겨자무 과산화효소
1. 개요
겨자무 과산화효소(HRP)는 X-선 결정학을 통해 구조가 밝혀진 당단백질로, 레독스 보조 인자인 헴을 결합하며, 다양한 기질과의 상호 작용에 따른 구조 변화가 연구되었다. 분자량은 약 44,000이며, 과산화수소를 산화제로 사용하여 기질의 존재를 시각화하는 데 활용된다. HRP는 항체 접합, ELISA, 면역조직화학 등에서 널리 사용되며, 신경 세포 표지, 강화된 화학 발광(ECL), 중합 반응 촉매 등 다양한 응용 분야에서 활용된다. 또한 HRP를 모방하는 인공 효소 연구도 활발히 진행되고 있다.
| 명칭 | 호스래디쉬 퍼옥시데이스 |
|---|---|
| 기타 명칭 | 서양고추냉이 과산화 효소 HRP |
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| 설명 | EC 번호 1.11.1.7 유니프롯 P00433 |
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| 유래 | Armoracia rusticana (겨자무) |
|---|---|
| 종류 | 당단백질 |
| 분자량 | 약 44 kDa |
| 활성 부위 | 헴 |
| 기능 | 다양한 기질의 산화 (주로 과산화수소 이용) |
| 생화학 | ELISA 웨스턴 블로팅 면역조직화학 |
|---|---|
| 기타 | 생체 분자 표지 |
2. 구조
겨자무 과산화효소의 구조는 1997년 X선 결정학을 통해 처음으로 밝혀졌으며, 이후 다양한 기질과의 상호 작용에 따른 구조 변화가 여러 차례 규명되었다. 이 효소는 거대한 알파 나선 구조를 가진 당단백질이며, 산화 환원 (레독스) 보조 인자로서 헴을 결합하고 있다.
3. 화학적 성질
분자량은 약 44,000이며, 1분자당 1개의 작용기 프로토헤민을 포함한다. 이 효소의 흡수 스펙트럼은 640, 500, 402nm에서 흡수 극대를 나타낸다. H2O2나 CH3OOH을 첨가하면 흡수 스펙트럼이 변하는데, 이는 과산화수소가 효소의 프로토헤마틴에 있는 철 이온(Fe3+)과 결합하여 효소-기질 결합물을 형성하기 때문이다.
형성된 결합물 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ의 γ대 흡수 극대는 각각 410, 418, 416nm(pH 7.0)이다. 1997년 X선 결정 구조 분석을 통해 처음으로 입체 구조가 밝혀졌으며, 이후 다양한 기질과의 상호작용에 따른 구조 변화도 연구되었다. 이 효소는 거대한 알파 나선 구조를 가진 당단백질이며, 보조 인자로 헴철을 가지고 있다.
일본에서는 무나 순무에서 유사한 효소를 추출하여 결정화했지만, 이는 겨자무에서 얻은 효소와는 성질이 조금 다르다. 세포 내에 들어가거나 주입된 후, 디아미노벤지딘(3,3′-diaminobenzidine)과 같은 기질과 반응시키면 광학 현미경이나 전자현미경으로 관찰 가능한 상태로 표지할 수 있다. 이는 1959년 W. Straus가 식포를 식별하는 데 처음 사용한 방법이다.
4. 기질
HRP 효소 단독으로는 유용성이 낮으며, 그 존재를 확인하기 위해서는 특정 기질이 필요하다. HRP는 과산화 수소를 산화제로 사용하여 기질을 산화시키는데, 이 과정에서 분광 광도법으로 감지 가능한 색 변화가 나타나거나 빛이 발생한다. HRP가 기질로 사용하는 과산화 수소 자체는 흡광이 거의 없어 직접적인 반응 측정이 어렵기 때문에, HRP에 의해 환원되어 검출 가능한 신호를 생성하는 기질을 사용하는 것이 일반적이다.
과산화 수소(또는 CH3OOH)를 첨가하면 HRP의 흡수 스펙트럼이 변하는데, 이는 과산화수소가 효소의 프로토헤마틴의 Fe3+과 결합하여 효소-기질 복합물을 형성하기 때문이다. 이 복합물들(Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ)은 각각 410, 418, 416nm(pH 7.0)에서 특징적인 흡수 극대값을 가진다.
HRP의 유용한 특성을 활용하기 위해 다양한 기질들이 개발되어 상업적으로 이용되고 있으며, 크게 두 가지 범주로 나눌 수 있다.
* 발색 기질: TMB, DAB, ABTS 등이 대표적이다. HRP는 이들 기질을 유색 생성물로 전환시키는 반응을 촉매한다. 특히 DAB는 세포 내에 주입된 후 HRP와 반응하여 광학 및 전자현미경으로 관찰 가능한 표지를 형성하는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 1959년 W. Straus가 식포 식별에 처음 사용하였다.
* 화학 발광 기질: 루미놀을 이용한 강화 화학 발광 등이 있다. HRP는 이들 기질에 작용하여 빛을 생성한다.
5. 응용
겨자무 과산화효소(HRP)는 분자량이 약 44,173.9 달톤인 당단백질이며, 표지 분자에 결합될 수 있는 6개의 라이신 잔기를 가지고 있다. 적절한 기질과 반응하면 표지 분자의 발색, 형광 또는 발광 유도체를 생성하여 특정 분자의 존재를 확인하고 정량화하는 데 사용된다.
