단백질 정제
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1. 개요
단백질 정제는 후속 사용을 위한 대량의 단백질 생산을 목표로 하는 준비적 정제와 식별, 정량화, 구조 연구 등을 위한 분석적 정제로 나뉜다. 정제는 시작 물질 선택, 추출, 원심분리, 침전 및 용해도 차이를 이용한 분리, 크로마토그래피, 자유 흐름 전기영동 등의 단계를 거쳐 수행된다. 정제된 단백질은 한외 여과 등의 방법으로 농축하고, SDS-PAGE, 분광학적 특징, 효소 활성, 웨스턴 블롯, ELISA, 리간드 결합 분석 등을 통해 정제 수율을 평가한다. 또한, 젤 전기영동과 같은 분석 방법을 통해 단백질을 분석할 수 있다.
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2. 단백질 정제의 목적
단백질 제조 비용은 여전히 높으며, 비용 효율적이고 신속한 단백질 정제 방법을 개발하려는 요구가 증가하고 있다. 다양한 단백질 정제 방법을 이해하고 다운스트림 공정을 최적화하는 것은 생산 비용을 최소화하면서 허용 가능한 수준의 균질성 품질을 유지하는 데 매우 중요하다.[2] 단백질 정제는 '''준비적''' 정제와 '''분석적''' 정제로 나뉜다.
단백질 정제는 크게 '''준비적 정제'''와 '''분석적 정제'''로 나뉜다. 준비적 정제는 상업적 목적 등으로 다량의 단백질을 얻기 위한 것이고, 분석적 정제는 연구를 위해 소량의 단백질을 얻는 것을 목표로 한다.[2][3]
'''준비적 정제'''는 후속 사용을 위해 비교적 많은 양의 정제된 단백질을 생산하는 것을 목표로 한다. 예를 들어 효소(락타아제 등), 영양 단백질(대두 단백질 분리물 등), 특정 생물제약 제품(인슐린 등)과 같은 상업용 제품 제조가 있다. 환자의 건강에 잠재적인 위협이 되는 숙주 세포 단백질과 같은 부산물을 제거하기 위해 여러 준비적 정제 단계가 자주 사용된다.[3]
'''분석적 정제'''는 식별, 정량화, 단백질의 구조, 번역 후 변형 및 기능 연구를 포함한 다양한 연구 또는 분석 목적으로 비교적 적은 양의 단백질을 생산한다. 단백질 정제 계획의 각 단계는 정제 수준과 수율을 고려하여 모니터링된다. 높은 정제 수준과 낮은 수율은 실험할 단백질을 거의 남기지 않는다. 반면에 낮은 정제 수준에서 높은 수율은 연구 목적으로 방해가 되는 많은 오염 물질(관심 있는 단백질 외의 단백질)을 남긴다.[1]
3. 단백질 정제의 단계
단백질 정제 과정 설계를 위해서는 시작 물질 선택이 중요하다. 식물이나 동물에서 특정 단백질은 신체 전체에 균일하게 분포되지 않기 때문에, 단백질 농도가 가장 높은 조직이나 장기를 사용하는 것이 효율적이다.[1] 만약 단백질의 농도가 낮다면, 재조합 DNA 기술을 사용하여 원하는 단백질을 대량으로 생산하는 세포를 개발할 수 있다. 이를 발현 시스템이라고 한다. 재조합 발현을 통해 단백질에 His-tag[5]나 Strep-tag[6]와 같은 태그를 붙여 정제를 용이하게 할 수 있다.
분석적 정제에서는 일반적으로 단백질의 세 가지 속성을 이용하여 분리한다.
