인공 유전자 합성
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1. 개요
인공 유전자 합성은 새로운 DNA 서열을 만들고 설계하는 기술로, DNA 합성의 표준 방법, DNA 조립, 오류 수정 절차, 인공 염기쌍 도입 등을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드 합성, 가열냉각을 이용한 올리고뉴클레오타이드 연결 등의 방법으로 짧은 길이의 DNA를 합성하고, BioBrick, 부위 특이적 재조합, 장-오버랩 기반 조립 등의 기술을 활용하여 더 긴 DNA를 조립한다. 인공 유전자 합성은 세균 유전체 합성, 합성 효모 2.0 프로젝트 등 합성 생물학, 이종 유전자 발현, 백신 개발, 유전자 치료 등 다양한 분야에 응용된다.
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2. DNA 합성의 표준 방법
올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트를 사용하여 화학적으로 합성된다. 이 분자들은 아민, 수산기, 인산기가 잘못된 상호작용을 일으키지 않도록 보호기를 가진 일반적이거나 수정된 뉴클레오사이드이다. 포스포르아미다이트는 한 번에 하나씩 추가되며, 5' 수산기는 탈보호된 후 새로운 염기가 결합한다. 핵산 사슬은 생합성의 반대 방향인 3'에서 5' 방향으로 합성된다. 합성 후에는 모든 보호기가 제거된다. 이러한 과정에도 불구하고, 몇몇 잘못된 상호작용으로 인해 오류가 발생하기도 한다. 긴 올리고뉴클레오타이드를 합성할수록 오류가 더 많이 발생하므로, 이 방법은 짧은 길이의 핵산 합성에만 실용적이다. 현재 기술로는 약 200 염기 정도까지의 핵산 합성이 가능하며, 이 정도가 실제 활용 가능한 수준이다. HPLC를 이용하면 원하는 생성물을 분리할 수 있다. 한편, 많은 수의 핵산은 유전자 칩 위에서 병렬로 합성될 수 있으며, 최적의 성능을 위해 대규모로 독립적으로 준비되어야 한다.[1]
2. 1. 올리고뉴클레오타이드 합성
올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 포스포라미다이트를 사용하여 화학적으로 합성된다. 이들은 아민, 수산기, 인산기가 잘못된 방식으로 상호 작용하는 것을 방지하기 위해 보호기를 가진 일반적이거나 변형된 뉴클레오사이드일 수 있다.[1] 포스포라미다이트는 한 번에 하나씩 추가되며, 5' 수산기가 탈보호되고 새로운 염기가 추가된다.[1] 핵산 사슬은 3'에서 5' 방향으로 합성되는데, 이는 생합성과 반대 방향이다.[1] 합성 마지막에는 모든 보호기가 제거된다.[1]이러한 합성 과정에도 불구하고, 몇몇 옳지 않은 상호작용으로 인해 가끔 잘못된 생성물이 만들어지기도 한다.[1] 합성되는 올리고뉴클레오타이드 서열이 길수록 결함이 더 많이 발생하므로, 이 과정은 짧은 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 데에만 실용적이다.[1] 현재 실용적인 한계는 생물학적 응용 분야에 직접 사용할 수 있는 충분한 품질의 올리고뉴클레오타이드를 기준으로 약 200 bp (염기쌍)이다.[1] HPLC를 사용하면 적절한 서열을 가진 생성물을 분리할 수 있다.[1] 한편, 많은 수의 올리고뉴클레오타이드는 유전자 칩에서 병렬로 합성할 수 있으며, 이후 유전자 합성 절차에서 최적의 성능을 위해 개별적으로 그리고 더 큰 규모로 준비해야 한다.[1]
일반적으로, 개별적으로 디자인된 올리고뉴클레오타이드 분자들은 자동화된 고체상 합성기에서 합성된다.[2] 합성된 올리고뉴클레오타이드 분자들은 정제된 후, 중합효소나 연결 작용을 이용해 연결된다.[2] 올리고뉴클레오타이드 가열냉각(annealing) 특정성을 강화하기 위해, 합성 과정은 내열성 DNA 연결효소와 중합효소에 의존한다.[2] 현재까지 이러한 합성에 연결효소 연쇄 반응이나 중합효소 연쇄 반응이 사용되고 있다.[2] 이 방법들은 보통 40-50 염기 정도의 올리고뉴클레오타이드를 덮어 쓰는 데 사용된다.[2] 이 올리고뉴클레오타이드들은 각 가닥의 서열을 덮어쓰도록 설계되었으며, 더 긴 길이의 분자는 덮어쓰기 확장에 의해 생성된다.[2] 이런 방식으로 합성된 인공 유전자의 길이는 600 염기부터 1200 염기까지이다. 비록 더 긴 유전자가 1000 염기 이하의 조각들로 합성되지만, 이 크기는 필수적으로 염기서열 분석이 필요하다.[2]
2. 2. 가열냉각을 이용한 올리고뉴클레오타이드의 연결
