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올리고뉴클레오타이드

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목차

1. 개요

올리고뉴클레오타이드는 짧은 가닥의 핵산으로, 원하는 서열로 합성하여 연구 및 의학 분야에 활용된다. 화학적 합성 방법을 통해 효소의 제약 없이 핵산을 합성할 수 있으며, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 통해 정제한다. 합성 과정에서 뉴클레오사이드의 보호된 포스포라미다이트를 사용하며, 3'에서 5' 방향으로 진행된다. 화학적 변형을 통해 안정성을 높이고, 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO) 치료법 개발에 기여한다. ASO는 특정 메신저 RNA에 결합하여 단백질 번역을 억제하며, 유전자 녹다운, 바이러스 억제 및 신경퇴행성 질환 치료에 활용된다. 올리고뉴클레오타이드의 세포 내 흡수는 치료제 개발의 과제이며, 흡수 메커니즘과 흡수 증진 전략에 대한 연구가 진행되고 있다. 분석 기법으로는 크로마토그래피, 질량 분석, DNA 마이크로어레이 등이 사용된다.

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    염기쌍은 DNA나 RNA에서 아데닌(A)이 티민(T) 또는 우라실(U)과, 구아닌(G)이 사이토신(C)과 수소 결합으로 연결된 뉴클레오염기 쌍을 의미하며, DNA 이중 나선 구조 안정성과 유전 정보 복제 및 전사에 필수적이고, 유전자나 DNA 조각의 크기를 나타내는 단위로 사용된다.
  • 핵산 - RNA
    RNA는 DNA와 함께 생명체의 유전 물질을 구성하는 핵심 분자로서, DNA의 유전 정보를 바탕으로 단백질 합성, 유전자 발현 조절, 촉매 작용 등 다양한 기능을 수행하며, mRNA 백신 개발에 기여하였다.
올리고뉴클레오타이드

2. 합성

올리고뉴클레오타이드 합성은 원하는 서열의 핵산을 화학적으로 합성하는 방법이다. 이 과정은 1970년대 이후 완전히 자동화되었으며, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 기법을 통해 분리하여 높은 순도의 핵산을 얻는다.[6]

2. 1. 화학적 합성

올리고뉴클레오타이드 합성은 비교적 짧은 가닥의 핵산을 원하는 서열로 합성하는 방법 중 하나이다. 이 기술은 빠르고 비싸지 않게 핵산을 원하는 서열로 합성할 수 있기에 현대 연구소에서 아주 중요하다. 일반적으로 효소가 핵산을 5'에서 3' 방향으로만 합성할 수 있는 반면에, 화학적인 올리고뉴클레오타이드 합성은 이러한 제약이 존재하지 않는다.[6]

올리고뉴클레오타이드는 천연 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오사이드의 보호된 포스포라미다이트를 사용하여 화학적으로 합성된다. 올리고뉴클레오타이드 사슬 조립은 "합성 사이클"이라고 하는 일상적인 절차를 따라 3'에서 5' 방향으로 진행된다. 단일 합성 사이클이 완료되면 성장하는 사슬에 하나의 뉴클레오타이드 잔기가 추가된다. 각 합성 단계의 수율이 100% 미만이고 부반응이 발생하면 프로세스의 효율성에 실질적인 한계가 설정된다. 일반적으로 올리고뉴클레오타이드 서열은 짧다(13~25개의 뉴클레오타이드 길이).[6] 합성 올리고뉴클레오타이드의 최대 길이는 200개의 뉴클레오타이드 잔기를 거의 초과하지 않는다.

올리고뉴클레오타이드 합성은 포스포라미다이트라고 불리는 뉴클레오타이드와 아미노기, 수산기, 인산기가 보호된 통상적인 뉴클레오타이드를 사용하여 수행된다. 포스포라미다이트가 더해지면 생성물의 5' 말단의 인산기의 보호가 벗겨지고, 새로운 염기가 부가된다. 이렇게 마지막까지 오면 모든 보호기가 제거된다. 그러나 화학적 합성에서는 오류가 발생할 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드의 길이가 길수록 그 가능성은 높아진다. 따라서 이 방법은 짧은 올리고뉴클레오타이드를 만들 때에만 사용된다. 적절한 배열의 올리고뉴클레오타이드만을 분리하기 위해서는 고속 액체 크로마토그래피가 사용된다.

