효소결합면역흡착검사
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1. 개요
효소결합면역흡착검사(ELISA)는 액체 시료 내 분석물을 분석하는 생화학적 검사법으로, 1971년 개발되었다. ELISA는 방사성 동위원소 대신 효소를 사용하여 항원-항체 반응을 시각적으로 확인하며, 직접, 간접, 샌드위치, 경쟁 ELISA 등 여러 종류가 있다. 이 기술은 질병 진단, 식품 알레르기 검사, 식품 안전 등 다양한 분야에 활용되며, HIV, 코로나19, 식물 병원체 탐지 등에 사용된다. eSimoa와 같은 기술 개발을 통해 감도가 향상되고 있으며, 다양한 효소 표지자를 사용하여 신호를 측정한다.
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| 효소결합면역흡착검사 | |
|---|---|
| 개요 | |
| 이름 | 효소 결합 면역 흡착 검사 |
| 영어 명칭 | enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) |
| 로마자 표기 | hyoso gyeolhap myeonyeok heupchak geomsa |
| 원리 | |
| 기본 원리 | 항체와 효소를 이용한 항원 검출 |
| 설명 | 효소가 결합된 항체를 사용하여 항원을 검출하는 방법 |
| 분석 방법 | |
| 종류 | 직접 ELISA 간접 ELISA 샌드위치 ELISA 경쟁 ELISA |
| 기질 | TMB |
| 효소 | 서양와사비 과산화효소 |
| 반응 | 서양와사비 과산화효소에 연결된 2차 항체를 사용하여 ELISA 개발 |
| 기타 | |
| 관련 항목 | 웨스턴 블랏 |
2. 역사
방사성 면역 측정법은 1960년 로잘린 서스먼 야로우와 솔로몬 베르손이 발표한 과학 논문에서 처음 기술되었는데,[8] 방사능의 위험성 때문에 더 안전한 대안이 필요했다. 1966년 나카네 카즈호와 피어스는 효소를 이용해 항원-항체 반응을 시각적으로 확인하는 방법을 개발했다.[43][44] 1971년, 네덜란드의 안톤 쉬어스와 바우케 반 위먼, 스웨덴의 페터 펄만과 에바 엥발은 각각 ELISA 기술을 발표했다.[11][12][45] 같은 시기 프랑스의 스트라티스 아브라메아스도 유사한 연구를 진행했다.[48][49] 2012년에는 나노입자를 이용한 초민감 ELISA 검사법이 개발되어 아토그램 단위의 분석물 검출이 가능해졌다.[15] 최근에는 단일 분자 수준에서 효소 반응을 측정하는 eSimoa (효소결합 단일 분자 배열) 기술이 개발되어 ELISA의 감도를 더욱 향상시켰다.[34] 다만, eSimoa 기술 개발과 관련하여 국립 대만 대학교와 하버드 대학교 사이에 논쟁이 있다.[35][36][37]
ELISA는 불균질 검사법으로, 분석 반응 혼합물의 일부 성분을 고정된 고체상에 흡착시켜 분리한다. 액체 시료를 특수한 결합 특성을 가진 고체상(주로 마이크로플레이트)에 첨가한 후, 여러 액체 시약을 순차적으로 첨가, 배양, 세척한다. 효소 반응 생성물에 의한 색 변화 등의 광학적 변화를 분광광도법으로 측정하여 분석물의 양을 정량화한다.[2][3] 효소는 신호 증폭기 역할을 하며, 정확한 정량화를 위해 고정된 비율로 검출 시약에 연결된 효소에 의해 신호가 생성되므로 "효소 결합"이라는 이름이 붙었다.[5]
ELISA는 분석물과 항체의 결합 방식 및 사용 방법에 따라 여러 유형으로 나뉜다.[16][17] 주요 유형은 다음과 같다.[18]
3. 원리
분석물(리간드)은 특정 검출 시약에 특이적으로 결합하며, 리간드 특이적 결합 시약은 고정화된다.[2] 이는 일반적으로 "ELISA 플레이트"라고 알려진 다중 웰 플레이트로 구성된다. 항원-항체 유형 반응의 특이성이 사용되는데, 이는 항원에 특이적으로 항체를 대량으로 시약으로 생산하기 쉽기 때문이다. 분석물 자체가 항체인 경우, 해당 항체의 표적 항원을 결합 시약으로 사용할 수 있다.[7]
4. 종류
종류 설명 직접 ELISA 항원에 효소가 결합된 항체를 직접 사용하는 방식이다. 간접 ELISA 1차 항체에는 효소가 없고, 1차 항체와 결합하는 2차 항체에 효소가 결합되는 방식이다. 샌드위치 ELISA 샘플 항원을 검출하는 데 사용되는 방식이다. 경쟁 ELISA 표지되지 않은 항체를 항원(검체)과 함께 배양하는 것에서 시작하는 방식이다. 간접 유세포 분석법 기반 ELISA 표지되지 않은 항체를 항원(검체)과 함께 배양하여 항체가 항원에 결합하는 방식이다.