일반적으로, 개별적으로 디자인된 올리고뉴클레오타이드 분자들은 자동화된 고체상 합성기에서 만들어진다. 보통 올리고뉴클레오타이드 분자들은 모두 정제된 후, 중합 효소나 연결 작용을 이용해 연결된다. 올리고뉴클레오타이드 가열냉각(annealing) 특정성을 강화하기 위해, 합성 과정은 내열성 DNA 연결효소와 중합효소에 의존한다. 현재까지는 이러한 합성에 연결효소 연쇄 반응이나 중합 효소 연쇄 반응이 사용되고 있다.[2][3][4][9] 그 방법들은 보통 40-50 염기 정도의 올리고뉴클레오타이드를 덮어 쓰는데 사용된다. 이 올리고뉴클레오타이드들은 많은 서열을 각 가닥의 서열을 덮어쓰기 위해서 설계되었으며, 더 긴 길이의 분자는 덮어쓰기 확장에 의해 생성된다. 이런 방식으로 합성된 인공 유전자의 길이는 600 염기부터 1,200 염기까지이고, 비록 더 긴 유전자가 1,000 염기 이하의 조각들로 합성이 되지만, 이런 크기는 필수적으로 염기서열 분석이 필요하다.[9][10][11]2. 3. 한계점
올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트(nucleoside phosphoramidites)를 사용하여 화학적으로 합성된다. 이 방식은 생합성과 반대 방향인 3'에서 5' 방향으로 핵산 사슬을 합성한다. 그러나 이 과정에서 몇몇 부작용으로 인해 잘못된 생성물이 만들어지기도 한다. 일반적으로 더 긴 올리고뉴클레오타이드를 합성할수록 더 많은 오류가 발생하기 때문에, 약 200 염기 정도까지만 실제로 활용할 수 있다.[1]전체 길이의 유전자 산물 조립은 긴 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 효율적이고 특이적인 정렬에 의존한다. 따라서 역반복으로 인한 2차 구조, 비정상적으로 높거나 낮은 GC 함량, 반복 구조를 포함하는 확장된 서열 영역 등은 합성에 어려움을 준다. 이러한 문제는 절차를 여러 단계로 나누고 더 짧은 하위 서열을 조립하는 방식으로 해결할 수 있지만, 시간과 노력이 더 많이 필요하다.[1]
유전자 합성 실험의 결과는 사용된 올리고뉴클레오타이드의 품질에 크게 의존한다. 어닐링 기반 유전자 합성 프로토콜의 경우, 산물의 품질은 사용된 올리고뉴클레오타이드의 정확성에 직접적이고 지수적으로 의존한다. 품질이 낮은 올리고뉴클레오타이드를 사용하면 클론 분석에 추가적인 노력이 필요하며, 이는 시간 소모적이다.[1]
화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드 사용으로 인한 높은 서열 오류 발생 빈도도 문제이다. 오류 빈도는 올리고뉴클레오타이드가 길어질수록, 사용되는 올리고뉴클레오타이드가 많을수록 증가한다. 더 짧은 올리고뉴클레오타이드를 사용하면 돌연변이 문제를 해결할 수 있지만, 상보적인 프라이머의 정확하고 특이적인 어닐링을 항상 허용하지 않아 전체 길이의 생성물 형성을 억제할 수 있다.[1]
올리고뉴클레오타이드 설계는 수작업으로 할 경우 많은 노력이 필요하며, 성공적인 합성을 보장하지 않는다. 최적의 성능을 위해서는 중첩 영역의 용융 온도가 모든 올리고뉴클레오타이드에 대해 유사해야 하며, 전문 프로그램을 사용하여 프라이머 최적화를 수행해야 한다. 지금까지 유전자 합성을 위한 자동화된 프라이머 설계에 대한 여러 솔루션이 제시되었다.[1]
2. 4. 오류 수정 절차
합성된 올리고뉴클레오타이드 품질과 관련된 문제를 극복하기 위해 여러 정교한 전략이 개발되었다. 여기에는 별도로 준비된 낚시 올리고뉴클레오타이드,[15] mutS 계열의 오류 결합 효소,[16] 세균이나 파지에서 유래한 특정 엔도뉴클레아제가 사용된다.[17] 그럼에도 불구하고, 이러한 모든 전략은 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드의 어닐링을 기반으로 하는 유전자 합성의 시간과 비용을 증가시킨다.대량 병렬 시퀀싱은 복잡한 올리고뉴클레오타이드 라이브러리를 선별하고 정확한 분자를 검색하는 도구로도 사용되었다. 한 가지 접근 방식에서는 454 파이로시퀀싱 플랫폼에서 올리고뉴클레오타이드를 시퀀싱하고, 로봇 시스템이 정확한 서열에 해당하는 개별 비드를 이미지화하고 선택한다.[18] 또 다른 접근 방식에서는 복잡한 올리고뉴클레오타이드 라이브러리가 대량 병렬 시퀀싱 전에 고유한 측면 태그로 수정된다. 그런 다음 태그 지향적 프라이머를 사용하여 다이얼 아웃 PCR로 원하는 서열을 가진 분자를 검색할 수 있다.[19]
점점 더 많은 유전자가 기능적으로 관련된 유전자 또는 단일 유전자에 대한 여러 서열 변이체를 포함하는 세트로 주문된다. 단클론 항체와 같은 개발 중인 사실상 모든 치료 단백질은 개선된 기능 또는 발현을 위해 많은 유전자 변이체를 테스트하여 최적화된다.
