계할 때는 다음 사항을 고려해야 한다.

  • 프라이머 쌍은 비슷한 융점(Tm)을 가져야 하며, 이 공통 융점은 반응의 어닐링 온도보다 너무 높거나 낮아서는 안 된다. 반응의 어닐링 온도보다 훨씬 높은 ''T''m을 가진 프라이머는 잘못된 혼성화가 일어나 DNA 서열을 따라 잘못된 위치에서 신장될 수 있다. 어닐링 온도보다 상당히 낮은 ''T''m은 어닐링에 실패하고 전혀 신장되지 않을 수 있다.
  • 프라이머 서열은 DNA의 특정 영역을 고유하게 선택하도록 선택되어야 하며, 근처의 유사한 서열에 대한 혼성화 가능성을 피해야 한다.
  • 모노뉴클레오티드 및 디뉴클레오티드 반복이 높은 영역은 루프 형성이 발생하여 잘못된 혼성화에 기여할 수 있으므로 피해야 한다.
  • 프라이머는 혼합물 내의 다른 프라이머와 쉽게 어닐링되어서는 안 되며('프라이머 이량체' 생성 방지), 자체적으로 강하게 어닐링되어서도 안 된다(내부 헤어핀 및 루프 형성 방지).


프라이머 부위를 선택하는 데 일반적으로 사용되는 방법은 BLAST 검색이다. 뉴클레오티드 서열과 프라이머 자체 모두 BLAST 검색이 가능하다. 무료 NCBI 도구인 Primer-BLAST는 프라이머 설계와 BLAST 검색을 하나의 응용 프로그램으로 통합한다.[6] ePrime 및 비컨 디자이너(Beacon Designer)와 같은 상업용 소프트웨어 제품도 프라이머 설계를 지원한다. 또한, 이론적인 PCR 결과의 컴퓨터 시뮬레이션(전자 PCR)을 통해 프라이머 설계를 지원할 수 있다.[7]

2014년 현재, 프라이머 설계를 위한 많은 온라인 도구가 무료로 제공되며, 일부는 PCR의 특정 응용 분야에 초점을 맞추고 있다.

역 프라이머는 cDNA 배열의 역상보 배열을 가져야 하며, 이는 온라인 계산 서비스 등을 통해 쉽게 결정할 수 있다.[17]

4. 2. 2. 축퇴 프라이머 (Degenerate primers)

축퇴 프라이머는 유사하지만 동일하지 않은 프라이머들의 혼합물이다. 이는 서로 다른 생물에서 동일한 유전자를 증폭할 때 유용하게 사용될 수 있는데, 염기서열이 유사하지만 완전히 동일하지는 않기 때문이다.[1]

유전 암호는 축퇴성을 띄고 있어, 여러 개의 서로 다른 코돈이 동일한 아미노산을 암호화할 수 있다. 이러한 특성 덕분에 서로 다른 생물체가 매우 유사한 단백질을 암호화하는 상당히 다른 유전자 서열을 가질 수 있다. 이러한 이유로, 축퇴 프라이머는 프라이머 설계가 단백질 서열을 기반으로 할 때에도 사용되는데, 특정 코돈 서열은 알려져 있지 않기 때문이다. 예를 들어, 아미노산 아이소류신에 해당하는 프라이머 서열은 "ATH"일 수 있으며, 여기서 A는 아데닌, T는 티민, H는 아데닌, 티민, 또는 사이토신을 나타내며, 각 코돈에 대한 유전 암호에 따라 IUPAC 축퇴 염기 표기를 사용한다. 다만, 축퇴 프라이머는 표적 서열과 완벽하게 혼성화되지 않을 수 있으며, 이는 PCR 증폭의 특이성을 크게 감소시킬 수 있다.

축퇴 프라이머는 미생물 생태학 분야에서 널리 사용되며, 아직 배양되지 않은 미생물로부터 유전자를 증폭하거나, 유전체 정보가 없는 생물체로부터 유전자를 회수할 때 유용하다. 일반적으로 축퇴 프라이머는 GenBank에서 찾을 수 있는 유전자 서열을 정렬하여 설계된다. 염기 서열 간의 차이는 IUPAC 축퇴 염기 표기를 사용하여 나타낼 수 있으며, 이후 PCR 프라이머는 코돈 서열의 모든 가능한 조합에 해당하는 프라이머 혼합물로 합성된다.

축퇴 프라이머 설계를 위한 프로그램은 다음과 같다.

프로그램 이름설명지원 상태
CODEHOP서버상에서 실행 가능, 블록 포맷 사용중단
HYDEN윈도우 명령 프롬프트에서 실행 가능지원
iCODEHOP블록 포맷 사용중단
FAS-DPD최신 Java 애플리케이션지원


5. 한국의 생명공학 연구와 프라이머

프라이머는 한국 생명공학 연구에서 핵심적인 역할을 수행하며, 다양한 분야에서 활용되고 있다.

참조

[1] 서적 Molecular Biology: Principles and Practice W. H. Freeman and Company
[2] 논문 In vitro reconstitution of RNA primer removal in Archaea reveals the existence of two pathways https://doi.org/10.1[...] 2012-09-26
[3] 서적 Molecular Biology: Principles and practice W. H. Freeman 2016-12-21
[4] 논문 Primer removal during mammalian mitochondrial DNA replication 2015-10-01
[5] 논문 Okazaki fragment metabolism 2013-02-01
[6] 웹사이트 Primer-BLAST https://www.ncbi.nlm[...]
[7] 웹사이트 Electronic PCR https://www.ncbi.nlm[...] NCBI - National Center for Biotechnology Information 2012-03-13
[8] 웹사이트 About DECIPHER https://decipher.san[...] Wellcome Trust Sanger Institute 2014-02-12
[9] 논문 New Sets of Primers for DNA Identification of Non-Indigenous Fish Species in the Volga-Kama Basin (European Russia) 2022-02-01
[10] 문서 Adenosine added on the primer 50 end improved TA cloning efficiency of polymerase chain reaction products
[11] 문서 Distinguishing the pathways of primer removal during Eukaryotic Okazaki fragment maturation hdl:1802/6537
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