4. 1. 직접 ELISA (Direct ELISA)
직접 ELISA는 항원에 효소가 결합된 항체를 직접 사용하는 방법이다.[16][17][18]
직접 ELISA의 단계는 다음과 같다.[19]
효소는 증폭기 역할을 한다. 효소 결합 항체가 소수만 남아 있어도 효소 분자는 많은 신호 분자를 생성한다.
직접 ELISA의 주요 단점은 항원 고정화 방법이 특이적이지 않다는 것이다. 혈청을 검사 항원의 원료로 사용할 경우, 샘플의 모든 단백질이 마이크로플레이트 웰에 부착될 수 있으므로, 혈청 내의 낮은 농도의 분석물은 웰 표면에 결합할 때 다른 혈청 단백질과 경쟁해야 한다.
일반적으로 단백질을 정량할 때 검량선을 작성하여 거기에서 정량하는 방법이 일반적이다.[38]
4. 2. 간접 ELISA (Indirect ELISA)
항원과 결합하는 1차 항체에는 효소가 없고, 그 항체와 결합하는 2차 항체에 효소가 결합되는 방법이다.[16][17][18] 1차 항체가 항원과 결합한 후, 표지된 2차 항체가 1차 항체에 결합하여 항원을 검출한다.
직접 ELISA와 간접 ELISA는 실험 맥락에 따라 의미가 달라질 수 있다. 항원 존재를 분석할 때, 직접 ELISA는 표지된 1차 항체만 사용하는 방식이고, 간접 ELISA는 1차 항체가 항원과 결합하고, 그 후 표지된 2차 항체가 결합하여 검출하는 방식이다.
4. 3. 샌드위치 ELISA (Sandwich ELISA)
샌드위치 ELISA는 샘플 항원을 검출하는 데 사용되는 방법이다.[20]
과정1. 알려진 양의 포획 항체(캡처 항체)를 준비하여 표면에 결합시킨다.
2. 표면의 결합하지 않은 다른 부위는 차단한다.
3. 항원을 포함한 샘플을 플레이트에 넣으면 항체가 항원을 포획한다.
4. 결합하지 않은 항원을 제거하기 위해 플레이트를 세척한다.
5. 특정 항체를 추가하여 항원과 결합시킨다. (이로써 항원은 두 항체 사이에 끼어 '샌드위치' 형태가 된다.)
6. 효소 결합 2차 항체를 검출 항체로 사용하여 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합시킨다.
7. 결합하지 않은 항체-효소 접합체를 제거하기 위해 플레이트를 세척한다.
8. 효소에 의해 색, 형광 또는 전기화학적 신호로 변환되는 화학 물질을 첨가한다.
9. 플레이트 웰의 흡광도, 형광 또는 전기화학적 신호(예: 전류)를 측정하여 항원의 존재 및 양을 파악한다.
오른쪽 그림은 효소에 결합된 2차 항체를 사용하지만, 1차 항체가 효소에 결합된 경우(직접 ELISA)에는 반드시 필요한 것은 아니다. 그러나 2차 항체 접합체를 사용하면 검출하려는 모든 항원에 대해 효소 결합 항체를 만드는 비용이 많이 드는 과정을 피할 수 있다. 다른 항체의 Fc 영역에 결합하는 효소 결합 항체를 사용하면 다양한 상황에서 동일한 효소 결합 항체를 사용할 수 있다.
캡처 항체가 없으면 샘플의 모든 단백질(혈청 단백질 포함)이 플레이트 표면에 흡착되어 고정된 항원의 양을 줄일 수 있다. 정제된 특정 항체를 사용하여 항원을 플라스틱에 부착하면 복잡한 혼합물에서 항원을 정제할 필요가 없어 분석을 단순화하고 분석의 특이성과 민감도를 높일 수 있다. 따라서 샌드위치 ELISA는 위양성 결과를 줄이기 위해 검증이 필요한 경우가 많다.[21]
단백질 정량 과정1. 목적 단백질(항원)에 대한 항체(포획 항체)를 고체 상태의 표면에 흡착시킨다.
2. 스킴 밀크 등으로 고체 표면을 블로킹한다.
3. 고체 표면에 시료 용액 및 포획 항체와는 다른 에피토프를 인식하는 1차 항체를 첨가한다. (고체 표면 - 포획 항체 - 항원 - 1차 항체 복합체 형성)
4. 반응하지 않은 항원 및 1차 항체를 세척한다.
5. 1차 항체에 효소가 표지되지 않은 경우, 효소 표지된 2차 항체를 작용시킨 후 여분의 2차 항체를 세척한다.