3. 화학적 변형

올리고뉴클레오타이드는 자연 상태에서 뉴클레아제라는 효소에 의해 쉽게 분해되고, 약한 결합 친화력을 갖는 문제점이 있다.[7][8] 이러한 문제를 해결하고 안정성과 효능을 높이기 위해 다양한 화학적 변형이 사용된다. 대표적인 화학적 변형으로는 골격 변형, 당 고리 변형 등이 있다.

3. 1. 골격 변형

화학적으로 안정적인 짧은 올리고뉴클레오타이드의 개발은 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO) 치료법 개발의 초기 과제였다. 자연 발생 올리고뉴클레오타이드는 모든 세포 유형에 풍부하게 존재하는 뉴클레아제라는 효소에 의해 쉽게 분해된다.[7] 또한 짧은 올리고뉴클레오타이드 서열은 약한 고유 결합 친화력을 가지며, 이는 생체 내 분해에 기여한다.[8]

뉴클레오사이드 유기티오인산염(PS) 유사체는 올리고뉴클레오타이드에 몇 가지 유익한 특성을 부여한다. PS 백본이 뉴클레오타이드에 부여하는 주요 유익한 특성은 각 뉴클레오타이드의 입체 이성질체 식별과, 올리고뉴클레오타이드 합성에 유용한 인산티오에이트 뉴클레오타이드를 포함하는 반응을 쉽게 추적할 수 있다는 것이다.[9] 올리고뉴클레오타이드에 대한 PS 백본 변형은 효소에 의한 원치 않는 분해로부터 보호한다.[10] 뉴클레오타이드 백본 변형은 대부분의 뉴클레오타이드에서 비교적 쉽고 정확하게 수행할 수 있기 때문에 널리 사용된다.[9] 올리고뉴클레오타이드의 5' 및 3' 말단에 대한 형광 변형은 환경에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조, 동역학 및 상호 작용을 평가하는 데 보고되었다.[11]

3. 2. 당 고리 변형

2' 당 변형은 올리고뉴클레오타이드의 의학적 적용에 유용한 변형이다. 2' 위치의 당을 변형하면 올리고뉴클레오타이드의 표적 결합 능력이 향상되어 특히 안티센스 올리고뉴클레오타이드 치료법에서 올리고뉴클레오타이드의 효과가 증가한다.[8] 또한 비특이적 단백질 결합을 감소시켜 특정 단백질을 표적으로 하는 정확성을 높인다.[8] 가장 일반적으로 사용되는 변형 중 두 가지는 2'-O-메틸과 2'-O-메톡시에틸이다.[8] 염기 내 형광 변형도 보고되었다.[11]

4. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ASO)

안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)는 특정 메신저 RNA(mRNA) 서열에 상보적으로 결합하여 단백질 번역을 억제한다. ASO 치료법 개발 초기에는 화학적으로 안정적인 짧은 올리고뉴클레오타이드를 만드는 것이 과제였다. 자연 상태의 올리고뉴클레오타이드는 세포 내 뉴클레아제(nucleases) 효소에 의해 쉽게 분해되고, 짧은 서열은 결합 친화력이 약하기 때문이다.[7][8] 안티센스 DNA는 특정 서열을 가진 RNA 검출에 사용되며, DNA/RNA 쌍 형성은 리보뉴클레아제 H에 의해 빠르게 분해된다.

