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아가로스

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목차

1. 개요

아가로스는 우뭇가사리에서 추출한 한천에서 아가로펙틴을 정제하여 얻는 다당류의 일종이다. 약 120,000의 분자량을 가지는 선형 고분자로, 겔 전기영동, 단백질 정제, 고체 배양 배지, 미생물 운동성 분석 등 다양한 분야에서 활용된다. 아가로스는 끓는 물에 녹아 냉각 시 겔을 형성하며, 겔화 온도와 용융 온도 사이에는 히스테리시스 현상이 나타난다.

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아가로스
기본 정보
분자식(C12H14O5)n
CAS 등록번호9012-36-6
PubChem CID23673664
화학 구조 정보PubChem
특성
화학식(C12H18O9)n
밀도1.6 g/cm3
녹는점85 °C (185 °F; 358 K)
끓는점416.1 °C (781.0 °F; 689.2 K)
관련 화합물
관련 다당류한천
추가 정보
설명홍조류에서 추출한 다당류
용도겔 전기 영동
배양 배지

2. 정의

아가로스는 다당류의 일종으로, 우뭇가사리에서 추출한 한천에서 아가로펙틴을 정제하여 만든다.

2. 1. 구조

아가로스는 α-(1→3) 및 β-(1→4) 글리코사이드 결합으로 연결된 D-갈락토스와 3,6-안하이드로-L-갈락토피라노스가 교대로 연결된 분자량이 약 120,000인 선형 고분자이다. 3,6-안하이드로-L-갈락토피라노스는 3과 6 위치 사이에 무수 다리가 있는 L-갈락토스이지만 중합체의 일부 L-갈락토스 단위에는 다리가 포함되어 있지 않을 수 있다. 일부 D-갈락토스 및 L-갈락토스 단위는 메틸화될 수 있으며, 피루브산 및 황산염도 소량으로 발견된다.[28]

아가로스 중합체의 반복 단위 구조


각 아가로스 사슬은 약 800개의 갈락토스 분자를 포함하고, 아가로스 중합체 사슬은 20nm에서 30nm 반경의 초나선 구조로 응집되는 나선형 섬유를 형성한다.[29] 섬유는 준강성이며 아가로스 농도에 따라 길이가 다양하다.[30] 고형화되면 섬유는 사용된 아가로스의 농도에 따라 50nm에서 200nm 범위의 직경 채널의 3차원 메쉬를 형성한다. 농도가 높을수록 평균 기공 직경이 낮아진다. 3차원 구조는 수소 결합으로 유지되므로 액체 상태로 다시 가열하면 붕괴될 수 있다.

2. 2. 아가로스와 아가의 차이점

아가는 한천을 나타내며, 아가로스(agarose)는 아가에서 아가로펙틴을 제거하여 만든 것이다. 배지를 고체화시키는 과정에서 사용하는 것은 아가이다. 아가는 액체 배지를 고체 배지로 만드는 과정에서 사용된다.

3. 특성

아가로스는 끓는 물에 거의 용해되고 냉각될 때 겔을 형성하는 백색 분말이다. 아가로스는 액체에서 겔로 전이될 때 열 히스테리시스 현상을 나타내는데, 이는 겔화 온도와 용융 온도가 서로 다르다는 것을 의미한다. 겔 내의 아가로스는 기공을 포함하는 그물망을 형성하며, 기공의 크기는 첨가되는 아가로스의 농도에 의존한다. 아가로스 겔은 서 있을 때 이수 현상(겔 표면을 통한 물의 압출)이 일어나기 쉽지만, 이 과정은 겔의 사용을 방해하지 않을 만큼 충분히 느리다.[33][34]

아가로스 겔은 낮은 농도에서 높은 겔 강도를 가질 수 있어 겔 전기영동을 위한 대류 방지 매질로 적합하다. 0.15%로 희석된 아가로스 겔로도 겔 전기영동을 위한 슬래브를 형성할 수 있다.[35]