일반적으로 단백질 정제 프로토콜에는 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 포함된다. 크로마토그래피의 기본 절차는 단백질이 포함된 용액을 다양한 물질로 채워진 컬럼을 통과시키는 것이다. 서로 다른 단백질은 컬럼 물질과 다르게 상호작용하여 분리된다.[1]
3. 1. 추출
단백질이 유기체에 의해 주변 용액으로 분비되지 않는 경우, 각 정제 과정의 첫 번째 단계는 단백질을 포함하는 세포의 파괴이다. 단백질이 얼마나 깨지기 쉬운지, 세포가 얼마나 안정적인지에 따라 다음과 같은 방법 중 하나를 사용할 수 있다.[4]
마지막으로, 세포 잔해는 차등 원심 분리를 통해 제거할 수 있는데, 이는 균질액을 저속으로 원심 분리한 다음 더 큰 힘으로 다시 원심 분리하여 핵으로 구성된 펠릿과 상등액을 얻는 절차이다. 이를 통해 밀도가 감소하는 여러 분획이 생성되며, 더 차별적인 정제 기술이 하나의 분획에 적용된다.[1]
또한 세포 용해 과정에서 프로테아제가 방출되어 용액 내 단백질을 소화하기 시작한다. 관심 있는 단백질이 단백질 분해에 민감한 경우, 신속하게 진행하고 추출물을 냉각하여 소화를 늦추는 것이 권장된다. 또는 세포 파괴 직전에 용해 완충액에 하나 이상의 프로테아제 억제제를 첨가할 수 있다. 때로는 높은 DNA 함량으로 인해 발생하는 세포 용해물의 점도를 줄이기 위해 데옥시리보뉴클레아제를 첨가해야 할 수도 있다.
3. 2. 원심분리
'''원심분리'''는 액체에 부유된 질량 또는 밀도가 다른 입자의 혼합물을 분리하기 위해 원심력을 사용하는 과정이다. 단백질 또는 세균 세포와 같은 기타 입자 물질의 혼합물이 들어 있는 용기(일반적으로 튜브 또는 병)가 고속으로 회전하면 각 입자의 관성은 입자 질량에 비례하는 입자 속도 방향으로의 힘을 발생시킨다. 이 힘으로 인해 주어진 입자가 액체를 통해 이동하는 경향은 액체가 입자에 가하는 저항에 의해 상쇄된다. 원심분리기에서 샘플을 "회전"시키는 순 효과는 질량이 크고 작으며 밀도가 높은 입자가 질량이 적거나 액체에서 "항력"이 더 큰 입자보다 더 빨리 바깥쪽으로 이동한다는 것이다. 입자 현탁액을 원심분리기로 "회전"시키면 액체에서 항력이 낮고 질량이 가장 큰 입자가 농축된 용기 바닥에 "펠릿"이 형성될 수 있다.
비압축 입자는 대부분 "상청액"이라고 하는 액체에 남아 있으며 용기에서 제거하여 상청액을 펠릿에서 분리할 수 있다. 원심분리 속도는 샘플에 적용되는 각도 가속도에 의해 결정되며, 일반적으로 ''g''에 비교하여 측정된다. 샘플을 충분히 오래 원심분리하면 용기 내의 입자가 평형에 도달하여 입자가 부력 밀도가 원심력과 균형을 이루는 용기 내의 특정 지점에 축적된다. 이러한 "평형" 원심분리를 통해 주어진 입자를 광범위하게 정제할 수 있다.
수크로스 밀도 구배 원심분리—설탕(일반적으로 수크로스, 글리세롤 또는 Percoll과 같은 실리카 기반 밀도 구배 매체)의 선형 농도 구배—는 튜브 내에서 가장 높은 농도가 바닥에 있고 가장 낮은 농도가 상단에 있도록 생성된다. Percoll은 GE 헬스케어(GE Healthcare) 회사에서 소유한 상표이다. 그런 다음 단백질 샘플을 구배 위에 층으로 놓고 초원심분리기에서 고속으로 회전시킨다. 이렇게 하면 무거운 거대 분자가 가벼운 물질보다 튜브 바닥으로 더 빨리 이동한다. 수크로스가 없는 상태에서 원심분리를 하는 동안 입자가 회전 중심에서 점점 더 멀어지면서 더 많은 원심력을 경험한다(멀리 이동할수록 더 빨리 이동한다). 문제는 이것으로 인해 용기 내의 유용한 분리 범위가 관찰 가능한 작은 창으로 제한된다는 것이다. 샘플을 두 배 오래 회전시킨다고 해서 관심 입자가 두 배 더 멀리 이동한다는 의미는 아니며, 실제로 훨씬 더 멀리 이동할 것이다. 그러나 단백질이 수크로스 구배를 통과할 때 밀도와 점도가 증가하는 액체를 만나게 된다. 적절하게 설계된 수크로스 구배는 원심력 증가에 대응하여 입자가 원심장 내에 있는 시간에 비례하여 이동하도록 한다. 이러한 구배로 분리된 샘플을 "속도 구역" 원심분리라고 한다. 단백질/입자를 분리한 후 구배를 분획화하여 수집한다. 생화학에서 초원심분리는 생체 분자를 분리하고 물리적 특성을 분석하는 데 유용하다.[1]