2. 5. 인공 염기쌍
전통적인 핵산 합성은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 4개의 염기쌍만 사용하지만, 미래의 올리고뉴클레오타이드 합성은 자연계에 존재하지 않는 인공적으로 설계되고 합성된 뉴클레오베이스인 인공 염기쌍을 사용할 수 있다.2012년, 캘리포니아주 샌디에이고에 있는 스크립스 연구소의 화학 생물학자인 플로이드 로메스버그가 이끄는 미국 과학자 그룹은 인공 염기쌍(UBP)을 설계했다고 발표했다. 두 개의 새로운 인공 뉴클레오타이드 또는 '인공 염기쌍'(UBP)은 '''d5SICS'''와 '''dNaM'''으로 명명되었다. 좀 더 기술적으로 말하면, 소수성 뉴클레오베이스를 갖는 이러한 인공 뉴클레오타이드는 DNA에서 (d5SICS–dNaM) 복합체 또는 염기쌍을 형성하는 두 개의 융합된 방향족 탄화수소를 특징으로 한다. 2014년, 스크립스 연구소의 같은 팀은 자연적인 T-A 및 C-G 염기쌍과 로메스버그 연구실에서 설계한 최고의 UBP를 포함하는 플라스미드로 알려진 원형 DNA 조각을 합성하여 일반적인 박테리아인 ''대장균''(E. coli)의 세포에 삽입했으며, 이 박테리아는 여러 세대에 걸쳐 인공 염기쌍을 성공적으로 복제했다.[20] 이것은 확장된 유전 코드를 후대에게 전달하는 살아있는 유기체의 최초의 알려진 예이다. 이는 부분적으로 d5SICSTP와 dNaMTP의 삼인산을 ''대장균''(E. coli) 박테리아로 효율적으로 가져오는 뉴클레오사이드 삼인산 수송체를 발현하는 지지적인 조류 유전자를 추가함으로써 달성되었다. 그런 다음, 자연적인 박테리아 복제 경로는 이를 사용하여 d5SICS–dNaM을 포함하는 플라스미드를 정확하게 복제한다.
세 번째 염기쌍의 성공적인 통합은 기존의 20개의 아미노산에서 이론적으로 가능한 172개까지 DNA가 암호화할 수 있는 아미노산의 수를 크게 늘려, 살아있는 유기체가 새로운 단백질을 생산할 가능성을 확장하려는 목표를 향한 중요한 돌파구이다.[20] 미래에는 이러한 인공 염기쌍을 DNA 인쇄 방법을 통해 합성하고 올리고뉴클레오타이드에 통합할 수 있다.
3. DNA 조립
DNA 프린팅은 특정 생물학적 기능을 암호화하는 DNA 서열(예: 프로모터, 전사 조절 서열 또는 개방형 리딩 프레임)을 생성하는 데 사용될 수 있다.[21] 그러나 올리고뉴클레오티드 합성은 일반적으로 수백 개의 염기쌍보다 긴 올리고뉴클레오티드 서열을 정확하게 생성할 수 없기 때문에, 이러한 부분을 함께 조립하여 기능성 유전자, 다중 유전자 회로 또는 전체 합성 염색체나 유전체를 생성하기 위해 DNA 조립 방법이 사용되어야 한다.
