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계대배양

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목차

1. 개요

계대배양은 미생물이나 동물 세포를 배지나 다른 환경으로 옮겨 배양하는 기술을 의미한다. 미생물의 경우, 배지나 동결 건조된 표본을 새로운 배지로 옮겨 배양하며, 동물 세포는 밀도의존성 때문에 계대배양을 통해 적절한 환경을 유지하고 세포 수를 조절한다. 계대배양은 세포의 지속적인 성장을 가능하게 하며, 세포의 성장 곡선 계산이나 실험을 위한 대수기 미생물 획득 등에 활용된다. 계대배양 방법은 세포의 종류에 따라 다르며, 부유성 세포는 배양액을 희석하고, 부착성 세포는 표면에서 분리하여 새로운 배지에 옮기는 방식으로 진행된다. 계대배양 횟수는 세포의 특성 변화를 추적하는 데 중요한 지표가 된다.

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계대배양
계대 배양
학문 분야세포 배양
다른 이름세포 계대, 세포 계대 배양, 계대 세포 배양
목적세포의 생존 및 증식 유지
관련세포주
배양 배지
세포 분열
세포 노화
형질전환
상세 정보
정의세포를 새로운 배양 배지로 옮기는 과정
필요성영양분 고갈 방지
독성 물질 축적 방지
세포 분열 공간 확보
과정세포 분리 (효소 또는 물리적 방법)
세포 희석
새로운 배양 용기에 접종
방법부착 세포: 트립신 처리 등
현탁 세포: 직접 희석
중요 요소무균 기술
적절한 세포 밀도 유지
배양 배지 조건 최적화
영향세포 표현형 변화
유전적 변이 축적
세포 노화 촉진
응용
연구세포 생물학 연구
약물 개발
독성학 연구
산업생물 의약품 생산
백신 생산
세포 치료

2. 미생물 계대배양

미생물의 계대배양은 배지나 동결 건조된 표본을 다시 살려 다른 배지로 옮기는 과정으로, 도말 평판법, 도말 주입법(고체배지), 투여(액체배지) 등의 방법이 사용된다. 일정 시간이 지나면 배지가 미생물로 가득 차는 것을 관찰할 수 있다.[1]

세포주와 미생물은 독성을 띨 수 있는 대사 산물의 점진적인 증가, 배양 배지에 존재하는 영양분 고갈, 증식으로 인한 세포 수 또는 개체 수 증가로 인해 무기한으로 배양될 수 없다. 영양분이 고갈되고 유해 부산물의 수치가 증가하면, 배양 중인 미생물은 증식이 크게 감소하거나 중단되는 정지기에 진입한다. 이때 미생물을 신선한 배지로 옮기면 영양분이 미생물의 성장을 유발하여 새로운 환경에 대한 느린 성장과 적응 기간인 '''지연기'''를 거치고, 이어서 세포가 기하급수적으로 성장하는 '''대수기'''를 거치게 된다.[1]

계대배양은 세포가 사멸할 위험 없이 세포의 지속적인 성장을 가능하게 하며, 증식하는 세포(''대장균'' 등)와 증식하지 않는 세포(예: 말단 분화된 백혈구) 모두에 중요하다. 또한 성장 곡선 계산(예: 세대 시간)[2]과 실험을 위한 대수기 미생물 획득(예: 세균 형질전환)[3]에도 사용될 수 있다.

일반적으로 계대배양은 특정 부피의 배양액에서 동일한 부피의 신선한 성장 배지로 진행되며, 이는 세포주의 장기적인 유지를 가능하게 한다. 더 큰 부피의 성장 배지로의 계대배양은 산업 공정이나 과학 실험에 사용할 세포 수를 늘리려는 경우에 사용된다.

2. 1. 미생물 계대배양 후 관찰점

미생물의 경우 배지를 관찰하면서 콜로니(군집)의 생성 정도와 크기 여부 등을 관찰하여 육안으로 보기에 밀도가 높아졌으면 다시 계대배양을 진행한다.

3. 동물세포 계대배양

동물세포는 밀도의존성 때문에 배지 내에서 일정 밀도 이상으로 자라지 않는다. 따라서 계대배양을 통해 밀도를 적절하게 유지하고 세포의 총량을 증가시킨다.[4]

3. 1. 동물세포 계대배양의 이유

동물세포는 밀도의존성에 의해 배지 내에서 일정 밀도 이상을 차지하게 되는 경우 자라지 않는다. 따라서 계대배양을 통해 밀도를 유지시켜 살기에 쾌적한 환경을 제공하고, 넘치는 세포를 다른 배지로 이동시킴으로써 총량을 증가시킬 수 있다. 만일 계대배양을 하지 않을 경우 부족한 영양분으로 인해 서서히 죽어가는데, 특히 암세포는 밀도의존성, 부피의존성 등이 존재하지 않기에 무제한으로 늘어나고, 계대배양을 하지 않으면 세포가 더 빨리 죽어간다.