3. 3. 침전 및 용해도 차이를 이용한 분리
대부분의 단백질은 물에 용해되기 위해 약간의 염이 필요하며, 이를 염석이라고 한다. 염의 농도를 높이면 단백질의 용해도가 변화하여 단백질이 침전될 수 있다.[1] 대량 단백질 정제에서 단백질을 분리하는 일반적인 첫 번째 단계는 황산 암모늄(NH4)2SO4을 이용한 침전이다.[7] 황산 암모늄의 양을 늘려가며 첨가하고, 침전된 단백질의 다양한 분획을 수집한다. 그 후, 투석을 사용하여 황산 암모늄을 제거할 수 있다.[1] 황산 암모늄 침전 단계에서 단백질에 존재하는 소수성 기는 대기 중에 노출되어 다른 소수성 기를 끌어당기며, 그 결과 소수성 성분의 응집체가 형성된다. 이 경우 단백질 침전물은 일반적으로 육안으로 볼 수 있다. 이 방법은 매우 많은 양에서도 저렴하게 수행할 수 있다는 장점이 있다.
3. 4. 크로마토그래피를 이용한 분리
일반적으로 단백질 정제 프로토콜에는 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 포함된다. 크로마토그래피의 기본 절차는 단백질이 포함된 용액을 다양한 물질로 채워진 컬럼을 통과시키는 것이다. 서로 다른 단백질은 컬럼 물질과 다르게 상호작용하며, 컬럼을 통과하는 데 필요한 시간 또는 컬럼에서 단백질을 용출하는 데 필요한 조건에 따라 분리할 수 있다. 일반적으로 단백질은 280 nm에서 흡광도를 측정하여 컬럼에서 나오는 대로 감지된다.
분석적 정제에서는 일반적으로 단백질을 분리하기 위해 세 가지 속성을 사용한다.
다양한 크로마토그래피 방법이 존재하며, 주요 내용은 다음과 같다:3. 4. 1. 크기 배제 크로마토그래피 (Size Exclusion Chromatography)
크로마토그래피의 한 종류인 크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography)는 다공성 겔을 사용하여 용액 또는 변성 조건에서 단백질을 크기에 따라 분리하는 방법이다. 겔 투과 크로마토그래피라고도 불리며, 정밀한 분리가 가능하다.
작은 분자는 다공성 매트릭스 내에서 더 큰 부피를 통과해야 하기 때문에, 특정 크기 범위의 단백질은 겔 기둥의 반대쪽 끝에서 수집되기 전에 다양한 부피의 용리액(용매)을 필요로 한다. 더 큰 분자(또는 단백질)는 더 적은 부피를 통과하며, 작은 분자보다 먼저 용출된다.
단백질 정제 과정에서, 용리액은 일반적으로 여러 시험관에 모아진다. 정제하고자 하는 단백질의 흔적이 없는 시험관은 버리고, 나머지 용액에는 정제할 단백질과 크기가 비슷한 다른 단백질이 포함되어 있게 된다.
3. 4. 2. 이온 교환 크로마토그래피 (Ion Exchange Chromatography)
분자 특성을 이용한 크로마토그래피 기술 하나만으로는 보통 고순도 단백질을 얻기에 충분하지 않다.[1] 이온 교환 크로마토그래피는 크기 외에도 이온 전하의 특성과 정도에 따라 화합물을 분리한다. 사용되는 컬럼은 전하의 유형과 강도에 따라 선택된다. 음이온 교환 수지는 양전하를 띠고 있어 음전하를 띤 화합물(음이온)을 유지하고 분리하는 데 사용되며, 양이온 교환 수지는 음전하를 띠고 있어 양전하를 띤 분자(양이온)를 분리하는 데 사용된다.
