트리스(히드록시메틸)아미노메테인

1. 개요

트리스(히드록시메틸)아미노메테인(THAM)은 생물학 및 생화학 실험에서 널리 사용되는 완충제이다. 니트로메탄과 포름알데히드를 반응시켜 합성하며, 25°C에서 pKa는 8.06으로 실온에서 7.1에서 9.1 사이의 pH 범위를 유지한다. 완충액의 pH는 온도와 농도에 따라 변화하며, 여러 효소와 단백질을 억제할 수 있다는 단점이 있다. 생물학적, 의학적, 산업적 용도로 사용되며, 특히 생화학 실험, 백신 구성 성분, 대사성 산증 치료, 계면활성제 및 가황 촉진제 합성에 활용된다.

2. 화학적 특성 및 합성

트리스는 염기성 조건에서 니트로메테인과 포름알데히드를 축합 반응시켜 중간체 (HOCH₂)₃CNO₂를 생성하고, 이를 수소화하여 산업적으로 제조된다.

2.1. 합성

트리스(히드록시메틸)아미노메테인은 니트로메탄과 포름알데히드를 1:3의 몰 수 비로 하여 합성된다. 이때 농축 알코올(메탄올 + 2~5% 메틸렌클로라이드) 환경에서 섭씨 50도의 온도를 유지하며, 3~36시간 동안 반응시킨다. 촉매로는 소듐 혹은 포타슘을 고체 형태로 사용하며, 니트로메탄 1몰당 1~10 밀리그램당량을 첨가한다.

2.2. 완충 작용 (Buffering features)

트리스의 짝산은 25°C에서 8.07의 pKa 값을 가지며, 7.1에서 9.1 사이의 pH 범위에서 효과적인 완충 작용을 한다. 트리스는 온도 의존성이 커서 온도가 1℃ 상승할 때마다 pH는 약 0.028 감소하며, 10배 희석 시 pH는 0.03~0.05 정도 감소한다. 따라서 유효 완충 범위는 온도와 농도에 따라 달라지지만, pH 7~9 정도이다.

트리스는 비교적 저렴하여 널리 사용되지만, 일급 아민이 단백질과 반응하여 다양한 생화학 반응을 저해하고 포유류 세포에 독성을 나타낼 수 있다. 이러한 단점을 피하기 위해 HEPES와 같은 대체 물질이 사용되기도 한다.

2.2.1. 완충액 상세 정보 (Buffer details)

트리스의 짝산은 25°C에서 8.07의 pK_a를 가지며, 이는 완충액이 실온에서 7.1에서 9.1 사이(pK_a ± 1)의 효과적인 pH 범위를 가진다는 것을 의미한다.

일반적으로 온도가 25°C에서 5°C로 내려가면 트리스 완충액의 pH는 도당 평균 0.03 단위 증가한다. 온도가 25°C에서 37°C로 상승하면 트리스 완충액의 pH는 도당 평균 0.025 단위 감소한다.

일반적으로 트리스 완충액 농도가 10배 증가하면 pH가 0.05 단위 증가하며 그 반대도 마찬가지이다.

은을 포함하는 단일 접합 pH 전극(예: 염화은 전극)은 Ag-트리스 침전물이 형성되어 접합부를 막기 때문에 트리스와 호환되지 않는다. 이중 접합 전극은 이 문제에 저항력이 있으며, 은을 포함하지 않는 전극은 면역이다.

트리스의 pK_a는 온도 의존성이 높기 때문에, 완충액의 pH는 온도가 1℃ 상승할 때마다 약 0.028 감소한다. 또한 10배 희석할 때마다 pH는 0.03~0.05 정도 감소한다. 따라서 유효 완충역도 사용하는 온도, 농도에 따라 변화하지만, pH 7~9 정도이다.

2.2.2. 완충 작용 억제 (Buffer inhibition)

트리스는 여러 효소의 활성을 억제하며, 따라서 단백질 연구에 사용할 때 주의해야 한다. 트리스는 금속 이온을 킬레이션하여 효소 활성을 억제하기도 한다.

