5-메틸사이토신

1. 개요

5-메틸사이토신은 사이토신에 메틸기가 결합된 유도체로, 1898년 결핵균에서 처음 발견되었다. 세균, 식물, 진균, 동물 등 다양한 생물체에서 발견되며, DNA 메틸화 과정에 관여하여 유전자 발현 조절, DNA 보호 등의 기능을 수행한다. 5-메틸사이토신은 DNA 내에서 사이토신과 유사하게 작용하지만, 탈아미노화 시 티민으로 변환되어 돌연변이를 유발할 수 있다. 또한, 암세포에서 DNA 메틸화 이상과 관련되어 있으며, 암 발생 및 진행에 중요한 역할을 한다. 아황산 수소염 시퀀싱을 통해 DNA 메틸화 패턴 분석에 활용되기도 한다.

2. 발견

1898년, W.G. 루펠은 결핵균에서 독소를 분리하는 과정에서 투베르쿨린산(tuberculinic acid)이라는 새로운 핵산을 분리했는데, 이 핵산은 메틸화된 뉴클레오티드를 일부 포함하고 있었다. 1925년, T.B. 존슨과 R.D. 코힐은 결핵균 핵산의 가수분해 생성물로서 5-메틸사이토신을 극소량 검출하는 데 성공했다. 그러나 이들의 방법은 일반적으로 재현할 수 없었기에 해당 핵산을 분리하는 일반적인 방법으로 인정받지 못했다. 1948년, R.D. 핫키스는 종이 크로마토그래피를 사용하여 송아지의 흉선에서 DNA 핵산을 분리했다. 그로부터 70년 후, 정확한 역할은 불확실하나 다른 RNA 분자에서도 공통적으로 존재한다는 것이 밝혀졌다.

3. 제법

단백질에 널리 분포하는 DNA메틸기전달효소(DNMT)의 PCQ 시스테인 잔기(cysteine residue)가 사이토신의 6번 탄소 결합 부위에 친핵성 공격을 가할 경우 S-아데노실메싸이오닌(S-Adenosylmethionine)이 메틸기를 사이토신 5번 탄소 결합 부위에 기여한다. 그 후 DNMT 효소의 염기가 사이토신 5번 탄소 결합 부위에 붙어있는 양자화된 상태의 수소를 탈양자화하여 5번 결합 부위와 6번 결합 부위 사이에 이중결합을 형성한다. 이렇게 될 경우 S-아데노실메싸이오닌은 떨어져 나가고, 사이토신은 메틸화된다.

사이토신과 요오드화메틸 및 알코올칼리를 함께 가열하면 생성되며, 다른 방법으로는 소맥 배아에서 추출한 천연 데옥시리보핵산을 가수 분해하여 얻어낼 수 있다.

4. 생체 내 기능

5-메틸사이토신의 기능은 종에 따라 크게 다르다. 세균, 식물, 진균 및 동물에서 5-메틸사이토신이 발견되는 위치와 역할은 차이를 보인다.

4.1. 세균

세균에서 5-메틸사이토신은 다양한 위치에서 발견될 수 있으며, 종종 메틸화 특이적인 제한 효소(methylation-sensitive restriction enzyme, MSRE)에 의해 DNA가 절단되는 것을 보호하기 위한 표지자로 사용된다.

4.2. 식물

5-메틸사이토신은 식물에서 CpG, CpHpG, CpHpH 서열에서 발견된다(여기서 H는 아데닌(A), 사이토신(C), 티민(T) 중 하나이다).

4.3. 진균과 동물

진균과 동물에서 5-메틸사이토신은 주로 CpG 디뉴클레오타이드에서 발생한다. 대부분의 진핵생물은 이 부위에서 아주 작은 비율만을 메틸화하지만, 척추동물의 경우는 CpG 사이토신의 70-80%에서 메틸화된다. 5-메틸사이토신은 전체 포유류 DNA에서 1%의 비중을 차지하고 있다.

