형질주입

3. 방법

형질주입 방법은 크게 물리적 방법, 화학적 방법, 바이러스성 방법으로 나눌 수 있다.^[24]

진핵 세포에 외래 DNA를 도입하는 방법은 다양하다. 물리적 처리(전기천공법, 세포 압착, 나노입자, 자화 감염)에 의존하거나, 화학 물질 또는 생물학적 입자(바이러스)를 운반체로 사용하는 방법이 있다. 세균에서 포유류에 이르기까지 다양한 유형의 세포와 조직에 맞게 개발된 유전자 전달 방법은 매우 다양하며, 일반적으로 물리적, 화학적, 생물학적 방법으로 나눌 수 있다.^[24]

• 물리적 방법: 전기천공법, 미세 주입법, 유전자총, 임파일펙션, 정수압, 지속적인 주입, 초음파 처리 등이 있다.
• 화학적 방법: 리포펙션과 같이 리포솜 벡터를 활용하는 지질 매개 DNA 형질 감염 과정, 중합체 유전자 운반체(폴리플렉스) 사용 등이 있다.^[5]
• 생물학적 형질 감염: 바이러스를 이용하며, 바이러스가 숙주 세포 내부에 DNA를 주입하는 능력을 활용한다. 전달하려는 유전자는 복제 결함이 있는 바이러스 입자에 포장된다. 현재 사용되는 바이러스에는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 단순 포진 바이러스 등이 있다.

3. 1. 물리적 방법

• 전기천공법: 세포에 짧은 전기 펄스를 가하여 세포막에 일시적인 구멍을 형성, 핵산이 세포 내로 유입되도록 한다.^[24]

• 미세주입법: 미세한 바늘을 이용하여 핵산을 세포의 핵 또는 세포질에 직접 주입한다.
• 유전자총(입자총법): 금 또는 텅스텐 입자에 DNA를 코팅하여 고속으로 세포에 발사하여 핵산을 전달한다.
• 소노포레이션: 초음파를 이용하여 세포막에 일시적인 구멍을 형성하여 핵산 전달을 돕는다. 주로 근처 세포막과 상호 작용하는 기포의 공동현상에 기인한다.^[6]
• 광학 형질주입: 레이저를 이용하여 세포막에 미세한 구멍을 생성하여 핵산을 도입한다.^[6]
• 자화 형질주입(마그네토펙션): 자기장을 이용하여 핵산과 결합된 자성 나노입자를 세포 내로 유도한다.^[7]
• 수력학적 전달: 주로 쥐나 생쥐 실험에서 사용되며, 다량의 핵산을 빠르게 혈액에 주입하여 간으로 전달하는 방법이다.^[8]

3. 2. 화학적 방법

• '''인산칼슘'''을 사용하는 방법은 1973년 F. L. 그레이엄과 A. J. 반 데르 에브에 의해 처음 발견되었다.^[12] 인산 이온이 포함된 HEPES 완충 식염수를 형질주입할 DNA를 포함하는 염화칼슘 용액과 혼합하면 DNA가 결합된 침전물이 형성된다. 이 침전물을 세포에 첨가하면 세포가 침전물과 DNA를 흡수한다. 이 방법은 암 유전자를 식별하는데 사용되었다.^[14]
• DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 '''양이온성 고분자'''를 사용하는 방법이 있다. 음전하를 띤 DNA는 다중 양이온에 결합하고, 복합체는 세포내이입을 통해 세포에 흡수된다.
• '''리포펙션''' (또는 리포솜 형질주입)은 리포솜을 사용하여 유전 물질을 세포에 주입하는 기술이다. 세포막과 소포인 리포솜은 모두 인지질 이중층으로 만들어져 쉽게 융합된다.^[15] 리포펙션은 일반적으로 양전하를 띤 지질(양이온성 리포솜)을 사용하여 음전하를 띤 유전 물질과 복합체를 형성한다.^[16]
• '''퓨진(Fugene)'''은 비리포솜성 형질주입 시약으로, 다양한 세포에 높은 효율과 낮은 독성을 보인다.^{[18][19][20][21]}
• '''덴드리머'''는 고도로 분지된 유기 화합물로, DNA와 결합하여 덴드리플렉스를 형성하여 세포 내로 들어간다.^[22][23]

3. 3. 바이러스성 방법 (형질도입)

아데노바이러스 벡터는 다양한 인간 세포에 유전자를 전달할 수 있고, 높은 전달 속도를 가지기 때문에 바이러스 형질감염 방법으로 유용할 수 있다.^[2] 렌티바이러스 벡터 또한 유사분열을 겪지 않는 세포를 형질도입할 수 있기 때문에 유용하다. 하지만 바이러스를 사용하여 유전자를 세포 내로 전달하는 방법에는 단점이 있다. 바이러스가 세포 내로 전달할 수 있는 것은 매우 작은 DNA 조각뿐이며, 많은 수작업이 필요하고 삽입 부위가 무작위적이며, 세포 변성 효과 및 돌연변이를 유발할 위험성 등이 문제이다.