일부 DNA 조립 기술은 DNA 부분을 연결하기 위한 프로토콜만 정의하는 반면, 다른 기술은 이에 호환되는 DNA 부분의 형식에 대한 규칙도 정의한다. 이러한 프로세스는 전체 염색체 또는 유전체의 조립을 가능하게 하도록 확장될 수 있다. 2015년 현재 14개의 서로 다른 DNA 조립 표준이 개발되었으며, 각각 장단점을 가지고 있다.[22] DNA 조립 표준의 개발은 합성 생물학의 워크플로우를 크게 용이하게 하고, 연구 그룹 간의 물질 교환을 지원하며, 모듈식이고 재사용 가능한 DNA 부분의 생성을 가능하게 했다.[22]
DNA 조립 방법은 엔도뉴클레아제 매개 조립, 부위 특이적 재조합, 장-오버랩 기반 조립의 세 가지 주요 범주로 분류할 수 있다.[22] 각 그룹은 고유한 특성과 장단점을 가지고 있다.
3. 1. 엔도뉴클레아제 매개 조립
엔도뉴클레이스는 핵산 분절을 인식하고 절단하는 효소이며, DNA 조립을 유도하는 데 사용될 수 있다. 다양한 종류의 제한 효소 중에서, II형 제한 효소는 절단 부위가 인식 부위 근처 또는 내부에 위치하기 때문에 가장 흔하게 사용된다. 따라서, 엔도뉴클레이스 매개 조립 방법은 DNA 부분과 조립 프로토콜을 정의하기 위해 이러한 속성을 활용한다.3. 1. 1. BioBricks
BioBrick 조립 표준은 2003년 톰 나이트(Tom Knight)에 의해 설명되고 도입되었으며, 이후 지속적으로 업데이트되었다.[23] 현재 가장 일반적으로 사용되는 BioBrick 표준은 조립 표준 10 (BBF RFC 10)이다. BioBrick은 DNA 부품이 BioBrick 조립 방법과 호환되기 위해 필요한 접두사와 접미사 시퀀스를 정의하여, BioBrick 형식의 모든 DNA 부품을 연결할 수 있도록 한다.
접두사에는 EcoRI, NotI 및 XBaI에 대한 제한 부위가 포함되어 있고, 접미사에는 SpeI, NotI 및 PstI 제한 부위가 포함되어 있다. 접두사와 접미사 영역 외부에서 DNA 부품에는 이러한 제한 부위가 포함되어서는 안 된다. 두 개의 BioBrick 부품을 함께 연결하려면, 플라스미드 중 하나를 EcoRI과 SpeI로 절단하고 두 번째 플라스미드를 EcoRI과 XbaI로 절단한다. 두 개의 EcoRI 돌출부는 상보적이므로 함께 어닐링되며, SpeI과 XbaI도 함께 연결될 수 있는 상보적인 돌출부를 생성한다. 결과 플라스미드에는 원래의 접두사 및 접미사 시퀀스가 포함되어 있으므로 더 많은 BioBrick 부품과 연결하는 데 사용할 수 있다.[24] 이러한 특성으로 인해 BioBrick 조립 표준은 본질적으로 멱등원이라고 한다. 그러나 두 개의 융합된 BioBrick 사이에는 "스카(scar)" 시퀀스(TACTAG 또는 TACTAGAG)가 형성된다. 이는 6bp 스카 시퀀스가 티로신과 정지 코돈을 암호화하여 첫 번째 도메인이 발현된 후 번역이 종료되고, 8bp 스카 시퀀스가 프레임 시프트를 일으켜 코돈의 연속적인 읽기를 방지하므로 BioBrick이 융합 단백질을 만드는 데 사용되는 것을 방지한다. 이러한 문제를 해결하기 위해 BB-2 조립, BglBricks 조립, Silver 조립 및 Freiburg 조립과 같은 다른 조립 표준이 설계되었다.[25][26][27][28]
표준 조립 방법 외에도 여러 가지 장점을 제공하는 다른 조립 방법들도 일반적으로 사용된다. 3 항생제(3A) 조립을 통해 항생제 선택으로 올바른 조립을 선택할 수 있으며, 증폭된 삽입 조립은 3A 조립에서 나타나는 낮은 형질전환 효율을 극복하려는 것이다.[29][30]
BioBrick 조립 표준은 DNA 조립에 다른 유형의 엔도뉴클레아제를 사용하는 데 영감을 주었다. 예를 들어, iBrick 표준과 HomeRun 벡터 조립 표준 모두 II형 제한 효소 대신 호밍 엔도뉴클레아제를 사용한다.[31][32]
3. 1. 2. Type IIs 제한 효소 조립
일부 조립 방법은 Type IIs 제한 효소의 사용을 활용하기도 한다. 이 효소는 인식 부위에서 여러 염기쌍 떨어진 곳을 절단한다는 점에서 다른 Type II 엔도뉴클리아제와 다르다. 결과적으로, 오버행(overhang) 서열을 원하는 서열을 포함하도록 수정할 수 있다. 이는 Type IIs 조립 방법에서 두 가지 장점을 제공하는데, 즉 "무흔적" 조립을 가능하게 하고, 원-팟(one-pot) 다중 부품 조립을 허용한다. Type IIs 엔도뉴클리아제를 사용하는 조립 방법에는 골든 게이트 및 관련 변형체가 있다.3. 2. 부위 특이적 재조합
