겨자무 과산화효소

3. 화학적 성질

분자량은 약 44,000이며, 1분자당 1개의 작용기 프로토헤민을 포함한다. 이 효소의 흡수 스펙트럼은 640, 500, 402nm에서 흡수 극대를 나타낸다. H₂O₂나 CH₃OOH을 첨가하면 흡수 스펙트럼이 변하는데, 이는 과산화수소가 효소의 프로토헤마틴에 있는 철 이온(Fe³⁺)과 결합하여 효소-기질 결합물을 형성하기 때문이다.^[29]

형성된 결합물 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ의 γ대 흡수 극대는 각각 410, 418, 416nm(pH 7.0)이다. 1997년 X선 결정 구조 분석을 통해 처음으로 입체 구조가 밝혀졌으며,^[17] 이후 다양한 기질과의 상호작용에 따른 구조 변화도 연구되었다.^[18] 이 효소는 거대한 알파 나선 구조를 가진 당단백질이며, 보조 인자로 헴철을 가지고 있다.

일본에서는 무나 순무에서 유사한 효소를 추출하여 결정화했지만, 이는 겨자무에서 얻은 효소와는 성질이 조금 다르다. 세포 내에 들어가거나 주입된 후, 디아미노벤지딘(3,3′-diaminobenzidine)과 같은 기질과 반응시키면 광학 현미경이나 전자현미경으로 관찰 가능한 상태로 표지할 수 있다. 이는 1959년 W. Straus가 식포를 식별하는 데 처음 사용한 방법이다.^[29]

4. 기질

HRP 효소 단독으로는 유용성이 낮으며, 그 존재를 확인하기 위해서는 특정 기질이 필요하다. HRP는 과산화 수소를 산화제로 사용하여 기질을 산화시키는데, 이 과정에서 분광 광도법으로 감지 가능한 색 변화가 나타나거나 빛이 발생한다.^{[4][5][19][20]} HRP가 기질로 사용하는 과산화 수소 자체는 흡광이 거의 없어 직접적인 반응 측정이 어렵기 때문에, HRP에 의해 환원되어 검출 가능한 신호를 생성하는 기질을 사용하는 것이 일반적이다.^[19][20]

과산화 수소(또는 CH₃OOH)를 첨가하면 HRP의 흡수 스펙트럼이 변하는데, 이는 과산화수소가 효소의 프로토헤마틴의 Fe³⁺과 결합하여 효소-기질 복합물을 형성하기 때문이다.^[29] 이 복합물들(Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ)은 각각 410, 418, 416nm(pH 7.0)에서 특징적인 흡수 극대값을 가진다.^[29]

HRP의 유용한 특성을 활용하기 위해 다양한 기질들이 개발되어 상업적으로 이용되고 있으며, 크게 두 가지 범주로 나눌 수 있다.^[19][20]

• 발색 기질: TMB, DAB, ABTS 등이 대표적이다. HRP는 이들 기질을 유색 생성물로 전환시키는 반응을 촉매한다. 특히 DAB는 세포 내에 주입된 후 HRP와 반응하여 광학 및 전자현미경으로 관찰 가능한 표지를 형성하는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 1959년 W. Straus가 식포 식별에 처음 사용하였다.^[29]
• 화학 발광 기질: 루미놀을 이용한 강화 화학 발광 등이 있다. HRP는 이들 기질에 작용하여 빛을 생성한다.

5. 응용

겨자무 과산화효소(HRP)는 분자량이 약 44,173.9 달톤인 당단백질이며, 표지 분자에 결합될 수 있는 6개의 라이신 잔기를 가지고 있다. 적절한 기질과 반응하면 표지 분자의 발색, 형광^[6][21] 또는 발광 유도체를 생성하여 특정 분자의 존재를 확인하고 정량화하는 데 사용된다.