분리를 시작하기 전에 완충액을 컬럼에 통과시켜 반대 전하를 띤 이온이 평형을 이루도록 한다. 시료를 주입하면 용질 분자는 수지에 있는 결합 부위를 놓고 경쟁하면서 완충액 이온과 교환된다. 각 용질이 컬럼에 머무르는 시간은 전하의 강도에 따라 달라진다. 가장 약하게 하전된 화합물이 먼저 용출되고, 그 다음으로 전하가 강한 순서대로 용출된다. 분리 메커니즘의 특성상 pH, 완충액 유형, 완충액 농도, 온도는 모두 분리를 조절하는 데 중요한 역할을 한다.
이온 교환 크로마토그래피는 단백질 정제에 매우 강력한 도구이며, 분석 및 대량 분리 모두에 자주 사용된다.
3. 4. 3. 소수성 상호작용 크로마토그래피 (Hydrophobic Interaction Chromatography)
HIC 매체는 친수성 및 소수성 영역을 모두 가지고 있어 단백질의 표면 소수성을 기반으로 단백질을 분리할 수 있다. 표적 단백질과 그 생성물 응집 종은 서로 다른 소수성 특성을 갖는 경향이 있으며, HIC를 통해 이를 제거하면 관심 단백질을 추가로 정제할 수 있다.[8] 또한, 사용되는 환경은 일반적으로 다른 크로마토그래피 기술보다 덜 가혹한 변성 조건을 사용하므로 관심 단백질을 고유하고 기능적인 상태로 보존하는 데 도움이 된다. 순수한 물에서는 수지와 단백질의 소수성 영역 간의 상호 작용이 매우 약하지만, 고농도 이온 강도 완충액에서 HIC 수지에 단백질 샘플을 적용하여 이러한 상호 작용을 강화한다. 그런 다음 소수성이 감소하는 순서로 단백질을 용출시키기 위해 완충액의 이온 강도를 줄인다.[9]
3. 4. 4. 친화성 크로마토그래피 (Affinity Chromatography)
친화성 크로마토그래피는 분자 구조를 기반으로 특정 단백질을 매우 선택적으로 분리하는 강력한 기술이다. 이 방법은 종종 특정 용도에 맞게 제작된 수지(resin)를 활용한다. 이러한 수지에는 분리할 화합물에 특이적으로 결합하는 리간드가 표면에 부착되어 있다. 대부분의 경우, 이러한 리간드는 항체-항원 상호작용과 유사하게 작동한다. 리간드와 표적 화합물 사이의 "열쇠와 자물쇠" 결합은 매우 특이적이어서, 종종 단일 피크를 생성하는 반면, 샘플의 다른 모든 물질은 수지에 결합하지 않고 통과한다.
많은 막 단백질은 당단백질이며 렉틴 친화성 크로마토그래피를 통해 정제할 수 있다. 세제에 용해된 단백질은 공유 결합된 렉틴을 갖도록 수정된 크로마토그래피 수지에 결합될 수 있다. 렉틴에 결합하지 않는 단백질은 씻겨 나가고, 특이적으로 결합된 당단백질은 렉틴 결합 부위에서 경쟁하는 고농도의 당을 첨가하여 용출시킬 수 있다. 일부 렉틴은 당과 경쟁하기 어려운 당단백질의 올리고당에 대한 높은 친화도를 가지며, 결합된 당단백질은 렉틴을 변성시켜 방출해야 한다.
면역친화 크로마토그래피면역친화 크로마토그래피는 항체-항원 간의 특이적인 결합을 이용하여 표적 단백질을 선택적으로 정제한다. 이 과정은 고체 기질(예: 다공성 비드 또는 막)에 항체를 고정시키는 것을 포함하며, 항체는 표적 단백질을 선택적으로 결합시키고, 다른 모든 것은 통과시킨다. 표적 단백질은 pH 또는 염도를 변경하여 용출할 수 있다. 고정된 리간드는 항체(예: 면역글로불린 G)일 수도 있고, 단백질 A와 같은 단백질일 수도 있다. 이 방법은 태그를 붙이는 과정을 거치지 않으므로, 자연적인 공급원으로부터 얻은 단백질에 사용할 수 있다.[10]
단백질에 태그를 부착하는 또 다른 방법은 단백질에 항원 펩타이드 태그를 붙이고, 고정화된 항체로 코팅된 수지 컬럼을 통과시켜 단백질을 정제하는 것이다. 이 절차는 면역침강법으로 알려져 있다. 면역침강법은 매우 특이적인 상호작용을 생성하여, 일반적으로 원하는 단백질만 결합시킨다. 정제된 태그 단백질은 용액 내의 다른 단백질로부터 쉽게 분리될 수 있으며, 나중에 깨끗한 용액으로 용출될 수 있다.