사이토신이 자발적인 탈아미노화를 거쳐서 우라실(U)이 될 경우 DNA 복구 효소가 이를 제거하지만, 5-메틸사이토신의 탈아미노화는 티민(T)을 형성한다. 5-메틸사이토신은 DNA 내에서 사이토신으로 작용하나 위와 같은 반응이 있을 경우 5-메틸사이토신은 티민으로 작용할 수 있기에 DNA 염기에서 전이 돌연변이를 야기할 수 있다. 또한, 사이토신의 활성 효소적 탈아미노화와 사이토신 탈아미노제의 APOBEC 패밀리 집단에 의한 5-메틸사이토신은 다양한 세포 과정 및 유기체 진화에 유리한 영향을 미칠 수 있다.

5. 생체 외 기능

5-메틸사이토신은 중아황산염 처리(bisulfite treatment)를 할 경우 탈아미노화에 대한 저항성을 가진다. 이러한 특성을 이용하여 DNA 내 사이토신의 메틸화 패턴을 분석하는 재료로 사용할 수 있다. 5-메틸사이토신에서 NH₂기는 아질산과 같은 시약을 사용하여 제거(탈아미노화)되어 티민을 형성할 수 있다. 사이토신은 유사한 조건에서 탈아미노화되어 우라실(U)이 된다.

5-메틸사이토신은 사이토신 잔기를 탈아미노화하는 아황산 수소염 처리에 저항성이 있다. 이러한 특성은 종종 아황산 수소염 시퀀싱을 사용하여 DNA 사이토신 메틸화 패턴을 분석하는 데 활용된다.

6. 탈메틸화

사이토신이 5mC로 메틸화된 후, 여러 메커니즘을 통해 원래 상태로 되돌릴 수 있다. 수동적 DNA 탈메틸화는 DNMT에 의한 유지 부족으로 복제를 통해 표지를 점진적으로 제거한다. 능동적 DNA 탈메틸화 과정에서 일련의 산화 반응을 통해 5-하이드록시메틸사이토신(5hmC), 5-폼일사이토신(5fC), 5-카복실사이토신(5caC)으로 변환되며, 후자 두 가지는 결국 티민 DNA 글리코실라제(TDG)에 의해 잘려나가고, 염기 절제 복구(BER)를 통해 사이토신을 복원한다. TDG 녹아웃은 5hmC 수준에 통계적으로 유의미한 변화 없이 5fC가 2배 증가하는 결과를 낳았으며, 이는 5mC가 완전한 탈메틸화 전에 적어도 두 번 반복적으로 산화되어야 함을 나타낸다.

산화는 TET(Ten-eleven translocation) 계열 다이옥시게나제를 통해 발생하며, 이 효소는 5mC, 5hmC, 5fC를 산화된 형태로 변환할 수 있다. 그러나 이 효소는 5mC에 대한 선호도가 가장 높으며, TET2를 이용한 5hmC 및 5fC 변환의 초기 반응 속도는 4.9~7.6배 느리다. TET는 보조 인자로 Fe(II), 기질로 산소 및 α-케토글루타르산(α-KG)을 필요로 하며, 후자의 기질은 효소 이소시트르산 탈수소효소(IDH)에 의해 이소시트르산으로부터 생성된다. 그러나 암은 2-하이드록시글루타르산(2HG)을 생성하여 α-KG와 경쟁하고, TET 활성을 감소시키며, 결과적으로 5mC를 5hmC로의 변환을 감소시킬 수 있다.

7. 인간에서의 역할

5-메틸사이토신(5mC)은 생물 종에 따라 그 기능이 크게 다르다.

* 세균에서 5mC는 게놈의 다양한 위치에 존재하며, 종종 자신의 DNA를 메틸화에 민감한 제한 효소로부터 보호하는 마커로 기능한다.
* 식물에서 5mC는 CpG 사이트, CpHpG, CpHpH 서열에 국한된다(H = A, C, T).
* 균류 및 동물에서 5mC는 주로 CpG 디뉴클레오타이드 형태로 존재한다. 많은 진핵생물에서 CpG 사이트의 메틸화율은 낮지만, 척추동물의 경우 CpG 중 시토신의 70~80%가 메틸화되어 있다. 포유류의 경우 게놈 내 염기의 약 1%가 5mC이다.

