다중클론 항체
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1. 개요
다클론 항체는 여러 에피토프를 인식하는 항체의 혼합물로, 일반적으로 동물을 면역화하여 생산된다. 다클론 항체 생산은 항원 준비, 보조제 선택, 동물 선택, 주사 및 혈청 추출 단계를 거치며, 토끼가 가장 일반적으로 사용되는 동물이다. 다클론 항체는 단일클론 항체보다 생산 비용이 저렴하고 광범위한 에피토프에 결합할 수 있으며, 다양한 환경에서 안정적이라는 장점이 있다. 반면, 재현성이 낮고 배치 간 변동성이 크다는 단점도 존재한다. 다클론 항체는 기초 연구, 진단, 치료 등 다양한 분야에 활용되며, 디곡신 면역 파브, Rho(D) 면역 글로불린, 로즈롤리무맙 등이 치료제로 사용된다. 최근에는 다클론 항체의 장점을 유지하면서 단점을 극복하기 위해 재조합 다클론 항체 개발 연구가 진행되고 있다.
다클론 항체는 일반적으로 항원을 동물에 주사하여 생산한다. 보조제를 함께 사용하여 면역 반응을 증폭시킨다.
2. 다클론 항체의 생산
다클론 항체 생산의 일반적인 절차는 다음과 같다.[1]
# 항원 준비
# 보조제 선택 및 준비
# 동물 선택
# 주사 과정
# 혈청 추출
선택된 동물에게 항원/보조제 접합체를 주사하면, 일정 기간 동안 여러 번 주사하여 항체를 생성시킨다. 이후 동물로부터 혈액을 추출하고 정제하여 원하는 항체를 얻는다.[1]
접종은 주로 생쥐, 토끼, 염소와 같은 포유류에게 실시한다. 더 많은 양의 혈청을 얻기 위해 큰 포유류를 선호하기도 한다. 항원이 포유류에 주입되면, B-림프구가 항원에 특이적인 IgG 면역글로불린을 생성하게 된다. 이렇게 생성된 다클론 IgG는 포유류의 혈장에서 정제 과정을 거쳐 얻어진다.[2]
실험 동물에서 다클론 항체를 생산하는 다양한 방법이 존재한다. 관련 지침은 인도적 고려 사항과 보조제 사용에 대한 적절한 수행에 중점을 둔다. 여기에는 보조제 선택, 투여 경로 및 부위, 주입량, 동물별 부위 수 등이 포함된다. 기관 정책은 수집 가능한 혈액량, 동물 또는 직원의 부상 방지를 위한 안전 예방 조치 등도 포함한다.[1]
실험 동물에서 항체 생산의 주요 목표는 실험이나 진단에 사용될 높은 역가와 친화도를 가진 항혈청을 얻는 것이다. 보조제는 항원에 대한 면역 반응을 개선하고 강화하는 데 사용된다. 대부분의 보조제는 항원을 림프절로 천천히 방출하여 항원 저장소를 제공한다.[1]
많은 보조제는 다음과 같은 역할도 수행한다.
# 넓은 표면적에 단백질 항원 분자를 농축시키는 계면활성제 역할
# 면역자극 분자 또는 특성 제공[1]
보조제는 일반적으로 항체 역가를 높이고 장기간 지속되는 면역 반응을 유도하기 위해 가용성 단백질 항원과 함께 사용된다. 이러한 항원 자체는 면역원성이 떨어지는 경우가 많다. 복합 단백질 항원은 여러 B 세포 클론을 유도하여 다클론성 반응을 일으킨다. 비단백질 항원에 대한 면역 반응은 일반적으로 보조제에 의해 강화되지 않으며, 면역 기억도 형성되지 않는다.[1]
최근에는 특정 재조합 단일클론 항체 혼합물 생산을 위해 인간 B 림프구를 분리하여 항체를 생산하기도 한다. 심포젠과 같은 생명공학 회사는 치료용 항체를 개발하고 있다. 이들은 다클론 항체 약물의 다양성을 모방하는 단일클론 항체 혼합물로 2단계 임상 시험에 도달한 최초의 연구 회사이다. 이러한 생산 방식은 바이러스 및 프리온 전염을 방지하고 과정이 간단하다는 장점이 있다.
2. 1. 항원 준비
항원은 면역 반응을 유도할 수 있는 물질로, 단백질, 펩타이드, 탄수화물 등이 사용될 수 있다.