3. 2. 동물세포 계대배양 방법

부착성 세포는 세포 배양 플라스크나 페트리 접시 바닥과 같은 표면에 부착되어 성장하는 세포로, 많은 포유류 세포주가 이에 해당한다. 이러한 세포는 계대배양 전에 표면에서 분리해야 한다. 부착 세포의 밀도는 컨플루언시로 측정하는데, 이는 세포가 덮는 성장 표면의 비율을 의미한다. HeLa 세포와 같은 포유류 세포주는 10%에서 100% 사이의 컨플루언시를 선호하며, 계대배양은 세포를 이 범위 내에서 유지하는 것을 목표로 한다.

계대배양을 위해 세포를 분리하는 방법에는 트립신 처리, EDTA를 이용한 칼슘 이온 킬레이트화, 기계적 방법 등이 있다. 분리된 세포는 신선한 성장 배지에 재현탁하여 성장 표면에 다시 부착시킨다.

3. 2. 1. 준비물


  • 새로운 배지(동물세포의 종류에 따라 다름)
  • 항생제(오염 방지용. 주로 암피실린 또는 페니실린을 희석해서 사용)
  • FBS(Fetal bovine serum, 소 태아 혈청, 혈청)
  • Trypsin-EDTA (Trypsin과 EDTA를 따로 사용하기도 한다.)
  • Phosphate Buffered Saline(PBS)
  • Dimethyl sulfoxide(DMSO)
  • T플라스크[4](뚜껑에 공기가 통할 수 있게 된 구조가 있어야 함)

3. 2. 2. 주의사항

이하 과정은 부착성 세포 기준이며, 세포의 특성에 따라 내용이 달라질 수 있다. 부착 세포는, 예를 들어 많은 포유류 세포주와 같이 세포 배양 플라스크나 페트리 접시의 바닥과 같은 표면에 부착되어 성장한다. 이러한 세포 유형은 계대배양을 하기 전에 표면에서 분리되어야 한다. 부착 세포의 경우, 세포 밀도는 일반적으로 세포가 덮는 성장 표면의 비율인 컨플루언시로 측정된다. 세포는 일반적으로 최적의 성장을 위한 알려진 범위의 컨플루언시를 가지며, 예를 들어 HeLa와 같은 포유류 세포주는 일반적으로 10%에서 100% 사이의 컨플루언시를 선호하며, 계대배양은 일반적으로 세포를 이 범위 내에서 유지하려고 한다. 계대배양을 위해, 세포는 표면 부착에 관여하는 단백질을 분해하는 트립신 처리, 일부 단백질 부착 메커니즘을 방해하는 EDTA로 칼슘 이온을 킬레이트화, 또는 반복적인 세척이나 세포 스크레이퍼 사용과 같은 기계적 방법을 포함한 여러 방법 중 하나로 분리될 수 있다. 분리된 세포는 신선한 성장 배지에 재현탁되어 성장 표면에 다시 부착되도록 한다.

3. 2. 3. 과정 (부착성 세포)

부착 세포는, 예를 들어 많은 포유류 세포주와 같이 세포 배양 플라스크나 페트리 접시의 바닥과 같은 표면에 부착되어 성장한다. 이러한 세포 유형은 계대배양을 하기 전에 표면에서 분리되어야 한다. 부착 세포의 경우, 세포 밀도는 일반적으로 세포가 덮는 성장 표면의 비율인 컨플루언시로 측정된다. 세포는 일반적으로 최적의 성장을 위한 알려진 범위의 컨플루언시를 가지며, 예를 들어 HeLa와 같은 포유류 세포주는 일반적으로 10%에서 100% 사이의 컨플루언시를 선호하며, 계대배양은 일반적으로 세포를 이 범위 내에서 유지하려고 한다.[1]

계대배양을 위해, 세포는 다음 여러 방법 중 하나로 분리될 수 있다.[1]

  • 표면 부착에 관여하는 단백질을 분해하는 트립신 처리
  • 일부 단백질 부착 메커니즘을 방해하는 EDTA로 칼슘 이온을 킬레이트화
  • 반복적인 세척이나 세포 스크레이퍼 사용과 같은 기계적 방법


분리된 세포는 신선한 성장 배지에 재현탁되어 성장 표면에 다시 부착되도록 한다.[1]

3. 2. 4. 투여 비율 (부착성 세포)

과정 순서에서 투약되는 시약의 비율은 T 플라스크에 담겨 있던 양을 1로 한 기준으로 다음과 같이 계산된다.