태그가 더 이상 필요하지 않을 때는 프로테아제에 의해 잘려나갈 수 있다. 이는 종종 태그와 단백질 사이에 프로테아제 절단 부위를 만드는 것을 포함한다.
자가 절단 태그는 정제 과정에서 관심 대상 단백질로부터 태그를 분리하기 위해 프로테아제를 사용할 필요가 없다는 장점이 있다(예: iCapTag™).[12][13] 태그의 주요 구성 요소는 pH 변화 후에 간단하게 절단되는 인테인이다. 태그가 없는 순수한 표적 단백질은 용출 완충액으로 방출된다.
3. 4. 5. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 고압 액체 크로마토그래피는 컬럼에 고압을 가하여 용질이 더 빠르게 통과하도록 하는 크로마토그래피의 한 형태이다. 이는 확산이 제한되어 분해능이 향상됨을 의미한다. 가장 흔한 형태는 컬럼 재료가 소수성인 "역상" HPLC이다. 단백질은 아세토니트릴과 같은 유기 용매의 양을 증가시키는 구배에 의해 용출되며, 소수성에 따라 분리된다. HPLC로 정제한 후 단백질은 휘발성 화합물만 포함하는 용액에 있게되어 쉽게 동결 건조할 수 있다.[11] HPLC 정제는 종종 정제된 단백질의 변성을 초래하므로 자발적으로 재접힐 수 없는 단백질에는 적용할 수 없다.
3. 5. 자유 흐름 전기영동 (Free-flow electrophoresis)
자유 흐름 전기영동(Free-flow electrophoresis, FFE)은 래미너 완충액 흐름에서 직각 전기장을 사용하여 준비된 단백질 분리를 가능하게 하는 담체 없는 전기영동 기술이다. 예를 들어 양쪽성 전해질에 의해 유도될 수 있는 pH 구배를 활용하여, 이 기술은 0.02 델타-pI 미만의 분해능으로 단백질 동형체를 분리할 수 있다.
4. 정제된 단백질의 농축
단백질 정제가 끝나면 단백질을 농축해야 하는 경우가 많다. 여러 가지 방법이 있다.
단백질 용액에 문제의 단백질 외에 다른 가용성 성분이 포함되어 있지 않다면, 해당 단백질을 동결건조할 수 있다. 이는 HPLC 실행 후 흔히 수행된다. 이 과정은 휘발성 성분을 모두 제거하고 단백질만 남긴다.
한외 여과는 선택적 투과막을 사용하여 단백질 용액을 농축한다. 막의 기능은 단백질을 유지하면서 물과 작은 분자를 통과시키는 것이다. 용액은 기계 펌프, 가스 압력 또는 원심분리에 의해 막으로 밀려진다.[4]
5. 정제 수율 평가
단백질 정제 과정을 평가하기 위해서는 특정 단백질의 양과 총 단백질의 양을 비교해야 한다. 특정 단백질의 양을 측정하는 방법은 다음과 같다.
- 각 단계별로 SDS-PAGE를 수행하여 혼합물 내의 서로 다른 단백질의 양을 대략적으로 측정할 수 있다. 그러나 겉보기 분자량이 유사한 단백질은 구별할 수 없다.
- 단백질이 구별되는 분광학적 특징이나 효소 활성을 가지고 있다면, 이 특성을 이용하여 특정 단백질을 검출하고 정량화할 수 있다.
- 단백질에 대한 항체가 있다면 웨스턴 블롯과 ELISA를 통해 원하는 단백질의 양을 특이적으로 검출하고 정량화할 수 있다.
- 일부 단백질은 수용체 역할을 하며, 리간드 결합 분석(종종 방사성 리간드를 사용)을 통해 정제 단계에서 검출할 수 있다.