작은 폴리펩타이드와 비단백질 항원은 일반적으로 면역원성을 높이기 위해 더 크고 면역원성이 있는 운반체 단백질에 접합하거나 가교 결합해야 한다. 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 소 혈청 알부민은 널리 사용되는 두 가지 운반체 단백질이다. 폴리-L-라이신은 펩타이드의 골격으로도 성공적으로 사용되었다. 최근에는 리포솜도 작은 펩타이드 전달에 성공적으로 사용되었으며, 이 기술은 유성 에멀젼 보조제와 함께 전달하는 대안이다.
면역을 위한 항원량의 선택은 항원의 특성과 선택된 보조제에 따라 달라진다. 일반적으로, 높은 역가의 항체를 유도하기 위해서는 보조제 내의 단백질을 마이크로그램에서 밀리그램 단위로 사용하는 것이 필요하다. 항원 투여량은 일반적으로 체중보다는 종에 관련된다.
특정 종을 면역하기 위한 최적 및 일반적인 단백질 항원 수준은 다음과 같다.
| 동물 | 항원량 (μg) |
|---|---|
| 토끼 | 50–1000 |
| 쥐 | 10–50 |
| 기니피그 | 50–500 |
| 염소 | 250–5000 |
항체를 생성하기 위해 펩타이드를 사용하는 경우, 항원을 적절하게 설계하는 것이 매우 중요하다. 항원은 항상 미생물 오염이 없는지 확인하는 기술을 사용하여 준비해야 한다.
2. 2. 보조제 선택 및 준비
보조제는 항원의 면역원성을 높여주는 물질이다. 대부분의 보조제는 항원을 배출 림프절로 천천히 방출할 수 있는 주사 부위, 항원 저장소를 제공한다. 많은 보조제는 또한 직접적으로 넓은 표면적에 걸쳐 단백질 항원 분자의 농도를 촉진하는 계면활성제 역할 및 면역자극 분자 또는 특성을 갖는다. 보조제는 일반적으로 항체 역가를 높이고 기억을 동반한 장기간의 반응을 유도하기 위해 가용성 단백질 항원과 함께 사용된다.[1]다양한 종류의 면역 보조제가 상업적으로 판매되고 있다. 특정 보조제 또는 종류의 선택은 연구 및 항체 생산에 사용할 것인지, 아니면 백신 개발에 사용할 것인지에 따라 달라진다. 모든 목적에 이상적인 단일 보조제는 없으며, 모든 보조제는 장점과 단점을 가지고 있다. 항체 생산에 가장 자주 사용되는 보조제는 프로인트 보조제, 명반, 리비 보조제 시스템 및 타이터맥스이다.[1]
2. 3. 동물 선택
다클론 항체 생산에는 닭, 염소, 기니피그, 햄스터, 말, 생쥐, 쥐, 양 등 다양한 동물이 사용될 수 있다. 하지만 토끼가 이러한 목적에 가장 일반적으로 사용되는 실험 동물이다.[1] 동물 선택은 다음을 기준으로 해야 한다.[1]| 기준 |
|---|
| 필요한 항체의 양 |
| 항원 공여자와 수용 항체 생산자 간의 관계 (일반적으로 계통 발생학적 관계가 멀수록 항체 반응 역가가 높아질 가능성이 큼) |
| 만들어야 할 항체의 필수 특성 (예: 클래스, 서브클래스 (아이소타입), 보체 고정 특성) |
면역 주사와 정맥 절개술은 스트레스와 관련이 있으며, 적어도 토끼와 설치류를 사용할 때는 특정 병원체 불포함(SPF) 동물을 선호한다. 이러한 동물을 사용하면 특히 토끼의 ''Pasteurella multocida''와 같은 병원성 유기체로 인한 이환율과 사망률을 줄일 수 있다.[1]
대량의 항혈청이 필요한 경우 염소나 말을 일반적으로 사용한다. 많은 연구자들은 포유류와 계통 발생학적으로 거리가 멀기 때문에 닭을 선호한다. 닭은 많은 양의 IgY(IgG)를 난황으로 옮기며, 달걀에서 항체를 수확하면 침습적인 채혈 절차가 필요하지 않다. 일주일 분량의 알에는 일주일에 한 번 채혈하여 얻는 토끼 혈액량보다 10배나 많은 항체가 들어 있을 수 있다. 그러나 특정 닭 유래 항체를 면역 분석에 사용할 때는 몇 가지 단점이 있다. 닭 IgY는 포유류 보체 성분 C1을 고정하지 않으며 표준 용액을 사용하여 침전 항체로 작용하지 않는다.[1]