  • 1/3
  • 1/10
  • 1/5
  • 1/3
  • (배지 1): (혈청 1/10): (항생제 1/100)


부착 세포 배양에서 부착 세포는, 예를 들어 많은 포유류 세포주와 같이 세포 배양 플라스크나 페트리 접시의 바닥과 같은 표면에 부착되어 성장한다. 이러한 세포 유형은 계대배양을 하기 전에 표면에서 분리되어야 한다. 부착 세포의 경우, 세포 밀도는 일반적으로 세포가 덮는 성장 표면의 비율인 컨플루언시로 측정된다. 세포는 일반적으로 최적의 성장을 위한 알려진 범위의 컨플루언시를 가지며, 예를 들어 HeLa와 같은 포유류 세포주는 일반적으로 10%에서 100% 사이의 컨플루언시를 선호하며, 계대배양은 일반적으로 세포를 이 범위 내에서 유지하려고 한다. 계대배양을 위해, 세포는 표면 부착에 관여하는 단백질을 분해하는 트립신 처리, 일부 단백질 부착 메커니즘을 방해하는 EDTA로 칼슘 이온을 킬레이트화, 또는 반복적인 세척이나 세포 스크레이퍼 사용과 같은 기계적 방법을 포함한 여러 방법 중 하나로 분리될 수 있다. 분리된 세포는 신선한 성장 배지에 재현탁되어 성장 표면에 다시 부착되도록 한다.

3. 2. 5. 과정 (부유성 세포)

많은 세포, 특히 미생물은 표면에 부착되지 않고 용액 내에서 성장한다. 이러한 세포는 모세포 배양액의 일부를 취하여 신선한 배지에 희석하는 방식으로 계대배양할 수 있다. 배양액의 세포 밀도는 큰 진핵 세포의 경우 밀리리터당 세포 수로 측정하거나, 세균과 같이 작은 세포는 600nm 빛에 대한 광학 밀도로 측정한다. 세포는 최적 성장을 위한 선호 밀도 범위를 가지며, 계대배양 시에는 세포를 이 범위 내에서 유지하려고 한다.[1]

3. 3. 동물세포 계대배양 후 관찰점

동물세포의 경우 배지의 색 변화를 관찰한다. 동물세포 배지는 주로 붉은색으로 고정되어 있는데, 이는 페놀 레드라는 지시약이 들어 있기 때문이다.[5] 이 지시약은 초기에는 붉은색이다가 세포 분열 등이 진행되어 세포 호흡의 양이 늘어나면서 발생하는 이산화탄소에 의해 종말점에 다다라서 노란색 계열로 바뀐다. 이때 완전한 노란색으로 변하면 다시 계대배양을 진행할 때가 된 것이다.

4. 계대배양의 역할 및 중요성

계대배양은 세포가 사멸할 위험 없이 지속적으로 성장할 수 있도록, 원래 배양액보다 세포 밀도가 낮고 신선한 영양분과 독성 대사 산물이 없는 새로운 배양액을 생성하는 데 사용된다.[1] 대장균과 같이 증식하는 세포와 말단 분화된 백혈구처럼 증식하지 않는 세포 모두에게 중요하며, 성장 곡선 계산[2]이나 실험을 위한 대수기 미생물 획득[3]에도 사용될 수 있다.

일반적으로 특정 부피의 배양액에서 동일한 부피의 신선한 성장 배지로 계대배양을 진행하여 세포주를 장기간 유지한다. 산업 공정이나 과학 실험에 사용할 세포 수를 늘리기 위해 더 큰 부피의 성장 배지로 계대배양을 하기도 한다.

4. 1. 계대배양의 역할

동물세포는 밀도의존성에 의해 배지 내에서 일정 밀도 이상을 차지하게 되면 자라지 않는다. 따라서 계대배양을 통해 밀도를 유지시켜 쾌적한 환경을 제공하고, 넘치는 세포를 다른 배지로 이동시켜 총량을 증가시킬 수 있다. 만일 계대배양을 하지 않을 경우 영양분 부족으로 인해 서서히 죽어가는데, 특히 암세포는 밀도의존성, 부피의존성 등이 존재하지 않기에 무제한으로 늘어나고, 계대배양을 하지 않으면 세포가 더 빨리 죽는다.