4. 안정 형질주입과 일시적 형질주입

형질주입된 세포는 도입된 핵산의 발현 지속 여부에 따라 안정 형질주입(Stable transfection)과 일시적 형질주입(Transient transfection)으로 구분된다. 안정적으로 형질주입된 세포는 형질주입된 DNA를 지속적으로 발현하고 딸 세포로 전달하는 반면, 일시적으로 형질주입된 세포는 형질주입된 DNA를 짧은 시간 동안 발현하고 딸 세포로 전달하지 않는다.^[24]

형질주입의 일부 응용 분야에서는 형질주입된 유전 물질이 일시적으로만 발현되는 것으로 충분하다. 형질주입 과정에서 도입된 DNA는 일반적으로 핵 게놈에 통합되지 않기 때문에 외부 DNA는 미토시스를 통해 희석되거나 분해된다.^[24] 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 핵 항원 1 (EBNA1) 또는 SV40 large-T 항원을 발현하는 세포주는 바이러스 EBV (293E) 또는 SV40 (293T) 복제 기원을 포함하는 플라스미드의 에피솜 증폭을 허용하여 희석 속도를 크게 줄인다.^[25]

형질주입된 유전자가 실제로 세포와 딸 세포의 게놈에 남아 있기를 원하는 경우, 안정적인 형질주입이 발생해야 한다. 이를 위해 세포에 특정 독소에 대한 저항과 같은 선택 가능한 이점을 제공하는 마커 유전자를 공동 형질주입한다. 형질주입된 세포 중 일부(극소수)는 우연히 외부 유전 물질을 게놈에 통합하게 된다. 그런 다음 독소를 세포 배양액에 첨가하면 마커 유전자가 게놈에 통합된 소수의 세포만 세포 증식을 할 수 있고, 다른 세포는 죽게 된다. 이 선택적 스트레스(선택 압력)를 일정 시간 적용한 후 안정적인 형질주입을 가진 세포만 남아서 추가적으로 배양할 수 있다.^[26]

안정적인 형질주입을 선택하기 위한 일반적인 시약은 다음과 같다.

• G418: 네오마이신 저항 유전자의 생성물에 의해 중화됨
• 퓨로마이신
• 제오신
• 히그로마이신 B
• 블라스티시딘 S

5. RNA 형질주입

RNA 형질주입은 단백질을 코딩하는 mRNA를 도입하여 일시적인 단백질 발현을 유도하거나, siRNA 등을 도입하여 유전자 발현을 조절하는 데 사용된다. RNA는 미세 주입, 전기천공, 지질 매개 형질주입 등 다양한 방법으로 세포에 전달될 수 있다.^[28]

긴 RNA 형질주입의 경우, 약 25nt(뉴클레오타이드)보다 긴 RNA 분자는 선천 면역 반응을 유발하여 번역 차단, 세포 주기 정지 및 세포 사멸을 일으킬 수 있으므로 주의가 필요하다.

짧은 RNA 형질주입은 siRNA를 사용하여 특정 단백질의 발현을 억제하거나 miRNA의 활성을 조절하여 유전자 침묵(Gene silencing)을 유도하는 데 주로 사용된다. 짧은 RNA 형질주입은 세포의 DNA를 수정할 위험이 없어 새로운 종류의 거대 분자 약물로 개발되고 있다.^[31]

siRNA는 RNA 침묵(즉, 표적 유전자에서 RNA 및 단백질 손실)을 달성하기 위해 형질주입될 수도 있다. 이는 연구에서 관심 있는 단백질(예: 엔도텔린-1^[27])의 "유전자 녹다운"을 달성하고 유전자 치료에 적용할 수 있는 주요 응용 분야가 되었다. 침묵 접근 방식의 한계는 세포에 대한 형질주입의 독성과 다른 유전자/단백질 발현에 대한 잠재적인 "표적 외" 효과이다.

참조

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