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효모단백질잡종법

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목차

1. 개요

효모단백질잡종법(Yeast two-hybrid, Y2H)은 단백질 간 상호작용을 검출하는 데 사용되는 분자 생물학 기술이다. 1989년 스탠리 필즈와 송옥규에 의해 개발되었으며, 효모의 전사 활성 인자를 이용하여 단백질 간의 결합을 확인한다. Y2H는 미끼 단백질과 먹이 단백질을 각각 DNA 결합 도메인과 활성 도메인에 융합하여 발현시키고, 두 단백질이 상호작용하면 리포터 유전자의 전사가 활성화되는 원리를 이용한다. 이 기술은 단백질 기능 결정, 상호작용에 중요한 서열 결정, 신약 및 독성 물질 발견, 아연 손가락 단백질 선택 등 다양한 분야에 응용된다. Y2H는 기술적으로 간단하고 비용이 저렴하며, 대규모 스크리닝이 가능하다는 장점이 있지만, 위양성 및 위음성 결과의 가능성이 높다는 단점도 존재한다. Y2H 기술은 숙주 세포의 종류를 다양화하고, 삼-하이브리드, 비융합 단백질 시스템 등 변형된 방법을 통해 발전해왔다.

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효모단백질잡종법
개요
단백질 상호작용을 검출하기 위한 효모 투-하이브리드 스크리닝의 개략도.
단백질 상호작용을 검출하기 위한 효모 투-하이브리드 스크리닝의 개략도.
기술 정보
유형분자생물학 기술
목적단백질-단백질 상호작용 (PPI) 식별
기반전사 활성화
유전자 리포터
역사
최초 개발자스탠리 필즈와 송옥경
개발 년도1989년
응용
활용 분야단백질 상호작용 네트워크 매핑
약물 발견
단백질 기능 연구

2. 역사

1989년 스탠리 필즈와 송옥규가 효모의 Gal4 전사 활성 인자를 이용하여 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 기술을 처음 개발하였다. Gal4 단백질은 갈락토스 활용에 관여하는 유전자의 전사를 활성화한다.[4]

이후, 이와 동일한 원리가 단백질-DNA 상호작용 또는 DNA-DNA 상호작용을 감지하는 일부 방법뿐만 아니라 효모 대신 ''대장균''(Escherichia coli) 또는 포유류 세포와 같은 다른 숙주 유기체를 사용하는 방법을 포함하여 많은 대체 방법에 적용되었다.[3][5]

3. 기본 원리

대부분의 진핵생물 전사 인자는 활성화 도메인(Activation Domain, AD)과 DNA 결합 도메인(DNA-binding domain, BD)으로 구성되며, 이 두 도메인은 서로 독립적으로 기능할 수 있다.[47] Y2H 방법에서는 두 개의 단백질을 각각 AD와 BD에 융합하여 발현시킨다. BD가 붙은 단백질은 미끼 단백질, AD가 붙은 단백질은 먹이 단백질이라고 한다. 미끼 단백질은 일반적으로 알려진 단백질을 사용하며, 먹이 단백질은 알려진 단백질이나 라이브러리의 알려지거나 모르는 단백질을 사용한다.[45]

미끼와 먹이 단백질이 상호작용하면 전사 인자의 AD와 BD는 간접적으로 연결된다. 그러면 AD는 전사 시작 지점에 가까워져 보고자 유전자들의 전사가 일어날 수 있게 된다. 두 단백질이 상호작용하지 않으면 보고자 유전자의 전사는 일어나지 않는다. 이러한 방식으로, 융합된 단백질에서 성공적인 상호작용은 세포의 표현형을 변화시킨다.[43]

4. 실험 방법

효모단백질잡종법의 핵심은 대부분의 진핵 전사인자에서 활성도메인과 결합도메인이 모듈식으로, 직접 결합하지 않고도 가까이 있으면 기능할 수 있다는 점이다.[47] 즉, 전사인자가 두 조각으로 나뉘어 있더라도, 두 조각이 직접 연결되지 않아도 전사가 작동할 수 있다.[48]

일반적인 스크리닝 방법은 효모단백질잡종법이다.[48] 이 시스템은 특정 영양소 생합성을 할 수 없는 효모를 활용하며, 영양소가 없는 배지에서 배양하면 효모는 죽게 된다. 이 돌연변이 효모는 플라스미드 형태의 외부 DNA를 받아들여 만들어진다. 효모단백질잡종법에서는 돌연변이 효모에게 미끼와 먹이를 동시에 도입한다.