세포주와 미생물은 독성을 띨 수 있는 대사 산물의 점진적인 증가, 배양 배지에 존재하는 영양분의 고갈, 그리고 증식으로 인한 세포 수 또는 개체 수 증가로 인해 무기한으로 배양될 수 없다. 영양분이 고갈되고 유해 부산물의 수치가 증가하면, 배양 중인 미생물은 증식이 크게 감소하거나 중단되는 '''정지기'''에 진입한다(세포 밀도 값이 평평해짐). 이러한 배양액에서 미생물을 신선한 배지로 옮기면 영양분이 미생물의 성장을 유발하여 새로운 환경에 대한 느린 성장과 적응 기간인 '''지연기'''를 거치고, 이어서 세포가 기하급수적으로 성장하는 '''대수기'''를 거치게 된다.[1]

따라서 계대배양은 세포가 사멸할 위험 없이 세포의 지속적인 성장을 가능하게 하는, 유래된 배양액보다 세포 밀도가 낮고 신선한 영양분과 독성 대사 산물이 없는 새로운 배양액을 생성하는 데 사용된다. 계대배양은 증식하는 세포(예: ''대장균'')와 증식하지 않는 세포(예: 말단 분화된 백혈구) 모두에 중요하다. 계대배양은 또한 성장 곡선 계산(예: 세대 시간)[2]과 실험을 위한 대수기 미생물 획득(예: 세균 형질전환)[3]에 사용될 수 있다.

일반적으로 계대배양은 특정 부피의 배양액에서 동일한 부피의 신선한 성장 배지로 진행되며, 이는 세포주의 장기적인 유지를 가능하게 한다. 더 큰 부피의 성장 배지로의 계대배양은 예를 들어 산업 공정이나 과학 실험에 사용할 세포 수를 늘리려는 경우에 사용된다.

4. 2. 계대배양 횟수 (Passage number)

세포가 배양 과정에서 분열한 횟수를 기록하는 것은 종종 중요하며, 이는 계대배양 또는 아계대(subculture) 횟수를 기록함으로써 이루어진다. 식물 조직 세포의 경우, 장기간 배양하면 체세포 변이가 발생할 수 있다. 마찬가지로 포유류 세포주에서도 시간이 지남에 따라 염색체 이상이 증가하는 경향이 있다. 미생물의 경우, 자연 환경과 정확히 일치하지 않는 배양 조건에 적응하려는 경향이 있으며, 이는 미생물의 생물학적 특성을 변화시킬 수 있다.[1]

5. 계대배양 프로토콜

세포 계대배양 프로토콜은 관련된 세포의 특성에 따라 크게 달라진다. 세포는 종류에 따라 부유성 세포와 부착성 세포로 나뉘며, 각각 다른 방식으로 계대배양을 진행한다.[1]

5. 1. 부유성 세포 (Suspension cells)

많은 세포 유형, 특히 많은 미생물은 표면에 부착되지 않고 용액 내에서 성장한다. 이러한 세포 유형은 모세포 배양액의 작은 부피를 취하여 신선한 성장 배지에 희석하는 방식으로 계대배양할 수 있다. 이러한 배양액의 세포 밀도는 일반적으로 큰 진핵 세포의 경우 밀리리터당 세포 수로 측정하거나, 세균과 같은 작은 세포의 경우 600nm 빛에 대한 광학 밀도로 측정한다. 세포는 종종 최적의 성장을 위한 선호하는 밀도 범위를 가지며, 계대 배양 시 일반적으로 세포를 이 범위 내에서 유지하려고 한다.

5. 2. 부착성 세포 (Adherent cells)

부착 세포는, 예를 들어 많은 포유류 세포주와 같이 세포 배양 플라스크나 페트리 접시의 바닥과 같은 표면에 부착되어 성장한다. 이러한 세포 유형은 계대배양을 하기 전에 표면에서 분리되어야 한다. 부착 세포의 경우, 세포 밀도는 일반적으로 세포가 덮는 성장 표면의 비율인 컨플루언시로 측정된다. 세포는 일반적으로 최적의 성장을 위한 알려진 범위의 컨플루언시를 가지며, 예를 들어 HeLa와 같은 포유류 세포주는 일반적으로 10%에서 100% 사이의 컨플루언시를 선호하며, 계대배양은 일반적으로 세포를 이 범위 내에서 유지하려고 한다. 계대배양을 위해, 세포는 표면 부착에 관여하는 단백질을 분해하는 트립신 처리, 일부 단백질 부착 메커니즘을 방해하는 EDTA로 칼슘 이온을 킬레이트화, 또는 반복적인 세척이나 세포 스크레이퍼 사용과 같은 기계적 방법을 포함한 여러 방법 중 하나로 분리될 수 있다. 분리된 세포는 신선한 성장 배지에 재현탁되어 성장 표면에 다시 부착되도록 한다.

참조

[1] 웹사이트 Cell Culture Basics https://www.vanderbi[...] Invitrogen 2019-06-20
[2] 웹사이트 Microbial Growth https://open.oregons[...] General Microbiology 2021-03-15
[3] 웹사이트 Bacterial Culture Techniques http://labprotocols.[...] Cold Spring Harbor Laboratory 2021-03-15
[4] 웹인용 Greiner culture flasks, tissue culture treated https://www.sigmaald[...] 2021-12-20
[5] 웹인용 phenol red https://www.sigmaald[...] 2021-12-20


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