생쥐는 단일클론 항체 생산에 가장 자주 사용되지만, 크기가 작아서 다클론 혈청 항체를 충분히 생산하는 데는 일반적으로 사용할 수 없다. 그러나 생쥐의 다클론 항체는 복수액 생산 방법론을 사용하여 복수액에서 채취할 수 있다.[1]
토끼를 사용할 때는 강력한 항체 반응을 유도하기 위해 어린 성체(2.5kg~3kg)를 1차 면역에 사용해야 한다. 면역 기능은 사춘기에 최고조에 달하며 새로운 항원에 대한 1차 반응은 나이가 들면서 감소한다. 암컷 토끼는 일반적으로 더 순종적이고 수컷보다 더 강력한 면역 반응을 나타낸다고 알려져 있어 선호된다. 아웃브리딩 동물을 사용할 때는 항원당 최소 두 마리의 동물을 사용해야 한다. 이 원칙은 개별 동물의 항원에 대한 무반응으로 인한 잠재적인 총 실패를 줄여준다.[1]
2. 4. 주사 및 혈청 추출
항원/보조제 접합체는 증폭된 면역 반응을 시작하기 위해 선택한 동물에 주입된다. 특정 기간 동안 일련의 주사를 맞으면 동물은 접합체에 대한 항체를 생성할 것으로 예상된다. 그런 다음 동물로부터 혈액을 추출하여 정제하여 원하는 항체를 얻는다.[1]접종은 생쥐, 토끼 또는 염소와 같은 적절한 포유류에 수행된다. 채취할 수 있는 혈청의 양이 더 많기 때문에 대형 포유류가 종종 선호된다. 항원은 포유류에 주입된다. 이것은 B-림프구가 항원에 특이적인 IgG 면역글로불린을 생성하도록 유도한다. 이 다클론 IgG는 포유류의 혈장에서 정제된다.[2]
3. 다클론 항체의 장점
다클론 항체는 단일클론 항체에 비해 여러 장점이 있다. 우선 다클론 항체는 단일클론 항체만큼 생산 기술이 까다롭지 않다. 생산 비용이 저렴하고 비교적 빠르게 생성할 수 있으며, 생산에 최대 몇 달이 소요된다.[1] 다클론 항체는 항원의 광범위한 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 이질성을 가지며, 많은 수의 B 세포 클론에서 생산되기 때문에 특정 항원에 성공적으로 결합할 가능성이 더 높다.[1] 또한, 다클론 항체는 pH 변화나 염 농도 변화와 같은 다양한 환경에서 안정적으로 유지되므로 특정 절차에 더 유용하게 적용될 수 있다.[1] 필요한 양에 따라 사용되는 동물의 크기에 비례하여 다량의 다클론 항체를 생산할 수 있다는 장점도 있다.[1]
4. 다클론 항체의 단점
다클론 항체를 사용하는 데에는 단일클론 항체에 비해 몇 가지 단점이 있는데, 주로 재현성 측면과 관련이 있다.[9] 다클론 항체는 항원에 대한 면역 반응에 의해 생성된다. 개별 동물이나 인간은 동일한 항원에 대해 서로 다른 항체를 생성하며, 동일한 항원에 여러 번 노출되는 경우, 다클론 항체 혼합물은 시간에 따라 달라진다. 이러한 '배치 간' 변동성은 다클론 항체를 사용하는 데 있어서 가장 큰 문제점 중 하나이다.
5. 다클론 항체의 응용
다클론 항체는 기초 연구, 진단, 치료 등 다양한 분야에서 활용된다.
- 디곡신 면역 파브는 디기탈리스 유도체에 대해 생성된 다클론 항체의 항원 결합 조각이며, 생명을 위협하는 디곡신, 디지톡신 독성과 관련이 있다.[1][2][3]
- Rho(D) 면역 글로불린은 D 항체에 대한 항체를 가진 Rh 음성 기증자가 제공한 풀린 인간 혈장에서 만들어지며, 신생아 용혈성 질환과 관련이 있다.[4][5]
- 로즈롤리무맙은 25개의 고유한 IgG1 항체로 구성된 RhD 재조합 인간 다클론 항체이며, 면역 혈소판 감소성 자반병 치료 및 Rh 음성 임산부의 동종 면역과 관련이 있다.