3. 1. 겔화 및 용융 온도

아가로스는 끓는 물에 거의 용해되고 냉각될 때 겔을 형성하는 백색 분말로 제공된다. 아가로스는 액체에서 겔로 전이될 때 열 히스테리시스 현상을 나타내는데, 이는 겔화 온도와 용융 온도가 서로 다르다는 것을 의미한다. 겔화 및 용융 온도는 아가로스의 유형에 따라 다르다. 우뭇가사리에서 추출한 표준 아가로스는 겔화 온도가 34–38°C이고 녹는 온도는 90–95°C인 반면, 꼬시래기에서 추출한 아가로스는 더 높은 메톡시 치환으로 인해 겔화 온도가 40–52°C이고 용융 온도는 85–90°C이다.[31] 용융 및 겔화 온도는 특히 1% 미만의 낮은 겔 농도에서 겔의 농도에 따라 달라질 수 있다. 따라서 겔화 및 용융 온도는 지정된 아가로스 농도에서 제공된다.

천연 아가로스는 전하를 띠지 않는 메틸기를 함유하고 있으며, 메틸화 정도는 겔화 온도에 정비례한다. 그러나 합성 메틸화는 반대 효과가 있어 메틸화가 증가하면 겔화 온도가 낮아진다.[32] 화학적 변형을 통해 용융 및 겔화 온도가 다른 다양한 화학적 변형 아가로스를 사용할 수 있다.

3. 2. 전기삼투 (EEO)

아가로스 중합체는 피루브산과 황산염을 포함한 하전된 그룹을 포함한다.[36] 이러한 음전하를 띤 그룹은 전기삼투(electroendosmosis, EEO)[37]라고 하는 과정에서 DNA 분자의 이동을 늦출 수 있다. 따라서 낮은 EEO 아가로스가 일반적으로 핵산의 아가로스 겔 전기영동에 사용하는 것이 바람직하다. 제로 EEO 아가로스도 사용 가능하지만, 후속 효소 반응에 영향을 줄 수 있는 양전하 그룹을 추가하여 만들 수 있으므로 일부 응용 분야에서는 바람직하지 않을 수 있다.[38] 전기삼투는 한천의 아가로펙틴이 상당량의 음전하를 띤 황산염 및 카복실기를 포함하기 때문에 아가로스가 한천보다 우선적으로 사용되는 이유이다. 아가로스에서 아가로펙틴을 제거하면 EEO가 실질적으로 감소할 뿐만 아니라 겔 매트릭스에 대한 생체분자의 비특이적 흡착도 감소한다. 그러나 혈청 단백질의 전기영동과 같은 일부 응용 분야에서는 높은 EEO가 바람직할 수 있으며, 사용되는 젤에 아가로펙틴을 첨가할 수 있다.[39]

3. 3. 저융점 아가로스

아가로스는 끓는점에 가까운 물에 녹는 흰색 분말 형태로, 냉각되면 젤을 형성한다. 아가로스는 액체에서 젤로 변할 때 히스테리시스 현상을 보여, 젤화 온도와 용융 온도가 다르다. 젤화 및 용융 온도는 아가로스의 종류에 따라 달라진다. 표준 아가로스는 젤화 온도가 34°C 에서 38°C이고 용융 온도가 90°C 에서 95°C이지만, 메톡시 치환체가 많은 ''그라실라리아''에서 추출한 아가로스는 젤화 온도가 40°C 에서 52°C이고 용융 온도가 85°C 에서 90°C이다.[8]

천연 아가로스는 메틸기를 함유하고 있는데, 메틸화 정도는 젤화 온도에 정비례한다. 그러나 합성 메틸화는 반대로 젤화 온도를 낮춘다.[9] 다양한 화학적 변형을 통해 융점과 젤화 온도가 다른 아가로스를 만들 수 있다.

아가로스 젤은 낮은 농도에서도 높은 젤 강도를 가져 젤 전기영동에 사용된다. 아가로스 중합체는 피루브산과 황산염 등 하전된 그룹을 포함하는데, 이러한 음전하 그룹은 전기삼투(EEO) 과정에서 DNA 이동을 늦출 수 있다. 따라서 핵산의 아가로스 젤 전기영동에는 '''저 EEO (LE) 아가로스'''가 선호된다.

'''저융점(LMP) 아가로스'''는 하이드록시에틸화를 통해 만들어진다. 이 과정은 수소 결합 수를 줄여 표준 아가로스보다 융해 및 겔화 온도를 낮춘다.[15] LMP 아가로스는 30°C 에서 35°C 범위에서 액체 상태를 유지할 수 있어, 효소를 이용한 조작을 용융 젤 조각을 반응 혼합물에 첨가하여 직접 수행할 수 있다. LMP 아가로스는 황산염이 적어 일부 효소 반응에 유리하다.