시토신(C)이 자발적으로 탈아미노화되면 우라실(U)이 되고, DNA 복구 효소에 의해 제거된다. 반면 5mC가 탈아미노화되면 티민(T)이 생성된다. 이러한 염기 전환(C→T)은 염기 전이형 돌연변이를 일으킬 수 있다. 또한, APOBEC 패밀리 효소에 의한 시토신 및 5mC의 탈아미노화는 세포 내 과정이나 생물 종의 진화에 관여할 가능성이 있다. 한편, 5-히드록시메틸사이토신의 탈아미노화 의의 및 상세는 불분명하다.

5mC의 메틸기는 DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT)를 통해 게놈 DNA 내 시토신에 부착된다. 인간 게놈 내에는 DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L의 5가지 DNMT가 알려져 있다. 조류 및 균류에는 DNMT4, DNMT5, DNMT6의 3가지가 더 존재한다.

DNMT1에는 RFTS(replication foci targeting sequence)와 5mC 마크 추가를 촉매하는 CXXC 도메인이 포함되어 있다. RFTS는 DNMT1을 DNA 복제 위치로 이끌어 DNA 복제 중 딸 가닥 상의 5mC 유지를 돕는다. CXXC는 DNA에 메틸화를 de novo로 추가하기 위한 징크 핑거 도메인을 포함한다. 많은 인간 체조직에서 DNMT1이 지배적인 DNA 메틸트랜스퍼라제인 것으로 알려져 있다. DNMT3A와 DNMT3B는 주로 de novo 메틸화를 담당하며, DNMT1은 복제 후 5mC 마크를 유지하는 역할을 한다. DNMT는 서로 상호 작용하여 메틸화 능력을 높인다. 예를 들어, 2개의 DNMT3L은 2개의 DNMT3A와 복합체를 형성하여 DNA와의 상호 작용을 개선하고 메틸화를 촉진한다. DNMT 발현 변화는 비정상적인 메틸화를 야기한다. 과도한 발현은 메틸화 증가를 가져오고, 반대로 효소를 파괴하면 메틸화 수준이 저하된다.

메틸기 추가 메커니즘은 다음과 같다.

# DNMT의 PCQ 모티프 시스테인 잔기가 메틸화되는 시토신 뉴클레오타이드의 탄소 6에 친핵성 공격을 일으킨다.
# S-아데노실메티오닌은 메틸기를 탄소 5에 제공한다.
# DNMT 효소의 염기는 5번 탄소의 잔류 수소를 탈프로톤화하여 5번과 6번 탄소 사이의 이중 결합을 복원하여 5-메틸사이토신 염기쌍을 생성한다.

시토신이 5mC로 메틸화된 후, 여러 메커니즘을 통해 원래 상태로 되돌릴 수 있다. 수동적 DNA 탈메틸화는 DNMT에 의한 유지를 억제하여, 게놈 복제를 통해 서서히 메틸화된 시토신을 희석시키는 것이다. 능동적 DNA 탈메틸화는 산화 과정을 통해 5-히드록시메틸사이토신(5hmC), 5-포르밀사이토신(5fC), 5-카르복실사이토신(5caC)으로 변환되고, 후자 2개는 최종적으로 티민 DNA 글리코실라제(TDG) 및 시토신 복원을 위한 염기 제거 복구 효소(BER)에 의해 뉴클레오시드에서 절단된다. TDG를 녹아웃한 실험에서 5hmC에는 통계적으로 유의미한 변화가 없었지만, 5fC는 2배 증가했다.