부위 특이적 재조합은 제한 효소를 사용하는 대신 파지 인테그라아제를 사용하므로 DNA 조각에 제한 부위를 가질 필요가 없다. 대신, 인테그라아제는 고유한 부착(att) 부위를 사용하여 표적 조각과 데스티네이션 벡터 사이의 DNA 재배열을 촉매한다. 1990년대 후반에 발명된 Invitrogen 게이트웨이 클로닝 시스템은 두 가지 독점 효소 혼합물인 BP 클로나아제와 LR 클로나아제를 사용한다. BP 클로나아제 혼합물은 attB 및 attP 부위 간의 재조합을 촉매하여 하이브리드 attL 및 attR 부위를 생성하는 반면, LR 클로나아제 혼합물은 attL 및 attR 부위의 재조합을 촉매하여 attB 및 attP 부위를 생성한다. 각 효소 혼합물은 특정 att 부위만 인식하므로 재조합은 매우 특이적이며 조각을 원하는 순서로 조립할 수 있다.[38]'''벡터 설계 및 조립'''
게이트웨이 클로닝은 독점 기술이므로 모든 게이트웨이 반응은 제조업체에서 제공하는 게이트웨이 키트를 사용하여 수행해야 한다. 반응은 두 단계로 요약할 수 있다. 첫 번째 단계는 관심 DNA 조각을 포함하는 엔트리 클론을 조립하는 것이고, 두 번째 단계는 이 관심 조각을 데스티네이션 클론에 삽입하는 것이다.
# 엔트리 클론은 attP 부위로 둘러싸인 게이트웨이 카세트를 포함하는 공급된 "도너" 벡터를 사용하여 만들어야 한다. 게이트웨이 카세트는 성공적으로 재조합된 엔트리 클론의 생존 및 선택을 허용하는 박테리아 자살 유전자(예: ccdB)를 포함한다. 한 쌍의 attB 부위가 관심 DNA 조각을 둘러싸도록 추가되며, 이는 BP 클로나아제 혼합물이 추가될 때 attP 부위와의 재조합을 허용한다. 엔트리 클론이 생성되고 관심 조각은 attL 부위로 둘러싸인다.
# 데스티네이션 벡터도 게이트웨이 카세트와 함께 제공되지만 대신 한 쌍의 attR 부위로 둘러싸여 있다. 이 데스티네이션 플라스미드를 엔트리 클론 및 LR 클로나아제 혼합물과 혼합하면 attR 및 attL 부위 간의 재조합이 발생할 수 있다. 관심 조각이 성공적으로 삽입된 데스티네이션 클론이 생성된다. 치사 유전자는 원래 벡터에 삽입되며 이 플라스미드로 형질전환된 박테리아는 죽는다. 따라서 원하는 벡터를 쉽게 선택할 수 있다.
게이트웨이 클로닝 방법의 초기 반복은 생성된 각 데스티네이션 클론에 대해 하나의 엔트리 클론만 사용할 수 있도록 했다. 그러나 추가 연구를 통해 4개의 직교 att 서열을 더 생성할 수 있음이 밝혀졌고, 최대 4개의 서로 다른 DNA 조각을 조립할 수 있게 되었으며, 이 프로세스는 이제 다중 사이트 게이트웨이 기술로 알려져 있다.[39]
게이트웨이 클로닝 외에도 다른 인테그라아제를 사용하는 비상업적 방법도 개발되었다. 예를 들어, Serine Integrase Recombinational Assembly(SIRA) 방법은 ϕC31 인테그라아제를 사용하고, Site-Specific Recombination-based Tandem Assembly(SSRTA) 방법은 ''Streptomyces'' 파지 φBT1 인테그라아제를 사용한다.[40][41] HomeRun Vector Assembly System(HVAS)과 같은 다른 방법은 게이트웨이 클로닝 시스템을 기반으로 구축되어 잠재적으로 합성 DNA 구조물의 산업적 합성을 지원할 수 있는 프로토콜을 설계하기 위해 호밍 엔도뉴클레아제를 추가로 통합한다.[31]
3. 3. 장-오버랩 기반 조립
최근 몇 년 동안 다양한 장기 중첩 기반 어셈블리 방법이 개발되었다. 가장 널리 사용되는 방법 중 하나는 2009년에 개발된 깁슨 어셈블리(Gibson assembly) 방법으로, 제한 효소나 인테그라제를 사용하지 않고도 DNA를 한 번에 조립할 수 있다.[42]이 외에도 순환 중합효소 확장 클로닝(CPEC), 시퀀스 및 리가아제 독립 클로닝(SLIC), 심리스 라이게이션 클로닝 추출(SLiCE)과 같은 유사한 중첩 기반 어셈블리 방법들이 있다.[43][44][45] 여러 중첩 어셈블리 방법이 존재함에도 불구하고, 깁슨 어셈블리 방법이 여전히 가장 널리 사용되고 있다.[46]