플라스미드는 DNA 결합 도메인(BD) 조각은 미끼 단백질에, 활성 도메인(AD) 조각은 먹이 단백질에 붙도록 제작된다. 미끼 단백질은 일반적으로 알려진 단백질을 사용하며, 먹이 단백질은 알려진 단백질 또는 라이브러리의 알려지거나 모르는 단백질을 사용한다. 라이브러리는 특정 기관이나 세포에서 표현되는 모든 단백질을 나타내는 단백질-인코딩 서열의 모음이다.[45] 라이브러리를 사용할 때는 각 세포가 하나 이상의 플라스미드에 감염되지 않는 것을 가정한다.

미끼와 먹이 단백질이 상호작용하면 전사인자의 AD와 BD는 간접적으로 연결되고, AD를 전사 시작 지점에 가까이 가게 하여 리포터 유전자 전사가 일어날 수 있게 한다. 만약 두 단백질이 상호작용하지 않는다면, 리포터 유전자 전사는 일어나지 않는다. 이러한 방식으로, 융합된 단백질에서 성공적인 상호작용은 세포의 표현형을 바꾼다.[43]

지난 10년 동안 수백만 개의 잠재적 상호작용이 고처리량 스크리닝 시스템(종종 로봇 사용)을 사용하여 여러 유기체에서 스크리닝되었으며, 수천 개의 상호작용이 [https://thebiogrid.org BioGRID]와 같은 데이터베이스에서 감지되고 분류되었다.[7][8]

라이브러리 스크리닝 방식에서는 미끼와 먹이를 포함하는 세포를 무작위 순서로 교배한다. 교배 후 선택적 배지에서 생존하는 세포를 선택한 후, 분리된 플라스미드의 염기서열을 분석하여 사용된 미끼와 상호작용하는 먹이(DNA 서열)가 무엇인지 확인한다. 이 방식은 재현성이 낮고 매트릭스 방식에 비해 더 많은 가짜 양성을 생성하는 경향이 있다.[37]

선별 과정이 완료되면, 적절한 특성을 나타내는 단백질의 1차 구조를 결정해야 한다. 이는 적절한 표현형을 보이는 세포에서 (원래 삽입된) 단백질을 암호화하는 서열을 검색하여 수행한다.

4. 1. 고정 도메인

잡종법 연구에서 DNA 결합 도메인(BD)은 다양하게 변화되는 반면, 상호작용하는 두 가지 단백질인 미끼와 먹이는 DNA 결합 도메인과 활성 도메인(AD) 사이에서 강한 결합을 유지하기에 변하지 않는다. 단백질-단백질 상호작용 연구에서 DNA 결합 도메인은 Zif268과 같이 많은 강한 DNA 결합 도메인 중에서 골라진다.[44] 미끼와 먹이 도메인들 중 자주 골라지는 것은 각각 효모 Gal11p의 263-352와 효모 Gal4의 58-97부분이다.[44] 이 도메인들은 효모와 박테리아를 기반으로 한 선택 기술에 사용될 수 있고 강하게 결합된다고 알려진다.[43][44]

선택된 활성 도메인은 반드시 세포 자신의 전사 도구들을 사용하여 보고자 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있어야 한다. 그래서 효모에서 쓰이는 활성 도메인들의 다양성은 박테리아에서는 적합하지 않을 수도 있다. 헤르페스바이러스 유도 활성 도메인인 VP16과 효모 Gal4 활성 도메인은 성공적으로 효모에서 사용되고 있다.[43] 반면에 E.coli RNA 중합효소의 ɑ-소단위의 부분은 E.coli에 사용된다.[44][45]

4. 2. 발현 플라스미드 제작

하이브리드 라이브러리에는 크게 무작위 라이브러리와 cDNA 기반 라이브러리의 두 가지 종류가 있다. cDNA 라이브러리는 특정 세포 유형에서 수집된 mRNA의 역전사를 통해 생성된 cDNA로 구성된다. 이 라이브러리는 분석에 사용되는 BD 또는 AD에 부착되도록 구성물에 연결될 수 있다.[43] 무작위 라이브러리는 cDNA 대신 무작위 서열의 DNA를 사용한다. 카세트 돌연변이 유발을 포함하여 이러한 무작위 서열을 생성하는 여러 가지 방법이 있다.[44] DNA 라이브러리의 출처에 관계없이, 적절한 제한 효소를 사용하여 관련 플라스미드의 적절한 위치에 삽입한다.[2] 이때, DNA 연결 효소를 사용하여 연결한다.[2]