- REGN-COV2 (리제네론 파마슈티컬스)는 코로나19, SARS-CoV-2 코로나바이러스와 관련이 있다.
5. 1. 치료 분야
디곡신 면역 파브는 디기탈리스 유도체에 대해 생성된 다클론 항체의 항원 결합 조각으로, 생명을 위협하는 디곡신, 디지톡신 독성을 중화하는 데 사용된다.[1][2][3]Rho(D) 면역 글로불린은 Rh-D 항원에 대한 항체를 가진 Rh 음성 기증자의 혈장으로 만들어진다. 이는 항원과 결합하여 신생아 용혈성 질환을 유발할 수 있는 산모의 면역 반응을 예방한다.[4][5]
로즈롤리무맙은 25개의 IgG1 항체로 구성된 RhD 재조합 인간 다클론 항체로, 면역 혈소판 감소성 자반병 치료와 Rh 음성 임산부의 동종 면역 예방에 사용된다.
REGN-COV2 (리제네론 파마슈티컬스)는 코로나19 환자 치료 및 SARS-CoV-2 감염 예방을 위한 치료제 후보 물질이다.
6. 재조합 다클론 항체
재조합 다클론 항체는 단클론 항체의 혼합물을 사용하여 다클론 항체의 광범위한 에피토프 인식[10]과 높은 민감도[11]를 모방한다. 단클론 항체의 재조합 생산은 다클론 항체의 가변성 및 재현성 문제를 해결했다.[12] 최근 기술 발전으로 인간 및 면역 동물에서 다클론 항체 단백질을 직접 시퀀싱할 수 있게 되었다.[13][14] 이렇게 시퀀싱된 항체 단백질은 면역계에서 생성된 원래의 다클론 항체를 모방하기 위해 재조합 방식으로 생산될 수 있다.
7. 대한민국과 다클론 항체
대한민국은 1990년대 후반부터 바이오 산업 육성에 힘써왔으며, 다클론 항체 기술은 바이오시밀러 개발의 핵심 기술 중 하나로 자리 잡았다. 셀트리온, 삼성바이오에피스 등 대한민국 기업들은 다클론 항체 기술을 바탕으로 개발한 바이오시밀러 제품을 글로벌 시장에 출시하며, 세계적인 경쟁력을 입증하고 있다. 특히, 2002년 한일 월드컵 4강 신화를 이끈 거스 히딩크 감독이 셀트리온의 항체 치료제를 투여받고 건강을 회복한 사례는 대한민국 바이오 산업의 위상을 보여주는 대표적인 사례로 꼽힌다.
참조
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Digibind (Digoxin Immune Fab): Side Effects, Uses, Dosage, Interactions, Warnings
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DIGIBIND®DIGOXIN IMMUNE FAB (OVINE)
https://dailymed.nlm[...]
2024-07-02
[3]
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DIGIFAB DIGOXIN IMMUNE FAB (OVINE)
https://www.fda.gov/[...]
2024-07-12
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https://www.ncbi.nlm[...]
2020-01-05
[5]
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https://www.usatoday[...]
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2009-06-27
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간행물
Critical Steps in the Production of Polyclonal and Monoclonal Antibodies: Evaluation and Recommendations
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Monoclonal Versus Polyclonal Antibodies: Distinguishing Characteristics, Applications, and Information Resources
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Reproducibility: Standardize antibodies used in research
2015
[10]
웹사이트
Monoclonal Versus Polyclonal Antibodies: Distinguishing Characteristics, Applications, and Information Resources
https://academic.oup[...]
[11]
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Critical Steps in the Production of Polyclonal and Monoclonal Antibodies: Evaluation and Recommendations
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A Potent Recombinant Polyclonal Antibody Therapeutic for Protection Against New Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Variants of Concern
2023
[13]
웹사이트
Into the Dark Serum Proteome: Personalized Features of IgG1 and IgA1 Repertoires in Severe COVID-19 Patients
https://www.mcponlin[...]
[14]
간행물
De novo protein sequencing of antibodies for identification of neutralizing antibodies in human plasma post SARS-CoV-2 vaccination
2024
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