깁슨 어셈블리 및 기타 어셈블리 방법에서 사용된 개념을 기반으로 링커를 사용한 모듈식 중첩 지향 어셈블리(MODAL) 전략이나, BASIC(Biopart Assembly Standard for Idempotent Cloning) 방법과 같은 새로운 어셈블리 전략도 개발되었다.[47][48]
3. 3. 1. 깁슨 조립 (Gibson Assembly)
깁슨 어셈블리 방법은 비교적 간단한 DNA 조립 방법으로, 5' T5 엑소뉴클레아제, Phusion DNA 중합효소, Taq DNA 연결효소와 같은 몇 가지 시약만 있으면 된다. 조립할 DNA 단편들은 조립될 순서대로 5' 및 3' 말단이 중복되도록 합성된다. 이러한 시약들은 조립할 DNA 단편들과 함께 50°C에서 혼합되며 다음과 같은 반응이 일어난다.# T5 엑소뉴클레아제는 각 단편의 5' 말단에서 DNA를 잘라내어 각 DNA 단편에 3' 오버행을 노출시킨다.
# 인접한 DNA 단편의 상보적인 오버행은 상보적인 염기쌍 형성을 통해 어닐링된다.
# Phusion DNA 중합효소는 단편이 어닐링되는 부분의 틈을 메운다.
# Taq DNA 연결효소는 두 가닥의 틈을 복구한다.
T5 엑소뉴클레아제는 열에 불안정하기 때문에 초기 컷백 단계 이후 50°C에서 비활성화된다. 따라서 생성물은 안정적이며, 단편들은 원하는 순서로 조립된다. 이 원팟 프로토콜은 최대 5개의 서로 다른 단편을 정확하게 조립할 수 있으며, 여러 상업적 공급업체는 2단계 반응으로 최대 15개의 서로 다른 단편을 정확하게 조립할 수 있는 키트를 가지고 있다.[49] 그러나 깁슨 어셈블리 프로토콜은 빠르고 비교적 적은 시약을 사용하지만, 각 단편이 인접한 단편과 중복되는 서열을 포함하도록 설계되고 PCR을 통해 증폭되어야 하므로 맞춤형 DNA 합성이 필요하다. 이러한 PCR 의존성은 긴 단편, 높은 GC 함량 또는 반복 서열이 있는 단편을 사용할 때 반응의 정확도에 영향을 미칠 수도 있다.[48]
3. 3. 2. MODAL
MODAL 전략은 각 DNA 조각에 대해 필요한 사용자 정의의 양을 줄이기 위해 "링커"로 알려진 중첩 시퀀스를 정의한다. 링커는 [https://omictools.com/r2odna-designer-tool R2oDNA Designer] 소프트웨어를 사용하여 설계되었으며, 중첩 영역은 깁슨 어셈블리(Gibson assembly) 및 기타 중첩 조립 방법과 호환되도록 45bp 길이로 설계되었다. 조립할 부분에 이러한 링커를 부착하기 위해, 15 bp의 접두사 및 접미사 어댑터 시퀀스를 포함하는 부분별 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한다. 그런 다음 두 번째 PCR 반응을 통해 링커를 어댑터 시퀀스에 부착한다. DNA 조각의 위치를 지정하기 위해, 동일한 링커를 원하는 상류 조각의 접미사와 원하는 하류 조각의 접두사에 부착한다. 링커가 부착되면 깁슨 어셈블리, CPEC 또는 기타 중첩 조립 방법을 모두 사용하여 원하는 순서로 DNA 조각을 조립할 수 있다.[1]3. 3. 3. BASIC
BASIC 조립 전략은 2015년에 개발되었으며, 이전 조립 기술의 한계를 극복하고자 하였다. 이 방법은 표준 재사용 가능 부품, 단일 계층 형식, 멱등원 복제, 병렬 DNA 조립, 크기 독립성, 자동화라는 여섯 가지 주요 개념을 통합했다.[48]'''DNA 부품 및 링커 디자인'''
DNA 부품은 저장 플라스미드로 설계 및 복제되며, 통합된 접두사(''i''P) 및 통합된 접미사(''i''S) 시퀀스로 둘러싸여 있다. ''i''P 및 ''i''S 시퀀스는 BASIC 링커에 상보적인 오버행을 포함하는 안쪽을 향하는 BsaI 제한 부위를 포함한다.[48] BASIC에서 사용되는 7개의 표준 링커는 R2oDNA Designer 소프트웨어를 사용하여 설계되었으며, 섀시 게놈과 상동성을 갖는 시퀀스를 포함하지 않고, 이차 구조 시퀀스, 제한 부위 또는 리보솜 결합 부위와 같은 원치 않는 시퀀스를 포함하지 않는지 확인하기 위해 검증되었다. 각 링커 시퀀스는 두 부분으로 나뉘며, 각각 4bp 오버행이 BsaI 제한 부위에 상보적이고, 12bp 이중 가닥 시퀀스를 가지며, 다른 절반과 21bp 중첩 시퀀스를 공유한다. 상위 DNA 부품에 결합할 절반은 접미사 링커 부분(예: L1S)으로 알려져 있으며, 하위 부품에 결합할 절반은 접두사 링커 부분(예: L1P)으로 알려져 있다. 이러한 링커는 DNA 부품을 함께 조립하는 기반을 형성한다.