4. 3. 대장균 특이적 고려 사항

IPTG 유도성 ''lac'' 프로모터를 이용하여 하이브리드 단백질 발현을 조절한다. IPTG가 공급되는 배지에서만 하이브리드 단백질이 발현되도록 하는 것이다.[44] 또한, 서로 다른 항체 저항성을 발현하는 유전자를 각 유전자 구조에 넣어, 형질전환되지 않은 세포는 항체 반응을 통해 쉽게 걸러낼 수 있도록 한다.[44] 이는 세포 생존을 위해 상호 작용의 부재가 필요한 반대 선택 방법에서 특히 중요하다.[2]

보고자 유전자는 에피솜 형태로 ''E. coli'' 게놈에 삽입된다.[44] 에피솜은 세균 세포 게놈에 통합될 수 있는 플라스미드 유형으로, 세포당 약 1개의 복제 수를 가진다.[9]

4. 4. 단백질 정보 복구

선별 과정이 완료되면, 적절한 특성을 나타내는 단백질의 1차 구조를 결정해야 한다. 이는 적절한 표현형을 보이는 세포에서 (원래 삽입된) 단백질을 암호화하는 서열을 검색하여 수행한다.

5. 민감도 조절

Tet-R 억제 단백질은 일반적인 리포터 유전자와 함께 사용될 수 있으며, 테트라사이클린 또는 독시사이클린(Tet-R 억제제)에 의해 제어될 수 있다. 따라서 Tet-R의 발현은 표준 2-하이브리드 시스템에 의해 제어되지만, Tet-R은 Tet-R 프로모터를 통해 앞서 언급한 ''HIS3''와 같은 리포터의 발현을 제어(억제)한다. 그런 다음 테트라사이클린 또는 그 유도체를 사용하여 Tet-R을 활용하는 시스템의 민감도를 조절할 수 있다.[1]

세포가 리포터 유전자에 의존하는 정도를 변경하여 민감도를 제어할 수 있다. 예를 들어, ''his3'' 의존성 세포의 경우 배양 배지에서 히스티딘의 농도를 변경하고, ''aadA'' 의존성 세포의 경우 스트렙토마이신의 농도를 변경하여 영향을 줄 수 있다.[2][3] 선택 유전자 의존성은 적절한 농도의 선택 유전자 억제제를 적용하여 제어할 수도 있다. 3-아미노-1,2,4-트리아졸(3-AT)은 ''HIS3'' 유전자 생성물의 경쟁적 억제제이며, 히스티딘 결핍 배지에서 생장에 필요한 최소한의 ''HIS3'' 발현 수준을 적정하는 데 사용될 수 있다.[2]

또한 리포터 DNA에서 오퍼레이터 서열의 수를 변경하여 민감도를 조절할 수 있다.

6. 변형된 Y2H 방법

효모단백질잡종법(Y2H)은 다양한 변형된 방법으로 발전해왔다.
나뉜 유비퀴틴 시스템 (Split-ubiquitin system)나뉜 유비퀴틴 시스템은 기존 Y2H 방법이 물에 녹는 단백질만 연구할 수 있다는 한계를 극복하고, 물에 녹지 않는 막관통 단백질 사이의 상호작용을 연구할 수 있게 해준다.[49] 이 방법에서는 연구 대상인 두 막관통 단백질을 C-말단 유비퀴틴 부분("Cub")과 N-말단 유비퀴틴 부분("Nub")이라는 서로 다른 유비퀴틴 조각에 융합시킨다. 이 융합 단백질은 각각 미끼(bait)와 먹이(prey)라고 불린다. Cub 부분은 막 단백질뿐만 아니라 전사인자(TF)에도 융합되는데, 이 전사 인자는 유비퀴틴 특이적 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 미끼와 먹이 단백질이 상호작용하면 Nub와 Cub 부분이 결합하여 나뉜 유비퀴틴이 재구성된다. 재구성된 유비퀴틴은 유비퀴틴 특이적 프로테아제에 의해 인식되어 전사 인자를 절단하고, 이는 리포터 유전자의 전사를 유도한다.[11]
일-하이브리드 (One-hybrid)일잡종 변이는 단백질-DNA 상호작용을 연구하는 방법이다. 활성화 도메인(AD)이 결합 도메인에 직접 연결된 단일 융합 단백질을 사용한다.[43] 결합 도메인은 이잡종 단백질-단백질 분석에서처럼 고정된 서열이 중요하지 않으며, 라이브러리로 구성될 수 있다. 이 라이브러리는 보고자 유전자가 만들어지는 프로모터가 있는 목표 서열에 대항하여 선택될 수 있다. 양성 선택 시스템에서, UAS에 성공적으로 결합하고 전사를 허용하는 결합 도메인이 선택된다.[1]
삼-하이브리드 (Three-hybrid)RNA-단백질 상호작용은 삼잡종변종(three-hybrid variation)을 통해 연구된다. 이 방법에서는 잡종 RNA 분자가 두 단백질 합성 도메인을 결합하는 역할을 한다.[43]