4. 1. 작용 기전

안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)는 선택된 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 또는 RNA이다.[6] 안티센스 RNA는 특정 메신저 RNA 가닥에 결합하여 단백질 번역을 방지하는데, 이를 혼성화라고 한다.[12] ASO는 특정 RNA(코딩 또는 비암호)에 상보적으로 결합할 수 있다. 이 결합으로 생성된 이중 가닥은 RNase H 효소에 의해 분해된다.[12] RNase H는 RNA 가수분해 효소로, ASO 활용 시 mRNA 발현을 80-95% 감소시킨다.[6]

4. 2. 응용 분야

올리고뉴클레오타이드는 생물학 및 의학 분야에서 다양하게 활용된다. 특히, 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO) 치료법은 화학적으로 안정적인 짧은 올리고뉴클레오타이드 개발을 통해 발전해 왔다. 자연 상태의 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레아제 효소에 의해 쉽게 분해되고, 약한 결합 친화력을 가지는 문제점이 있지만, 이를 극복하여 ASO 치료법에 사용되고 있다.[7][8]

ASO는 특정 메신저 RNA(mRNA) 가닥에 결합하여 단백질 번역을 억제하는 역할을 한다.[12] ASO가 특정 RNA 서열과 결합하면, 이중 가닥 RNA를 분해하는 효소인 RNase H에 의해 분해되어 mRNA 발현을 감소시킨다.[6][12]

모폴리노 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 척추동물의 유전자 녹다운(knockdown) 실험에 널리 사용되며, 발생 생물학 연구에 기여한다.[13] 에테플리르센(eteplirsen) 및 골로디르센(golodirsen)과 같이 FDA 승인을 받은 ASO 치료제도 있다. 또한, ASO는 세포주에서 인플루엔자 바이러스 복제를 억제하는 데에도 사용된다.[14][15]

헌팅턴병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증(ALS)과 같은 신경퇴행성 질환은 잘못된 RNA 서열을 초래하는 DNA 변형과 관련이 있다. ASO 치료법은 이러한 질병에서 잘못된 RNA 서열을 표적으로 하여 치료 효과를 기대할 수 있다.[16][3]

5. 세포 내 흡수

화학적으로 안정적인 짧은 올리고뉴클레오타이드의 개발은 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO) 치료법 개발의 초기 과제였다. 자연 상태의 올리고뉴클레오타이드는 모든 세포에 풍부하게 존재하는 뉴클레아제(nucleases)라는 효소에 의해 쉽게 분해된다.[7] 또한 짧은 올리고뉴클레오타이드 서열은 약한 고유 결합 친화력을 가지며, 이는 생체 내 분해를 유발한다.[8]

5. 1. 흡수 메커니즘

세포 내 흡수는 여전히 올리고뉴클레오타이드(ON) 치료제의 성공적인 개발에 가장 큰 걸림돌로 작용하고 있다. 대부분의 소분자 약물과 마찬가지로, ON의 폴리음이온성 골격과 분자 크기로 인해 단순한 흡수가 방해받는다. ON이 작용하는 부위로의 흡수 및 세포 내 이동의 정확한 메커니즘은 여전히 불분명한 부분이 많다. 게다가 ON 구조/변형의 작은 차이와 세포 유형의 차이는 흡수에 큰 차이를 가져온다. ON이 세포 표면에 흡착된 후 세포 흡수는 서로 다른 경로로 일어나는 것으로 여겨진다. 특히, 연구에 따르면 대부분의 조직 배양 세포는 비생산적인 방식으로 ASO(포스포로티오에이트 결합)를 쉽게 흡수하며, 이는 안티센스 효과가 관찰되지 않음을 의미한다. 이와는 대조적으로, G-결합 수용체에 의해 인식되는 리간드와 ASO의 접합은 생산적인 흡수를 증가시킨다.[17] 이러한 분류(비생산적 vs. 생산적) 외에도, 세포 내부화는 주로 에너지 의존적인 방식(수용체 매개 엔도사이토시스)으로 진행되지만, 에너지 비의존적인 수동 확산(짐노시스)을 배제할 수는 없다. 세포막을 통과한 후, ON 치료제는 초기 엔도솜에 갇히게 되어 저 pH에서 분해 효소를 포함하는 리소좀과 궁극적으로 융합되는 후기 엔도솜으로 운반된다.[18] 치료 기능을 발휘하기 위해 ON은 분해되기 전에 엔도솜에서 탈출해야 한다. 현재 전달, 세포 흡수 및 엔도솜 탈출 문제를 극복할 수 있는 보편적인 방법은 없지만, 특정 세포 및 해당 수용체에 맞게 조정된 여러 접근 방식이 존재한다.[19]