하이드록시에틸화 아가로스는 표준 아가로스보다 작은 기공 크기(~90 nm)를 가진다.[16] 이는 전기영동 시 시간과 분리에 영향을 줄 수 있다.[17] 초저융점 아가로스는 8°C 에서 15°C에서 겔화될 수 있다.

4. 활용

아가로스는 물리적, 화학적, 열적 안정성이 뛰어나고 화학적 복잡성이 낮아 생체 분자와 상호 작용할 가능성이 적기 때문에 단백질 및 핵산 작업에 선호되는 물질이다. 아가로스는 아가로스 겔 전기 영동에서 분석 규모의 전기영동 분리를 위한 매질로 가장 일반적으로 사용된다. 정제된 아가로스로 만든 겔은 구멍 크기가 상대적으로 커서 200킬로달톤 이상의 단백질 및 단백질 복합체와 100개 염기쌍 이상의 DNA 단편을 분리하는 데 유용하다.

아가로스는 면역 확산 및 면역 전기 영동과 같이 다른 여러 응용 분야에도 널리 사용되는데, 이는 아가로스 섬유가 면역복합체의 앵커 역할을 할 수 있기 때문이다. 또한 아가로스 겔 매트릭스는 단백질 정제에 자주 사용되며, 한천 대신 미생물 배양을 위한 고체 배지로 활용될 수 있다. 아가로스는 미생물의 운동성 및 이동성 측정에도 사용된다.

4. 1. 겔 전기영동

아가로스 겔 전기영동은 실험실에서 DNA를 분리하는 데 사용되는 일반적인 방법이다. 아가로스 겔은 아크릴아마이드 겔보다 DNA에 대한 분해능이 낮지만 분리 범위가 더 넓기 때문에 일반적으로 50~20,000 bp (염기쌍) 길이의 DNA 조각에 사용된다. 하지만 펄스장 겔 전기 영동(PFGE)을 사용하면 6Mb 이상의 분해능도 가능하다.[40][18] 또한, 큰 단백질 분자를 분리하는 데에도 사용할 수 있으며, 유효 반지름이 5-10 nm보다 큰 입자의 겔 전기 영동에 선호되는 매트릭스이다.[35][19]

겔의 기공 크기는 체질할 수 있는 DNA의 크기에 영향을 미친다. 겔의 농도가 낮을수록 기공 크기가 커지고 체질할 수 있는 DNA의 크기가 커진다. 그러나 저농도 겔(0.1 - 0.2%)은 깨지기 쉬워서 취급하기 어렵고, 큰 DNA 분자의 전기 영동에는 며칠이 걸릴 수 있다. 표준 아가로스 겔 전기 영동의 분해능 한계는 약 750 kb이다.[41][18] 이러한 한계는 교류 직교 전기장을 겔에 가하는 PFGE로 극복할 수 있다. DNA 조각은 가해지는 전장이 방향을 바꿀 때 스스로 재배열되지만, 큰 DNA 분자는 전장이 변경될 때 재정렬하는 데 더 오래 걸리는 반면, 작은 DNA 분자는 더 빨리 재정렬되므로 DNA를 크기에 따라 분획할 수 있다.

아가로스 겔은 몰드에 주조되며, 굳으면 일반적으로 완충 용액에 수평으로 잠겨서 작동한다. 트리스-아세테이트-EDTA 및 트리스-보레이트-EDTA 완충액이 일반적으로 사용되지만, 다른 응용 분야에서는 트리스-인산, 바르비투르산-나트륨 바르비투르산 또는 트리스-바르비탈 완충액과 같은 다른 완충액을 사용할 수도 있다.[26][1] DNA는 일반적으로 에티듐 브로마이드로 염색한 후 자외선 하에서 관찰하여 시각화하지만, SYBR Green, GelRed, 메틸렌 블루, 크리스탈 바이올렛과 같은 다른 염색 방법도 사용할 수 있다. 분리된 DNA 조각을 추가적인 다운스트림 실험에 사용할 경우, 겔에서 잘라내어 조각으로 분리하여 추가적으로 조작할 수 있다.