HRP는 분자 표적의 존재를 결정하기 위해 종종 접합 단백질(유전적으로 또는 화학적으로 결합된 분자) 형태로 활용된다. 예를 들어, 웨스턴 블롯 분석에서는 특정 단백질을 소량 검출하기 위해 HRP와 결합된 항체를 사용한다. 이 경우 항체는 표적 단백질에 특이적으로 결합하고, HRP 효소는 기질이 존재할 때 검출 가능한 신호를 생성하여 단백질의 존재를 확인한다.^[7][22] 또한 HRP는 단량체이며 유색 생성물을 쉽게 만들 수 있다는 특징 때문에 ELISA 및 면역조직화학과 같은 기술에도 널리 사용된다. 과산화효소는 헴을 포함하는 산화환원효소로서, 전자 공여체를 이용하여 과산화수소의 환원적 분해를 촉매하는 상업적으로 중요한 효소이다.

HRP는 알칼리 인산 분해 효소와 같은 다른 일반적인 표지 효소에 비해 분자량이 작고 안정성이 높으며 가격이 저렴하여 여러 응용 분야에서 이상적이다. 또한 반응 속도(턴오버율)가 빨라 비교적 짧은 시간 안에 강한 신호를 생성할 수 있다는 장점도 있다.^[8][23] 다만, 고농도의 인산염 환경에서는 안정성이 크게 저하될 수 있다는 점에 유의해야 한다.

생물의학 분야 외에도 HRP는 환경 분야에서도 중요한 응용 가능성을 가진다. 특히 다양한 산업 폐수 처리 과정에서 주요 오염 물질로 간주되는 수산화 방향족 화합물(HAC)을 제거하는 데 효과적인 것으로 알려져 있다.^[9][24]

5. 1. 신경 세포 표지

5. 2. 강화된 화학 발광 (ECL)

• 높은 감도: 발색 기질보다 감도가 10배에서 100배가량 더 높다.
• 넓은 동적 범위: 빛 방출량은 매우 넓은 동적 범위에 걸쳐 정량 분석이 가능하다. 반면, 발색 침전물의 경우 정량 가능한 범위가 약 한 자릿수 정도로 제한적이다.
• 쉬운 표지 제거: 실험 후 필터 등에서 표지(label)를 제거하는 과정이 훨씬 용이하다.

5. 3. 중합 반응 촉매

6. HRP 모방체

자연적인 HRP를 모방하기 위해 많은 물질들이 연구되어 왔다. 예를 들어, 산화철 나노 입자나 헤민을 포함하는 복합체가 HRP 모방에 사용되어 왔다.^[15][27] 이러한 HRP 유사 인공 효소는 바이오마커 검출이나 종양의 면역 염색에서부터 생물 부착 방지(항오염)에 이르기까지 다양한 용도로 활용되고 있다.

참조

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_[2] 논문 Crystal structure of horseradish peroxidase C at 2.15 A resolution 1997-12
_[3] 웹사이트 Peroxidase C1A Related PDB sequences http://www.ebi.ac.uk[...] European Bioinformatics Institute
_[4] 논문 Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme 2004-02
_[5] 논문 Synthesis and characterization of polymers produced by horseradish peroxidase in dioxane 1991-10
_[6] 논문 A fluorescent peroxidase probe increases the sensitivity of commercial ELISAs by two orders of magnitude
_[7] 논문 Investigation of the blood-ganglion barrier properties in rat sympathetic ganglia by using lanthanum ion and horseradish peroxidase as tracers
_[8] 논문 Comparison of horseradish peroxidase and alkaline phosphatase-labelled antibodies in enzyme immunoassays 1987-03
_[9] 논문 Optimization of peroxidase-catalyzed oxidative coupling process for phenol removal from wastewater using response surface methodology 2007-10
_[10] 서적 Principles of neural development https://archive.org/[...] Sinauer Associates
_[11] 웹사이트 High Intensity HRP-Chemiluminescence ELISA Substrate http://www.haemoscan[...]
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_[13] 논문 Horseradish Peroxidase as a Catalyst for Atom Transfer Radical Polymerization https://onlinelibrar[...] 2011-11
_[14] 논문 PolyPEGA with predetermined molecular weights from enzyme-mediated radical polymerization in water https://pubs.rsc.org[...] 2011-05-24
_[15] 논문 Nanomaterials with enzyme-like characteristics (nanozymes): next-generation artificial enzymes 2013-07
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