쓰리-하이브리드 분석의 개요.

비융합 단백질비융합단백질은 두 개의 융합단백질과 함께 공동 발현된다. 이 단백질은 융합단백질 중 하나의 상호작용을 수정, 매개, 또는 방해하는 역할을 할 수 있다.[43] 예를 들어 사카로미세스 세레비시아(''S. cerevisiae'')는 티로신키나제를 가지고 있지 않으므로, 연구에서 티로신 인산화가 필요하다면 티로신 키나제 유전자를 공급해야 한다.[43]

6. 1. 나뉜 유비퀴틴 시스템 (Split-ubiquitin system)

나뉜 유비퀴틴 시스템(split-ubiquitin system)은 고전적인 효모단백질잡종법이 수용성 단백질만 연구할 수 있다는 한계를 극복하게 해준다.[49] 이 방법은 물에 녹지 않는 막관통 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 연구하는 데 사용될 수 있다.

나뉜 유비퀴틴 시스템에서는 연구 대상인 두 막관통 단백질을 두 개의 서로 다른 유비퀴틴 조각에 융합시킨다. 이 조각들은 C-말단 유비퀴틴 부분("Cub", 잔기 35-76)과 N-말단 유비퀴틴 부분("Nub", 잔기 1-34)이다. 이 융합 단백질들은 각각 미끼(bait)와 먹이(prey)라고 불린다. Cub 부분은 막 단백질뿐만 아니라 전사인자(TF)에도 융합되는데, 이 전사 인자는 유비퀴틴 특이적 프로테아제에 의해 절단될 수 있다.

미끼와 먹이 단백질이 상호작용하면 Nub와 Cub 부분이 결합하여 나뉜 유비퀴틴이 재구성된다. 재구성된 유비퀴틴은 유비퀴틴 특이적 프로테아제에 의해 인식되어 전사 인자를 절단하고, 이는 리포터 유전자의 전사를 유도한다.[11]

6. 2. 일-하이브리드 (One-hybrid)

일잡종 변이(one-hybrid variation)는 단백질-DNA 상호작용을 연구하기 위한 방법으로, 활성화 도메인(AD)이 결합 도메인에 직접 연결된 단일 융합 단백질을 사용한다.[43] 이 경우 결합 도메인은 이잡종 단백질-단백질 분석에서처럼 고정된 서열이 중요하지 않으며, 라이브러리로 구성될 수 있다. 이 라이브러리는 보고자 유전자가 만들어지는 프로모터가 있는 목표 서열에 대항하여 선택될 수 있다. 양성 선택 시스템에서, UAS에 성공적으로 결합하고 전사를 허용하는 결합 도메인이 선택된다.[1]

DNA 결합 도메인의 선택은 일잡종 시스템에서 중요하지 않을 수 있다. 그러나 이잡종 시스템에서는 결합 도메인이 다양하고 미끼와 먹이 단백질은 일정함을 유지한다.[44][45][2][3]

6. 3. 삼-하이브리드 (Three-hybrid)

RNA-단백질 상호작용은 삼잡종변종(three-hybrid variation)을 통해 연구되고 있다. 이 경우, 잡종 RNA 분자가 두 단백질 합성 도메인을 결합하는 역할을 한다.[43] 비융합단백질에 포함된 기술은 같은 기능을 수행한다.