5mC, 5hmC, 5fC로의 산화 반응은 TET(Ten-eleven translocation) 패밀리 디옥시게나제를 통해 발생한다. 이 효소는 5mC를 우선적으로 처리하며, TET2에서 5hmC 및 5fC 변환의 초기 반응 속도는 4.9~7.6배 느려진다. TET에는 보조 인자로서 Fe(II), 기질로서 산소 및 α-케토글루타르산(α-KG)이 필요하며, 후자의 기질은 이소구연산 탈수소효소(IDH)에 의해 이소구연산으로부터 생성된다. 악성 종양(암세포)에서는 α-KG와 경쟁하는 2-히드록시글루타레이트(2HG)를 생성하여 TET 활성을 저하시킴으로써 5mC에서 5hmC로의 변환을 저하시키는 가능성이 보고되었다.

"후성적 연령"은 연령과 DNA 메틸화 수준 간의 관계를 나타낸다. "clock CpG"라고 불리는 특정 CpG 영역의 DNA 메틸화 수준과 특정 연령대 집단의 게놈 전체 메틸화율을 회귀하는 알고리즘을 결합하여 후성적 연령 예측이 가능하다. 젊은이(0~20세)의 경우 DNA 메틸화의 변화는 발달과 성장이 진행됨에 따라 더 빠른 속도로 발생하며, 노년기에는 변화가 느려지기 시작한다.

후성적 연령의 추정 방법은 여러 가지가 제안되었다. "Horvath 시계"는 여러 조직 유래의 353개의 CpG 세트를 측정한다. 이 세트에서 절반은 연령과 양의 상관관계를 가지며, 나머지 절반은 후성적 연령을 추정하기 위해 음의 상관관계를 가진다. "Hannum 시계"는 성인의 혈액 샘플을 사용하여 71개의 CpG 사이트의 직교 기반으로 연령을 계산한다. DNAm PhenoAge로 알려진 "Levine 시계"는 513개의 CpG 사이트에 의존하며, 사망률과 수명을 예측하는 데 있어 다른 연령 추정 기법보다 높은 점수를 얻었지만, 비혈액 조직에는 편향을 보인다. 또한, ELOVL2 유전자라는 하나의 CpG만의 메틸화 상태를 기반으로 한 연령 추정기가 보고되었다. 연령 추정을 통해 5mC 메틸화 마커를 기반으로 개인이 영향을 받을 수 있는 연령 관련 상태의 예상으로부터 수명을 예측할 수 있다.

7.1. 암

DNA는 암에서 과도하게 메틸화되어 과메틸화되거나, 과소 메틸화되어 저메틸화될 수 있다. 유전자 프로모터와 겹치는 CpG 섬은 de novo 메틸화되어 종양 억제와 관련된 유전자의 비정상적인 불활성화를 초래한다. 종양과 정상 조직을 비교했을 때, 종양은 메틸전이효소 DNMT1, DNMT3A, 그리고 DNMT3B의 수치가 높았으며, 이들은 모두 암에서 5mC의 비정상적인 수준과 관련이 있다.

위성 DNA, Alu 배열, 그리고 긴 산재 반복 서열(LINE)을 포함한 게놈의 반복 서열은 암에서 종종 저메틸화된 것으로 나타나 침묵된 유전자의 발현을 초래하며, 그 수준은 종양 진행의 중요한 지표이다. 과메틸화와 저메틸화 사이에는 연관성이 있다는 가설이 제기되었다. DNA 메틸전이효소의 과도한 활성으로 비정상적인 de novo 5mC 메틸화가 생성되면 메틸화 제거로 보상될 수 있다. 그러나 메틸화 제거는 비효율적이어서 게놈 전체의 저메틸화를 초과하게 된다. 반대의 경우도 가능하다. 저메틸화의 과발현은 게놈 전체의 과메틸화에 의해 침묵될 수 있다.

암의 특징적인 능력은 암세포와 종양 미세 환경 내의 주변 종양 연관 기질 모두에서 5mC를 변경하는 후성 유전적 변화를 통해 획득될 가능성이 높다. 항암제 시스플라틴은 5mC와 반응하는 것으로 보고되었다.