표준 BASIC 링커는 조립 순서를 지시하는 것 외에도 다른 기능을 수행하도록 수정할 수도 있다. 멱등원 조립을 가능하게 하기 위해 BsaI에 의해 인식되지 않도록 보호하기 위해 추가적인 메틸화된 ''i''P 및 ''i''S 시퀀스가 삽입된 링커도 설계되었다. 이러한 메틸화는 형질 전환 및 생체 내 플라스미드 복제 후 손실되며, 플라스미드는 추출, 정제되어 추가 반응에 사용될 수 있다.
링커 시퀀스는 상대적으로 길기 때문에(표준 링커의 경우 45bp), 조립에 필요한 DNA 부품의 수를 줄이기 위해 기능적 DNA 시퀀스를 통합할 기회가 있다. BASIC 조립 표준은 다양한 강도의 RBS가 내장된 여러 링커를 제공한다. 마찬가지로 여러 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 구성을 쉽게하기 위해, DNA 구조체의 완전한 판독을 허용하도록 여러 융합 링커도 설계되었다. 이러한 융합 링커는 15개의 아미노산 글리신과 세린 폴리펩티드를 암호화하며, 이는 여러 도메인을 가진 융합 단백질에 이상적인 링커 펩티드이다.
'''조립'''
최종 구조체를 조립하는 데는 세 가지 주요 단계가 있다.
1. DNA 부품을 저장 플라스미드에서 잘라내어 3' 및 5' 말단에 BsaI 오버행이 있는 DNA 단편을 얻는다.
2. 각 링커 부분을 T4 DNA 연결 효소와 함께 배양하여 해당 DNA 부품에 부착한다. 각 DNA 부품은 조립 순서를 지시하기 위해 두 개의 다른 링커에서 접미사 및 접두사 링커 부분을 갖는다. 예를 들어, 시퀀스의 첫 번째 부분은 L1P 및 L2S를 가지며, 두 번째 부분은 L2P 및 L3S를 갖는다. 링커 부분을 변경하여 조립 시퀀스를 변경할 수 있다.
3. 부착된 링커가 있는 부품을 50°C에서 배양하여 플라스미드로 조립한다. P 및 S 링커의 21bp 오버행이 어닐링되고 최종 구조체는 클로닝을 위해 박테리아 세포로 형질 전환될 수 있다. 단일 가닥 틈새는 형질 전환 후 ''생체 내''에서 복구되어 플라스미드로 클로닝된 안정적인 최종 구조체를 생성한다.
4. 응용 분야
DNA 프린팅 및 DNA 조립 기술의 발전으로 인공 유전자 합성은 새로운 DNA 서열과 단백질 기능을 만들고 설계하는 강력하고 유연한 도구가 되었다.[50] 이는 합성생물학뿐만 아니라 이종 유전자 발현, 백신 개발, 유전자 치료, 분자 공학과 같은 다양한 연구 분야에도 큰 도움을 주고 있다.[51] 특히, 단백질과 펩타이드를 코딩하는 DNA를 빠르고 저렴하게 합성하는 방법은 이들 분야에 획기적인 발전을 가져올 수 있다. 또한 DNA 프린팅 및 조립 기술은 DNA를 정보 저장 매체로 사용하는 것을 가능하게 했다.