RNA-단백질 상호작용은 투-하이브리드 기술의 쓰리-하이브리드 변형을 통해 연구되었다. 이 경우, 하이브리드 RNA 분자는 서로 상호작용할 의도가 없는 두 단백질 융합 도메인—오히려 중간 RNA 분자(RNA-결합 도메인을 통해)—을 함께 연결하는 역할을 한다.[1] 위에 '비-융합 단백질' 섹션에서 설명한 것처럼 유사한 기능을 수행하는 비-융합 단백질을 포함하는 기술은 쓰리-하이브리드 방법으로도 언급될 수 있다.

6. 4. 비융합 단백질

비융합단백질은 두 개의 융합단백질과 함께 공동 발현된다. 연구에 따르면, 제3의 단백질은 융합단백질 중 하나의 상호작용을 수정, 매개, 또는 방해하는 역할을 한다.[43]

제3단백질의 공동발현은 융합단백질의 수정이나 활성화에 필수적이다. 예를 들어 사카로미세스 세레비시아(''S. cerevisiae'')는 티로신키나제를 가지고 있지 않다. 만약 연구에서 티로신 인산화가 필요하다면, 티로신 키나제 유전자 형태로 키나제를 공급해야 한다.[43]

비융합단백질은 동시에 융합된 단백질들에 붙어서 상호작용을 매개하기도 한다.[43]

상호작용하는 상대가 있는 단백질에게, 그것의 다른 단백질로의 기능적 상동관계는 융합되지 않은 형태의 제3의 단백질로 공급될 수 있다. 그 뒤, 결합상대로 융합단백질과 경쟁하거나 하지 않을 수 있다. 제3의 단백질과 다른 융합단백질의 결합은 보고자 발현 활성 복합체의 형태를 방해하고, 보고자의 발현을 줄여서, 표현형으로의 변화를 이끈다.[43]

7. 숙주 세포

효모 ''사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)''는 효모단백질잡종법(Y2H) 시스템의 표준 숙주 세포로 널리 사용된다.[1] 이 효모는 3차 단백질 구조 형성, 중성 내부 pH 유지, 디설파이드 결합 형성 촉진, 환원형 글루타티온과 같은 시토졸 완충 인자 제공 등 단백질 상호작용 연구에 유리한 여러 특징을 가지고 있다.[1] 또한, 비분자적 기술로 조작이 가능하며, 전체 유전자 서열이 알려져 있어 유전적 조작이 용이하다.[1] 다양한 배양 조건과 가혹한 화학 물질에도 내성이 강하다.[1] Y2H 스크린을 위해 특별히 제작된 효모 균주로는 Y187[17], AH109[18], R2HMet, BK100[19] 등이 있다.

''C. 알비칸스''는 CUG 코돈을 류신 대신 세린으로 번역하는 특징이 있다. 이러한 코돈 사용 차이 때문에 ''S. cerevisiae''를 이용한 Y2H 시스템에서는 ''C. 알비칸스'' 유전자 연구가 어렵다. 따라서 ''C. 알비칸스'' 자체 단백질 상호작용 연구를 위해 ''C. 알비칸스'' 투-하이브리드(C2H) 시스템이 개발되었다.[20][21]

세균 이중 혼성 방법(B2H 또는 BTH)은 주로 ''대장균''(E. coli)에서 수행되며, 효모 기반 시스템보다 높은 형질전환 효율과 빠른 성장 속도를 가진다. 이러한 특징 덕분에 108 이상의 더 큰 라이브러리 스크리닝에 유리하다.[2] 또한, 핵 국소화 신호가 필요 없고, 효모에 독성이 있는 단백질도 연구할 수 있다.[2] 그러나 B2H는 진핵 세포와 동일한 단백질 접힘 또는 처리가 부족할 수 있어 진핵 단백질 상호작용 연구에는 적합하지 않을 수 있다.