총 단백질의 양은 다음 방법으로 측정할 수 있다.
- 브래드포드 총 단백질 정량법
- 280 nm에서 빛의 흡광도
하지만, 정제 과정에서 사용되는 일부 시약이 정량에 간섭할 수 있다. 예를 들어, 이미다졸(폴리히스티딘 태그된 재조합 단백질 정제에 일반적으로 사용됨)은 아미노산 유사체이며 낮은 농도에서 총 단백질 정량에 사용되는 바이신코닌산 (BCA) 분석을 방해한다. 저급 이미다졸의 불순물 또한 280 nm에서 흡수되어 UV 흡광도에서 단백질 농도를 부정확하게 측정할 수 있다.
표면 플라즈몬 공명(SPR)은 칩 표면에서 라벨이 없는 분자의 결합을 감지하여 단백질의 활성 농도를 측정하는 방법이다. 원하는 단백질이 항체인 경우, 결합은 단백질의 활성으로 직접 변환될 수 있다. 단백질의 활성 농도는 총 단백질의 백분율로 나타낼 수 있다. SPR은 단백질 활성 및 전체 수율을 빠르게 결정하는 강력한 방법이 될 수 있지만, 이를 수행하기 위한 장비가 필요하다.
6. 분석
젤 전기 영동은 단백질을 분석하고 정제하는 데 사용되는 일반적인 실험실 기술이다. 전기 영동은 전하를 띤 이온이 전기장 안에서 이동하는 현상을 이용한다.
SDS을 포함하는 용액에서 단백질을 변성시키면, 단백질은 펼쳐지고 음전하를 띤 세제 분자로 코팅된다. SDS-PAGE에서 단백질은 크기에 따라서만 분리된다.
분석 시 단백질은 크기에 따라 밴드로 이동하며, 각 밴드는 쿠마시 블루 염료 또는 은 염색과 같은 염료를 사용하여 확인할 수 있다.
정제 과정에서 변성 조건 전기 영동은 크기 배제 크로마토그래피보다 더 나은 분해능을 제공하지만, 많은 양의 단백질을 처리하는 데는 한계가 있다.
복잡한 단백질 혼합물에서 생리 활성 금속 단백질을 분리하기 위한 비변성 전기 영동 절차는 준비적 네이티브 PAGE이다. 분리된 단백질의 완전성 또는 구조적 무결성은 독립적인 방법으로 확인해야 한다.[14]
6. 1. 변성 조건 전기영동
젤 전기 영동은 조제 및 분석 방법으로 모두 사용할 수 있는 일반적인 실험실 기술이다. 전기 영동의 원리는 전계에서 전하를 띤 이온의 이동에 의존한다. 실제로는 단백질을 세제(SDS)를 포함하는 용액에서 변성시킨다. 이러한 조건에서 단백질은 펼쳐지고 음전하를 띤 세제 분자로 코팅된다. SDS-PAGE에서 단백질은 크기만을 기준으로 분리된다.분석 방법에서 단백질은 크기에 따라 밴드로 이동한다. 각 밴드는 쿠마시 블루 염료 또는 은 염색과 같은 염료를 사용하여 감지할 수 있다. 대량의 단백질을 정제하는 조제 방법에는 전기 영동 젤에서 단백질을 추출해야 한다. 이 추출에는 밴드가 포함된 젤을 절제하거나 젤 끝에서 빠져나갈 때 밴드를 직접 젤에서 용출하는 것이 포함될 수 있다.
정제 전략의 맥락에서 변성 조건 전기 영동은 크기 배제 크로마토그래피보다 향상된 분해능을 제공하지만, 후기 크로마토그래피 컬럼만큼 시료에서 대량의 단백질로 확장되지 않는다.
6. 2. 비변성 조건 전기영동
복잡한 단백질 혼합물에서 생리 활성 금속 단백질을 분리하기 위한 비변성 전기 영동 절차는 준비적 네이티브 PAGE이다. 분리된 단백질의 완전성 또는 구조적 무결성은 독립적인 방법을 통해 확인해야 한다.[14]참조
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논문
Preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (PNC-PAGE): an efficient method for isolating cadmium cofactors in biological systems
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