6. 효소의 기질(주로 발색 또는 발광 시약)을 첨가하여 효소 반응의 생성물을 검출한다.
이 방법을 수행하려면 동일 단백질을 서로 다른 에피토프로 인식하는 항체가 필요하다. 또한 항체의 입체 장애를 고려할 때, 가까운 위치가 아닌 멀리 떨어진 위치(아미노산 서열이 아닌 입체 구조상 멀리 떨어진 위치)를 인식하는 것이 좋다.
장점: 동일 단백질을 포획 항체와 1차 항체의 두 종류 항체를 사용하여 검출하므로 특이성이 매우 높다.
단점: 고체 표면에 흡착시키는 포획 항체의 양이 적으면, 시료 속 항원은 포획 항체 이상의 양이 결합할 수 없어 정량성이 나빠질 수 있다.
4. 4. 경쟁 ELISA (Competitive ELISA)
경쟁 ELISA는 표지되지 않은 항체를 항원(검체)과 함께 배양하는 것에서 시작한다. 이렇게 결합된 항체/항원 복합체를 항원으로 코팅된 웰에 넣는다. 플레이트를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하는데, 검체에 항원이 많을수록 항원-항체(Ag-Ab) 복합체가 더 많이 형성되어 웰의 항원에 결합할 수 있는 결합되지 않은 항체가 적어진다. 이후 이차 항체를 첨가하는데, 이 이차 항체는 일차 항체에 특이적이며 효소와 결합되어 있다. 기질을 첨가하면 남아있는 효소가 발색 또는 형광 신호를 유도하며, 신호의 포화를 막기 위해 반응을 중지시킨다.[18]
일부 경쟁 ELISA 키트에는 효소 결합 항체 대신 효소 결합 항원이 포함되어 있다. 표지된 항원은 검체 항원(비표지)과 일차 항체 결합 부위를 놓고 경쟁한다. 검체에 항원이 적을수록 표지된 항원이 웰에 더 많이 유지되어 신호가 강해진다.[18]
HIV 항체 검출의 경우, 마이크로티터 플레이트의 웰은 HIV 항원으로 코팅된다. 효소와 결합된 항체와 혈청에 존재하는 항체(혈청이 해당 항체에 양성인 경우)가 사용되어 경쟁 반응을 통해 신호를 확인한다. 검사할 혈청을 웰에 넣고 37°C에서 배양 후 세척한다. 항체가 존재하면 항원-항체 반응이 일어나고, 효소 표지된 특정 HIV 항체에 남은 항원이 없게 된다. 이 항체들은 첨가 시 자유롭게 남아있다가 세척 과정에서 씻겨 나간다. 기질을 첨가하지만, 효소가 없어 양성 결과는 색 변화를 보이지 않는다.[18]
이 방법은 항원에 대해 한 종류의 항체로 고감도 검출이 가능하지만, 교차 반응에 의해 특이성이 충분하지 않을 수 있다.[38][42]
4. 5. 간접 유세포 분석법 기반 ELISA (Indirect ELISA, 유세포 분석법 활용)
표지되지 않은 항체를 항원(검체)과 함께 배양한다. 항체가 항원에 결합할 수 있도록 충분한 배양 기간을 제공한다.[22][23] 그런 다음 검체를 스캐빈저 용기에 통과시키는데, 이 용기는 시험관이나 특별히 설계된 유량 채널일 수 있다. 스캐빈저 용기나 채널의 표면에는 "스캐빈저 항원"이 결합되어 있다. 이 항원은 1차 항원과 동일하거나 1차 항체와 결합할 수 있을 정도로 충분히 유사하다. 스캐빈저 용기는 도입된 모든 과잉 항체에 결합할 수 있도록 충분한 표면적과 시간을 가져야 한다.[22][23]
이제 표지되고 결합된 항체를 포함하는 검체를 검출기를 통과시킨다. 이 장치는 유세포 분석기 또는 표지를 비추고 응답을 기록하는 다른 장치가 될 수 있다.[24]
이 검사를 통해 여러 항원을 동시에 표지하고 계수할 수 있다. 이를 통해 두 개(또는 그 이상)의 서로 다른 색상 표지를 사용하여 특정 세균 균주를 식별할 수 있다. 두 개의 표지가 모두 세포에 존재하면 해당 세포는 특정 균주이고, 하나만 존재하면 그렇지 않다.