포유류 투-하이브리드(M2H) 시스템은 포유류 단백질 상호작용을 네이티브 단백질 환경과 유사한 세포 환경에서 연구하기 위해 개발되었다.[25] 이 시스템은 번역 후 변형, 인산화, 아실화, 당화 등이 효모 시스템보다 정확하게 이루어지며, 단백질의 세포 내 위치도 더 정확하다는 장점이 있다.[28][29] 또한, 신호 입력을 연구할 수 있고, 형질감염 후 48시간 이내에 결과를 얻을 수 있다.[5][30]

2005년에는 ''애기장대(Arabidopsis thaliana)'' 원형질체를 이용한 식물 투 하이브리드(P2H) 시스템이 개발되어 식물 단백질 상호작용 연구에 활용되고 있다.[31]

바다 달팽이의 일종인 ''A. californica''는 신경 생물학 연구에 사용되는 모델 생물로, 신경 세포 내 단백질 상호작용 연구를 위한 투-하이브리드 시스템이 개발되었다.[32][33]

누에(Bombyx mori)'' 세포주(BmN4)를 이용한 단백질 이중 결합(I2H) 시스템도 개발되었다.[34]

8. 응용

효모단백질잡종법은 단백질 간의 상호작용을 연구하고, 이를 바탕으로 다양한 생물학적 분야에 응용되는 기술이다.

진핵생물 전사 인자의 활성화 도메인과 결합 도메인이 모듈식이며 직접 결합 없이도 기능할 수 있다는 점을 이용한다.[6] 이를 통해 단백질 기능을 결정하거나, 단백질 상호작용에 중요한 서열을 결정할 수 있다. 또한 신약 및 독성 물질을 발견하거나, 단백질 공학에서 아연 손가락 단백질(ZFP)를 선택하는 데에도 응용된다.[2][3]

8. 1. 단백질 기능 결정

진핵생물 전사 인자의 활성화 도메인과 결합 도메인이 모듈식이며 직접 결합 없이도 기능할 수 있다는 점을 이용하여, 알려지지 않은 단백질의 상호작용 파트너를 규명하고 그 기능을 예측할 수 있다.[6] 이러한 상호작용 파트너를 통해 단백질 상호작용 네트워크를 구축하여 세포 내 생화학적 경로를 이해한다.

미끼 단백질과 먹이 단백질이 상호작용하면 전사 인자의 활성화 도메인(AD)과 결합 도메인(BD)이 간접적으로 연결된다. 이로 인해 AD가 전사 시작 부위에 가까워져 리포터 유전자의 전사가 일어난다. 만약 두 단백질이 상호작용하지 않으면 리포터 유전자는 전사되지 않는다. 이러한 방식으로 융합 단백질 간의 상호작용 성공 여부를 세포 표현형 변화와 연결시킨다.[1]

기능이 알려진 단일 단백질을 사용하여 알려지지 않은 단백질 라이브러리에서 상호작용하는 단백질을 찾거나, 반대로 기능이 알려지지 않은 단일 단백질을 사용하여 알려진 단백질 라이브러리에서 상호작용하는 단백질을 찾는 방식으로 연구를 수행할 수 있다.[1]

8. 2. 단백질 상호작용에 중요한 서열 결정

선별 과정이 완료되면, 적절한 특성을 나타내는 단백질의 1차 구조를 결정해야 한다. 이는 적절한 표현형을 보이는 세포에서 (원래 삽입된) 단백질을 암호화하는 서열을 검색하여 수행한다. 특정 아미노산을 변화시키기 위해 사용된 플라스미드 내 해당 DNA 염기쌍을 변이시킴으로써, 상호작용을 유지하는 데 있어 해당 아미노산 잔기의 중요성을 확인할 수 있다.[1]

8. 3. 신약 및 독성 물질 발견

단백질-단백질 신호 전달 상호작용은 그 특이성과 광범위함 때문에 적합한 치료 표적으로 간주된다. 무작위 약물 발견 접근법은 무작위 화학 구조로 구성된 화합물 은행을 사용하며, 이러한 구조를 의도된 표적에서 테스트하기 위한 고속 처리 방법을 필요로 한다.[1][16]

조사 대상으로 선택된 세포는 연구자가 연구하려는 분자적 측면을 반영하도록 특별히 조작될 수 있으며, 새로운 인간 또는 동물 치료제나 해충 방제제를 식별하는 데 사용될 수 있다.[1][16]

8. 4. 아연 손가락 단백질(Zinc finger protein) 선택

단백질 공학에서 아연 손가락 단백질(ZFP)을 선택하기 위해, 이중 혼성화 스크리닝 기술에서 사용되는 방법들이 성공적으로 활용되어 왔다.[2][3] ZFP는 원하는 DNA 서열에 결합하는 맞춤형 DNA 결합 도메인을 만드는 데 사용되는 DNA 결합 단백질이다.[35]