HRP는 분자 표적의 존재를 결정하기 위해 종종 접합 단백질(유전적으로 또는 화학적으로 결합된 분자) 형태로 활용된다. 예를 들어, 웨스턴 블롯 분석에서는 특정 단백질을 소량 검출하기 위해 HRP와 결합된 항체를 사용한다. 이 경우 항체는 표적 단백질에 특이적으로 결합하고, HRP 효소는 기질이 존재할 때 검출 가능한 신호를 생성하여 단백질의 존재를 확인한다. 또한 HRP는 단량체이며 유색 생성물을 쉽게 만들 수 있다는 특징 때문에 ELISA 및 면역조직화학과 같은 기술에도 널리 사용된다. 과산화효소는 헴을 포함하는 산화환원효소로서, 전자 공여체를 이용하여 과산화수소의 환원적 분해를 촉매하는 상업적으로 중요한 효소이다.
HRP는 알칼리 인산 분해 효소와 같은 다른 일반적인 표지 효소에 비해 분자량이 작고 안정성이 높으며 가격이 저렴하여 여러 응용 분야에서 이상적이다. 또한 반응 속도(턴오버율)가 빨라 비교적 짧은 시간 안에 강한 신호를 생성할 수 있다는 장점도 있다. 다만, 고농도의 인산염 환경에서는 안정성이 크게 저하될 수 있다는 점에 유의해야 한다.
생물의학 분야 외에도 HRP는 환경 분야에서도 중요한 응용 가능성을 가진다. 특히 다양한 산업 폐수 처리 과정에서 주요 오염 물질로 간주되는 수산화 방향족 화합물(HAC)을 제거하는 데 효과적인 것으로 알려져 있다.
5.1. 신경 세포 표지
K. Kristensson과 G. Olsson은 1971년에 축삭 내 역행수송을 이용하여 신경세포체와 축삭분지를 염색하는 방법을 개발했다. 이 방법은 이후 신경세포의 형태나 체내에서의 이동 경로를 관찰하는 데 널리 이용되고 있다. 또한 발생 초기 단계의 세포에 겨자무 과산화효소(HRP)를 주입하면, 이 효소가 딸세포들에게 분배되어 그대로 남아있는 특성을 이용하여 세포의 계보를 추적하는 데에도 사용된다. 방사성 동위원소로 표지된 HRP나 면역 글로불린과 결합된 HRP 복합체를 사용하여 표지를 시각화하는 등 다양한 방식으로 응용되고 있다.
최근 몇 년 동안 겨자무 과산화효소(HRP)를 이용하여 뉴런을 표지하는 기술은 신경과학 분야에서 매우 중요한 도구로 자리 잡았다. 이 기술은 비교적 짧은 역사에도 불구하고, 1870년에 골지 염색법이 발견된 이후 이 염색법을 사용했던 신경생물학자들보다 더 많은 수의 신경생물학자들이 HRP 표지법을 사용했을 것이라고 평가받기도 한다.
5.2. 강화된 화학 발광 (ECL)
겨자무 과산화효소(HRP)는 여러 중간체를 통해 루미놀의 산화를 촉매하여 3-아미노프탈산을 생성한다. 이 반응 과정에서는 428nm 파장에서 낮은 강도의 빛이 방출된다. 하지만 특정 화학 물질, 즉 증강제(enhancer)가 존재하면 방출되는 빛의 양이 최대 1000배까지 증가하게 된다. 이렇게 빛 방출이 증강되는 현상을 강화된 화학 발광(Enhanced Chemiluminescence, ECL)이라고 부른다. 빛 방출 증가는 신호 감지를 더 용이하게 하여 반응의 민감도를 크게 향상시킨다.
일반적으로 사용되는 증강제로는 변형된 페놀류, 특히 아이오도-페놀(iodo-phenol) 등이 잘 알려져 있다. 시중에는 페놀 기반 증강제를 사용한 기질보다 최대 13배 더 강한 발광 신호를 내는 다른 종류의 증강제를 포함한 기질들도 판매되고 있다. ECL 반응에서 방출되는 빛의 강도는 반응에 참여하는 HRP 효소 분자의 수에 비례한다. 따라서 이는 특정 분자(예: 항체나 핵산 프로브)에 결합된 HRP의 양을 측정하는 데 사용될 수 있다.
ECL은 실험 설정이 비교적 간단하고 감도가 매우 높다는 장점이 있다. 예를 들어, 서던 블롯이나 노던 블롯과 같은 분자생물학 실험에서 약 0.5 pg 수준의 미량 핵산도 검출할 수 있다. 화학 발광 기질을 이용한 검출 방식은 기존의 발색 기질(색깔 변화로 검출하는 방식)과 비교했을 때 몇 가지 뚜렷한 장점을 가진다.
* 높은 감도: 발색 기질보다 감도가 10배에서 100배가량 더 높다.
* 넓은 동적 범위: 빛 방출량은 매우 넓은 동적 범위에 걸쳐 정량 분석이 가능하다. 반면, 발색 침전물의 경우 정량 가능한 범위가 약 한 자릿수 정도로 제한적이다.
* 쉬운 표지 제거: 실험 후 필터 등에서 표지(label)를 제거하는 과정이 훨씬 용이하다.
5.3. 중합 반응 촉매
겨자무 과산화효소(HRP)는 다양한 중합 반응에 사용될 수 있으며, 특히 페놀 유도체의 중합 반응에 대한 연구가 활발하다. 또한 HRP는 원자 이동 라디칼 중합(ATRP) 반응의 촉매로도 활용될 수 있다. 이 경우, 과산화수소가 없어도 고분자를 생성하는 것이 가능하다. HRP는 ATRP 반응의 개시제 역할을 하는 알킬 할라이드 또는 알킬 니트릴을 기질로 사용한다. HRP는 이 화합물들과 반응하여 라디칼을 생성하고, 생성된 라디칼이 중합 반응을 시작하게 된다. HRP를 촉매로 사용하는 ATRP는 기존의 금속 촉매 반응과 비슷한 수준으로 중합 과정을 제어할 수 있다는 장점이 있다.