4. 1. 세균 유전체 합성
Mycoplasma laboratorium영어 합성은 세균 유전체 합성의 대표적인 사례이다.2007년 6월, J. 크레이그 벤터 연구소는 ''마이코플라스마 마이코이데스''의 DNA를 ''마이코플라스마 카프리콜룸'' 세포에 이식하여 ''M. 마이코이데스''처럼 행동하는 박테리아를 만들었다고 발표했다.[52] 같은 해 10월, 크레이그 벤터는 ''마이코플라스마 제니탈리움''의 단일 염색체를 인공적으로 합성했다고 밝혔다. 이 염색체는 불필요한 유전자를 제거한 최소 게놈 형태였다. 다음 단계는 이 합성 게놈을 DNA가 제거된 세포에 이식하는 것이었다.[53]
2010년, 벤터 그룹은 ''마이코플라스마 마이코이데스'' 게놈을 합성하여 DNA가 제거된 ''마이코플라스마 카프리콜룸'' 세포에 이식, 생존 가능한 "합성" 박테리아를 만들었다. 벤터는 이를 "부모가 컴퓨터인 최초의 종"이라고 묘사했다.[54][55]
4. 1. 1. 신시아(Synthia)와 마이코플라스마 라보라토리움(Mycoplasma laboratorium)
2007년 6월 28일, J. 크레이그 벤터 연구소 연구팀은 ''사이언스 익스프레스''에 논문을 발표하여 ''마이코플라스마 마이코이데스'' 박테리아의 자연 DNA를 ''마이코플라스마 카프리콜룸'' 세포에 성공적으로 이식, ''M. 마이코이데스''처럼 행동하는 박테리아를 만들었다고 밝혔다.[52]2007년 10월 6일, 크레이그 벤터는 영국 신문 ''가디언''과의 인터뷰에서 같은 연구팀이 ''마이코플라스마 제니탈리움''의 단일 염색체 변형 버전을 인공적으로 합성했다고 발표했다. 이 염색체는 살아있는 박테리아 실험에서 불필요한 것으로 나타난 모든 유전자를 제거하도록 수정되었다. 이 ''최소 게놈 프로젝트''의 다음 단계는 합성된 최소 게놈을 기존 DNA가 제거된 박테리아 세포에 이식하는 것이며, 결과 박테리아는 ''마이코플라스마 라보라토리움''이라고 불릴 것이다. 다음 날, 캐나다 생명윤리 단체 ETC 그룹의 팻 로이 무니 대표는 벤터의 "창조물"이 "거의 모든 것을 구축할 수 있는 차대"라고 밝혔다. 합성된 게놈은 아직 작동하는 세포에 이식되지 않았다.[53]
2010년 5월 21일, ''사이언스''는 벤터 그룹이 컴퓨터 기록에서 ''마이코플라스마 마이코이데스'' 박테리아의 게놈을 성공적으로 합성하여 DNA가 제거된 ''마이코플라스마 카프리콜룸'' 박테리아의 기존 세포에 이식했다고 보고했다. 이 "합성" 박테리아는 생존 가능했으며, 수십억 번 복제할 수 있었다. 이 팀은 당초 ''M. 제니탈리움'' 박테리아를 사용하려 했지만, ''M. 마이코이데스''가 훨씬 빠르게 성장하여 실험 속도를 높일 수 있었기 때문에 전환했다.[54] 벤터는 이것을 "그 부모가 컴퓨터인 최초의 종"이라고 묘사한다.[55] 변형된 박테리아는 ETC에 의해 "신시아(Synthia)"라고 불린다.
4. 1. 2. 합성 효모 2.0 (Synthetic Yeast 2.0)
Synthetic Yeast 2.0 프로젝트의 일환으로, 전 세계의 다양한 연구 그룹이 합성 효모 게놈 합성 프로젝트에 참여하여 모델 유기체인 ''사카로미세스 세레비지애''의 게놈을 최적화하고 있다.[56] Yeast 2.0 프로젝트는 다양한 DNA 조립 방법을 적용했으며, 2014년 3월 제프 보크(Jef Boeke)는 뉴욕 대학교 랑곤 메디컬 센터(Langone Medical Centre at New York University)에서 자신의 팀이 ''S. cerevisiae''의 3번 염색체를 합성했다고 발표했다.[57][58] 이 과정은 원래 염색체 내의 유전자를 합성 버전으로 대체하는 방식으로 진행되었으며, 완성된 합성 염색체는 효모 세포에 통합되었다. 이 과정에는 273,871개의 염기쌍 DNA를 설계하고 생성하는 작업이 필요했는데, 이는 원래 염색체의 316,667쌍보다 적은 수치이다. 2017년 3월에는 16개의 염색체 중 6개가 합성되었으며, 나머지 염색체의 합성은 진행 중이다.[59]참조
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