이 검사는 일반적으로 한 번에 한 개의 검사로 수행되며 마이크로타이터 플레이트로는 수행할 수 없다. 필요한 장비는 일반적으로 덜 복잡하며 현장에서 사용할 수 있다.[22][23]
5. 응용
ELISA는 검체 내 항원이나 항체의 존재 여부를 평가할 수 있어, 혈장 내 항체 농도를 측정하거나 잠재적인 식품 알레르기를 감지하는 등 다양한 분야에서 활용된다. 독성학에서는 특정 종류의 약물에 대한 신속한 추정 검사로도 사용될 수 있다.[28][29]
ELISA는 높은 민감도로 인해 HIV에 널리 사용된 최초의 선별 검사였다. ELISA 검사 결과는 숫자로 보고되며, 양성과 음성 결과 사이의 "컷오프" 지점을 결정하는 것은 이 검사에서 가장 논란이 많은 측면이다. 컷오프 지점은 알려진 표준과 비교하여 결정될 수 있다.
뎅기열, 말라리아 등 다양한 질병을 감지하기 위한 ELISA 검사가 있으며, 의학 실험실에서 체외 진단을 위해서도 광범위하게 사용된다. 2023년 현재 전 세계적으로 식물 병원체를 탐지하는 주요 방법이기도 하다.[33]
5. 1. 질병 진단
ELISA는 HIV 검사[26], 웨스트 나일 바이러스 같이 혈장 내 항체 농도를 측정하는 데 유용하게 사용된다. 또한 뎅기열, 말라리아, 샤가스병[30], 요네병[31] 등 다양한 질병을 진단하는 데 사용되는 검사법이다.[31] 식품 산업에서는 우유, 땅콩, 호두, 아몬드, 달걀과 같은 잠재적인 식품 알레르기를 감지하는 데 사용되며,[27] 소아 지방변증에 대한 혈청 검사로도 사용된다.[28][29]
테헤란 대학교 생명공학 및 세포 분자 연구 센터에서는 결핵을 쉽게 진단할 수 있는 새로운 간접 엘라이사 방법을 개발하기도 하였다.
최근에는 혈액 샘플에서 SARS-CoV-2 항체를 검출하여[32] 코로나19 감염 여부를 확인하는 데에도 ELISA가 사용되고 있다.
5. 2. 식품 안전
ELISA는 식품 산업에서 우유, 땅콩, 호두, 아몬드, 달걀과 같은 잠재적인 식품 알레르기 유발 물질을 검출하는 데 사용된다.[27] 또한, 식품 내 독성 물질 검사에도 활용된다.한국에서는 ELISA를 이용한 식품 알레르기 반응 검사 방법이 사용된다. 이 방법은 혈액 채취만으로 알레르기 유발 물질을 확인할 수 있어 간편하다. 이전에는 여러 알레르기 항원을 주사하여 염증반응 여부로 확인했지만, 이 방법은 한 번에 대량의 항원에 노출되어 불편함이 컸다.
5. 3. 기타
독성학에서 특정 약물에 대한 신속한 검사에 사용된다. 의학 실험실에서 체외 진단에 광범위하게 사용되며, 식물 병원체 탐지에도 널리 사용되는 방법이다.[33] 효소결합 단일 분자 배열(eSimoa) 기술은 임상 진단, 신약 개발 등 다양한 분야에서 ELISA의 활용 범위를 넓히고 있다.[34]6. 일반적으로 사용되는 효소 표지자
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タンパク質は表面[[電荷]]や[[疎水相互作用]]によりこれらの表面に非特異的に吸着する。一般に、タンパク質を固相に吸着させる場合は、タンパク質の[[等電点]]よりも[[アルカリ]]側の方が良いとされる。
[39]
문서
ブロッキングは、酵素抗体反応および酵素反応に無関係なタンパク質で固相表面を覆い、後のステップで作用させるタンパク質が固相表面に吸着されるのを防ぐ目的で行われる。
[40]
문서
二次抗体を用いるメリットとして以下の点が考えられる。二次抗体（通常[[ポリクローナル抗体]]を用いる）は一次抗体に複数箇所で結合するため、一つの一次抗体に対して複数の二次抗体、すなわち複数の酵素で標識することができる。したがって、二次抗体を使用することで増感効果を得ることができる。また、一次抗体に酵素を標識すると、定量したいタンパク質に対する抗体ごとに酵素標識を施さなくてはならないが、二次抗体を用いることで一次抗体に酵素を標識する必要がなく、複数のタンパク質の検出に対して、用意する酵素標識抗体が一種類でよいため経済的である。
[41]
문서
一般的に、抗体に結合させる酵素には西洋ワサビ[[ペルオキシダーゼ]]（HRP、HorseRadish Peroxydase）あるいは[[アルカリホスファターゼ]]（ALP、 Alkaline Phosphatase）が用いられる。
[42]
문서
加えられた抗体は、固相に吸着している抗原および試料中の抗原に等しく反応を起こし、その反応は定量的に起こる。したがって、固相に結合する一次抗体量は試料中の抗原濃度に依存し、試料中の抗原が多ければ多いほど、結合する一次抗体量は少なくなる。
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