3. 제조 (Preparation)

트리스는 염기성 조건에서 니트로메테인과 포름알데히드의 축합 반응(반복적인 헨리 반응)으로 중간체 (HOCH₂)₃CNO₂를 생성하고, 이를 수소화하여 산업적으로 제조한다.

4. 용도 (Uses)

트리스는 생물학 및 생화학 실험실에서 가장 흔히 사용되는 완충제 중 하나로, 대부분 생물체의 전형적인 생리적 pH와 일치하는 유용한 완충 범위(pH 7–9)를 가진다. 이러한 특성과 저렴한 비용 덕분에 널리 사용된다. 트리스는 화학 분석에서 산 용액 표준화에 사용되는 1차 표준 물질이기도 하다.

트리스는 세포막의 투과성을 높이는 데 사용되며, 모더나 COVID-19 백신과 5세에서 11세 사이의 어린이를 위한 화이자-바이오엔테크 COVID-19 백신의 구성 요소이기도 하다.

트리스의 산 해리 상수는 온도 의존성이 높기 때문에, 완충액의 pH는 온도가 1℃ 상승할 때마다 약 0.028 감소하며, 10배 희석할 때마다 pH는 0.03~0.05 정도 감소한다.

하지만 트리스는 일급 아민이 단백질과 반응하기 때문에 다양한 생화학 반응을 저해하고, 포유류 세포에 대한 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이러한 단점을 피하기 위해 HEPES가 자주 사용된다.

4.1. 생화학 및 분자생물학적 응용

트리스는 대부분 생물체의 생리적 pH와 일치하는 완충 범위(pH 7–9)를 가지기 때문에 생체 분자 연구에 유용하다. 저렴한 가격 덕분에 생물학 및 생화학 실험실에서 가장 흔히 사용되는 완충제 중 하나가 되었다.

트리스는 세포막의 투과성을 높이는 데 사용되며, 모더나 COVID-19 백신과 5세에서 11세 사이의 어린이를 위한 화이자-바이오엔테크 COVID-19 백신의 구성 요소이기도 하다.

트리스의 산 해리 상수는 온도에 따라 크게 변하기 때문에 주의해야 한다. 온도가 1℃ 상승할 때마다 pH는 약 0.028 감소하며, 10배 희석할 때마다 pH는 0.03~0.05 정도 감소한다.

트리스는 널리 사용되지만, 일급 아민이 단백질과 반응하여 다양한 생화학 반응을 저해하고 포유류 세포에 독성을 나타낼 수 있다는 단점이 있다. 이러한 단점을 피하기 위해 HEPES와 같은 대체 물질이 사용되기도 한다.

트리스는 핵산(DNA, RNA) 및 단백질 연구, 세포 배양 등에 널리 사용되며, TAE, TBE, TE 완충액 등 다양한 완충액 제조에 사용된다.

4.1.1. TAE 완충액 (TAE Buffer)

TAE 완충액은 트리스(트리스(히드록시메틸)아미노메테인)와 아세트산(Acetate), 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)으로 구성된 완충액으로, 아가로스 젤 전기영동으로 핵산을 분리하는 데 사용된다. 이 완충액을 대량으로 사용하는 경우에는 50배 (또는 10배) 농도의 스톡 용액을 제조하여 필요할 때 희석하여 사용하는 경우가 많다.

조성은 다음과 같다.
* Tris/Tris-acetate 40 mM
* EDTA 1mM

pH는 50배 스톡 용액의 경우 8.3인 경우가 많지만 다양하다. 또한 발열을 억제할 목적으로 0.5배 농도로 사용하는 경우도 있다. 완충능이 비교적 약하기 때문에, 장시간 전기영동을 하면 양극 쪽의 pH가 산성으로 기울어질 수 있다. DNA는 TBE를 사용했을 때에 비해 1할 정도 빠르게 전기영동된다. 긴 DNA 단편의 분리능이 좋아서 사우던 블롯에 사용되는 경우가 많다.