UAS에 포함된 원하는 표적 서열을 가진 선택 유전자를 사용하고, 관련 아미노산 서열을 무작위화하여 ZFP 라이브러리를 생성함으로써, 필요한 특성을 가진 DNA-ZFP 상호작용을 하는 세포를 선택할 수 있다. 각 ZFP는 일반적으로 3–4개의 염기쌍만 인식하므로, UAS 외부의 다른 위치를 인식하는 것을 막기 위해 무작위화된 ZFP는 일정한 서열을 가진 다른 두 개의 ZFP로 구성된 '스캐폴드'로 설계된다. 따라서 UAS는 ZFP가 선택된 서열 외에도 일정한 스캐폴드의 표적 서열을 포함하도록 설계된다.[2][3]

이 시스템을 사용하여 다른 여러 DNA 결합 도메인도 조사할 수 있다.[2]

9. 장점

효모단백질잡종법은 기술적으로 비교적 간단하고, 정교한 장비 없이도 어떤 실험실에서든 수행할 수 있다는 장점이 있다.[1] 이는 연구자가 새로운 결합 파트너를 식별하는 데 중요한 첫 번째 단서를 제공할 수 있게 해준다.

또한, 이 방법은 확장 가능하여 많은 단백질 간의 상호작용을 스크리닝할 수 있다. 자동화가 가능하며, 로봇을 사용하여 비교적 짧은 시간에 수천 개의 잠재적 상호작용 단백질에 대해 많은 단백질을 스크리닝할 수 있다. 이러한 대규모 스크리닝(High-throughput screening)에는 라이브러리 접근법과 매트릭스 접근법 두 가지 유형이 있다.[7][8]


  • 라이브러리 스크리닝 방식: 미끼와 먹이를 포함하는 세포를 무작위 순서로 교배시킨다. 이후 선택적 배지에서 생존하는 세포를 선택하고, 분리된 플라스미드의 염기서열을 분석하여 어떤 먹이(DNA 서열)가 사용된 미끼와 상호 작용하는지 확인한다. 이 방식은 재현성이 낮고 매트릭스 방식에 비해 더 많은 수의 가짜 양성을 생성하는 경향이 있다.[37]
  • 매트릭스 스크리닝 방식: 연구자가 사용된 배지(한천 배지)에서 각 먹이(prey)가 어디에 있는지 알고 있는 상태에서 실험을 진행한다.


효모단백질잡종 데이터는 공동 친화도 정제 후 질량 분석법(AP/MS)을 수행하는 대안적 접근법으로 생성된 데이터와 유사한 품질을 가질 수 있다.

10. 단점

효모단백질잡종법(Y2H)을 이용한 단백질-단백질 상호작용 스크리닝에는 몇 가지 한계점이 존재한다.


  • 위양성 결과: Y2H 스크리닝은 위양성(false positive, 실제로는 상호작용하지 않는 단백질이 상호작용하는 것처럼 나타나는 경우) 결과를 나타낼 가능성이 높다. 초기 추정치는 최대 70%에 달했다.[37][27] 이러한 높은 오류율은 다음과 같은 요인들에 의해 발생할 수 있다.
  • 융합 단백질의 과발현은 비특이적 결합을 유발할 수 있다.
  • 융합된 부분이 특정 상호작용을 억제할 수 있다.
  • 효모 내 환경이 실제 생체 내 환경과 다를 수 있다. 예를 들어, 세균 단백질 검사 시 샤페론이 부족하거나, 포유류 단백질의 경우 번역 후 변형(예: 인산화) 과정이 제대로 일어나지 않을 수 있다.
  • Y2H는 핵 내에서 진행되는데, 검사 단백질이 핵에 존재하지 않으면 상호작용을 확인할 수 없다.
  • 일부 단백질은 효모에서 함께 발현될 때만 특이적으로 상호작용할 수 있지만, 실제로는 같은 세포 내에 동시에 존재하지 않을 수 있다.


이러한 한계점들 때문에 Y2H 결과는 주의해서 해석해야 하며, 다른 실험 방법 (예: 내인성 단백질의 공동 면역 침강)이나 생물정보학 기술을 통해 검증하는 것이 필요하다.[38][39]

참조

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