ON 치료제를 세포 인식/흡수를 담당하는 개체에 접합하면 흡수가 증가할 뿐만 아니라 주로 하나의(이상적으로는 알려진) 메커니즘이 관여하므로 세포 흡수의 복잡성을 줄이는 것으로 여겨진다.[18] 이는 예를 들어 N-아세틸갈락토사민을 포함하는 소분자-ON 접합체를 통해 달성되었으며, 이는 간세포의 수용체를 표적으로 한다.[20] 이러한 접합체는 표적 세포에서 과발현되는 해당 수용체가 표적 치료로 이어지기 때문에 (암세포에서 과발현되는 수용체를 이용하는 항체-약물 접합체와 비교) 표적 전달과 함께 세포 흡수를 증가시키는 훌륭한 예이다.[19] 올리고뉴클레오타이드의 표적 전달 및 세포 흡수를 증가시키기 위해 널리 사용되고 심도 있게 연구되는 또 다른 개체는 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체이다.

5. 2. 흡수 증진 전략

N-아세틸갈락토사민을 포함하는 소분자-올리고뉴클레오타이드 접합체는 간세포의 수용체를 표적으로 하여 흡수를 증가시킨다.[20] 이러한 접합체는 표적 세포에서 과발현되는 해당 수용체가 표적 치료로 이어지기 때문에 (암세포에서 과발현되는 수용체를 이용하는 항체-약물 접합체와 비교) 표적 전달과 함께 세포 흡수를 증가시키는 좋은 예이다.[19] 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체는 올리고뉴클레오타이드의 표적 전달 및 세포 흡수를 증가시키기 위해 널리 사용되고 심도 있게 연구되는 또 다른 방법이다.

6. 분석 기법

올리고뉴클레오타이드 분석에는 여러 기법이 사용된다.

기법설명
크로마토그래피알킬아미드는 크로마토그래피 고정상으로 사용될 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드 분리에 연구되었다.[21][22] 이온쌍 역상 고성능 액체 크로마토그래피(IP-RP-HPLC)는 자동 합성이 완료된 후 올리고뉴클레오타이드를 분리하고 분석하는 데 사용된다.[23]
질량 분석MALDI 질량 분석법과 전기분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)은 올리고뉴클레오타이드의 질량 특성 분석에 사용된다.[24][25]
DNA 마이크로어레이DNA 마이크로어레이는 올리고뉴클레오타이드 분석에 유용하게 응용된다. 표준 cDNA 마이크로어레이에 비해 올리고뉴클레오타이드 기반 마이크로어레이는 하이브리다이제이션에 대한 특이성을 더 잘 제어하고, 선택적 스플라이싱 또는 폴리아데닐화된 서열의 존재와 유병률을 측정할 수 있다.[26]


6. 1. 크로마토그래피

알킬아미드는 크로마토그래피 고정상으로 사용될 수 있다.[21] 이러한 고정상은 올리고뉴클레오타이드의 분리를 위해 연구되었다.[22] 이온쌍 역상 고성능 액체 크로마토그래피(IP-RP-HPLC)는 자동 합성이 완료된 후 올리고뉴클레오타이드를 분리하고 분석하는 데 사용된다.[23]

6. 2. 질량 분석

MALDI 질량 분석법과 전기분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)은 올리고뉴클레오타이드의 질량 특성 분석에 사용된다.[24][25]