4.1.2. TBE 완충액 (TBE Buffer)

TBE 완충액은 트리스(트리스)와 붕산, 에틸렌 다이아민 테트라아세트산(EDTA)으로 구성된 완충액으로, 아가로스 젤 전기영동으로 핵산을 분리하는 데 사용된다. 이 완충액은 10배 농도의 스톡 용액을 만들어 필요에 따라 희석하여 사용하는 경우가 많다.

pH는 8.3이 많이 사용되지만 다양하다. TAE와 TBE는 거의 같은 목적으로 사용되지만, TBE가 완충 능력이 높고 분리가 잘 된다는 특징이 있다. 반대로 TAE는 저렴하기 때문에 일상적으로 사용된다.

4.1.3. TE 완충액 (TE Buffer)

TE 완충액은 트리스(Tris)와 EDTA으로 구성된 완충액으로, DNA나 RNA를 이용한 실험에 사용되는 기본적인 완충액이다. 트리스를 사용하여 pH를 약알칼리성으로 유지함으로써 핵산을 탈프로톤화하여 침전을 방지한다. EDTA는 뉴클레아제 활성에 필요한 마그네슘과 같은 2가 양이온을 킬레이트하여 DNA나 RNA의 분해를 방지하기 위해 첨가된다.

RNA용은 pH 7.5, DNA용은 8.0으로 조정하는 관례가 있으며, 이는 1980년대에 수행된 뉴클레아제 연구를 기반으로 각 뉴클레아제의 활성이 가장 낮아지도록 설정된 값이다. 그러나 실제로는 약알칼리성이면 어느 쪽이든 상관없다고 생각된다.

4.1.4. 트리스 염산 완충액 (Tris-HCl Buffer)

트리스 염산 완충액은 트리스를 사용한 가장 단순한 완충액이다. 트리스 수용액(pH 10.5 정도)에 염산을 적가하여 원하는 pH로 조절하여 사용한다. 이 경우 염산의 중화열, 희석열에 의해 용액 온도가 상승하므로 pH 측정은 온도 보정을 하거나, 사용 온도에 방치한 후에 수행해야 한다. 대신 트리스와 트리스 염산염을 혼합하여 조제하는 방법도 있다.

단독으로 사용하는 것 외에 1M(mol/L) 농도로 pH를 조절해 두고, 이를 희석하여 후술할 TE 완충액 등의 조제에 사용하는 경우도 많다. 이 경우 희석에 의해 pH가 약간(0.1 정도) 벗어난다. 트리스에 의한 완충액을 사용하는 일상적인 용도에서는 실해는 적지만, 정확성이 손상되므로 주의해야 한다.

4.1.5. 트리스 완충 생리 식염수 (Tris-Buffered Saline, TBS)

트리스 완충 생리 식염수(Tris-Buffered Saline)는 트리스와 염화 나트륨으로 구성된 완충액으로, 일반적으로 TBS로 약칭된다. 인산 완충 생리 식염수(PBS)를 사용할 수 없는 경우 대신 사용되며, 특히 면역학적 실험에서 널리 사용된다. 다음은 가장 단순한 조성이며, PBS와 마찬가지로 처방이 매우 다양하므로 주의해야 한다.

4.2. 의학적 응용 (Medical)

트리스(일반적으로 THAM으로 알려짐)는 대사성 산증 치료에 탄산수소나트륨의 대안으로 사용된다. 또한 모더나 COVID-19 백신과 5세에서 11세 사이의 어린이를 위한 화이자-바이오엔테크 COVID-19 백신의 구성 요소이다.

4.3. 기타 응용

계면활성제, 가황 촉진제 등을 합성하는 중간체로 사용되며, 적정의 표준 물질로 사용된다.

5. 한계 및 대체 물질

트리스는 일급 아민이므로 단백질과 반응하여 다양한 생화학 반응을 저해하는 것으로 알려져 있다. 또한 포유류 세포에 대한 독성을 나타낸다. 이러한 단점을 극복하기 위해 HEPES와 같은 대체 완충제가 사용되기도 한다.