에티듐 브로마이드로 염색하고 UV 투과 장치에서 UV 광선으로 시각화한 DNA 밴드가 있는 아가로스 겔.

4. 2. 단백질 정제

아가로스 겔 매트릭스는 단백질 정제에 자주 사용된다. 예를 들어 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피와 같은 컬럼 기반 분취 규모 분리에 사용된다.[42] 그러나 연속 겔로 사용되지 않고 다공성 비드 또는 다양한 미세도의 수지로 형성된다.[42] 비드는 단백질이 비드를 통해 자유롭게 흐를 수 있도록 다공성이 높다. 이러한 아가로오스 기반 비드는 일반적으로 부드럽고 쉽게 부서지기 때문에 중력 흐름, 저속 원심 분리 또는 저압 절차에서 사용해야 한다.[43] 수지의 강도는 가교결합 및 아가로스 수지의 화학적 경화를 증가시켜 개선할 수 있지만 이러한 변화는 친화성 크로마토그래피와 같은 일부 분리 절차에서 단백질에 대한 결합 능력을 저하시킬 수도 있다.

아가로스는 생체분자를 상당한 정도로 흡수하지 않고 우수한 흐름 특성을 가지며 극한의 pH 및 이온 강도뿐만 아니라 8M 우레아 또는 6M 구아니딘 HCl과 같은 고농도 변성제에도 견딜 수 있기 때문에 크로마토그래피에 유용한 물질이다.[44] 겔 여과 크로마토그래피를 위한 아가로스 기반 매트릭스의 예로는 세파로스 및 WorkBeads 40 SEC(교차 결합 비드 아가로스), Praesto 및 수퍼로스(고도로 가교 결합 비드 아가로오스), Superdex(아가로스에 공유 결합된 덱스트란)가 있다.

친화성 크로마토그래피의 경우, 비드가 있는 아가로오스는 단백질에 결합하는 리간드의 부착을 위해 가장 일반적으로 사용되는 매트릭스 수지이다.[45] 리간드는 스페이서를 통해 아가로오스 비드 폴리머의 활성화된 하이드록실 그룹에 공유적으로 연결된다. 관심 있는 단백질은 리간드에 선택적으로 결합되어 다른 단백질과 분리된 후 용출될 수 있다. 사용된 아가로스 비드는 일반적으로 단백질에 대한 높은 결합 능력을 갖는 4% 및 6% 밀도이다.

4. 3. 고체 배양 배지

아가로스 플레이트는 유기체 배양을 위해 한천 대신 사용할 수 있는데, 한천에는 유기체의 성장이나 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 일부 후속 절차에 영향을 줄 수 있는 불순물이 포함될 수 있기 때문이다. 아가로스는 한천보다 단단하기 때문에 더 큰 겔 강도가 필요한 경우 바람직하며, 낮은 겔화 온도는 겔화 전에 세포가 액체에 현탁될 때 유기체에 열 충격을 유발하는 것을 방지할 수 있다. 엄격한 독립영양 세균, 식물 원형질체[46], 예쁜꼬마선충[47], 기타 유기체 및 다양한 세포주의 배양에 사용할 수 있다.

4. 4. 운동성 분석

미생물 운동성과 이동성을 측정하기 위해 때때로 한천 대신 아가로스가 사용된다. 운동성 종은 다공성 겔 전체에 걸쳐 느리지만 이동할 수 있으며 침투 속도를 시각화할 수 있다. 겔의 다공성은 배지 내 한천 또는 아가로스의 농도와 직접적으로 관련이 있으므로 다른 농도의 겔을 사용하여 세포의 수영, 스와밍, 활공 및 경련 운동성을 평가할 수 있다. Under-아가로스 세포 이동 분석은 주화성과 화학운동성을 측정하는 데 사용할 수 있다. 아가로스 겔 층은 세포 집단과 화학적 유인 물질 사이에 배치된다. 농도 구배가 겔로의 화학 유인 물질의 확산에서 발생함에 따라 이동하기 위해 다른 자극 수준이 필요한 다양한 세포 집단은 구배를 따라 중력에 대해 겔을 통해 위쪽으로 터널링할 때 현미경 사진을 사용하여 시간이 지남에 따라 시각화할 수 있다.[1]

참조

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[2] 논문 Structure of the agarose component of agar-agar 1956
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