6. 3. DNA 마이크로어레이

DNA 마이크로어레이는 올리고뉴클레오타이드의 유용한 분석 응용 분야이다. 표준 cDNA 마이크로어레이와 비교하여, 올리고뉴클레오타이드 기반 마이크로어레이는 하이브리다이제이션에 대한 특이성을 더 잘 제어하고, 선택적 스플라이싱 또는 폴리아데닐화된 서열의 존재와 유병률을 측정할 수 있는 능력을 갖추고 있다.[26] DNA 마이크로어레이의 한 하위 유형은 올리고뉴클레오타이드가 고밀도로 결합된 기질(나일론, 유리 등)로 설명될 수 있다.[27]

DNA 마이크로어레이는 나일론이나 유리 기판에 고밀도의 올리고뉴클레오티드를 결합시킨 것이다. 다형성이나 유전자 발현 연구, 특정 질병의 검출 등에 사용된다.

참조

[1] 논문 Solid-Phase Synthesis of Phosphorothioate Oligonucleotides Using Sulfurization Byproducts for in Situ Capping 2018-10
[2] 논문 VIRmiRNA: a comprehensive resource for experimentally validated viral miRNAs and their targets 2014-01-01
[3] 논문 ASPsiRNA: A Resource of ASP-siRNAs Having Therapeutic Potential for Human Genetic Disorders and Algorithm for Prediction of Their Inhibitory Efficacy http://crdd.osdd.net[...]
[4] 서적 Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA : Novel Pharmacological and Therapeutic Agents CRC Press 1997
[5] 논문 Antisense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes
[6] 논문 Antisense oligonucleotides: basic concepts and mechanisms https://mct.aacrjour[...] 2002-03
[7] 논문 Antisense oligonucleotide therapies: the promise and the challenges from a toxicologic pathologist's perspective 2015-01
[8] 논문 Antisense oligonucleotides: treating neurodegeneration at the level of RNA 2013-07
[9] 논문 Phosphorothioate oligodeoxynucleotides: what is their origin and what is unique about them? 2000-04
[10] 논문 Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides 1988-04
[11] 논문 Probing of Nucleic Acid Structures, Dynamics, and Interactions With Environment-Sensitive Fluorescent Labels 2020
[12] 논문 Molecular Mechanisms of Antisense Oligonucleotides 2017-04
[13] 논문 Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach 2000-06
[14] 논문 Cross-protective effect of antisense oligonucleotide developed against the common 3' NCR of influenza A virus genome 2013-11
[15] 논문 Nucleic acid-mediated cleavage of M1 gene of influenza A virus is significantly augmented by antisense molecules targeted to hybridize close to the cleavage site 2012-05
[16] 논문 Antisense oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease 2006-08
[17] 논문 Intracellular delivery of an antisense oligonucleotide via endocytosis of a G protein-coupled receptor http://dx.doi.org/10[...] 2010-06-15
[18] 논문 Cellular Targeting of Oligonucleotides by Conjugation with Small Molecules 2020-12-16
[19] 논문 Cellular uptake and trafficking of antisense oligonucleotides https://pubmed.ncbi.[...] 2017
[20] 논문 Targeted delivery of antisense oligonucleotides to hepatocytes using triantennary N-acetyl galactosamine improves potency 10-fold in mice 2014-07
[21] 논문 Chromatographic and related studies of alkylamide phases. 1994-08
[22] 논문 Analysis of oligonucleotides by liquid chromatography with alkylamide stationary phase. 2015-01
[23] 논문 Ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography analysis of oligonucleotides:: Retention prediction https://www.scienced[...] 2002-06-07
[24] 논문 5-Methoxysalicylic acid and spermine: a new matrix for the matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry analysis of oligonucleotides 2001-04
[25] 논문 An ESI-MS method for characterization of native and modified oligonucleotides used for RNA interference and other biological applications 2008-03
[26] 논문 Optimization of oligonucleotide-based DNA microarrays 2002-06
[27] 논문 Multi-technique comparison of immobilized and hybridized oligonucleotide surface density on commercial amine-reactive microarray slides 2006-04


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