단백질의 결정

"오늘의AI위키"는 AI 기술로 일관성 있고 체계적인 최신 지식을 제공하는 혁신 플랫폼입니다.
"오늘의AI위키"의 AI를 통해 더욱 풍부하고 폭넓은 지식 경험을 누리세요.

1. 개요

단백질의 결정은 단백질 분자를 결정화하는 과정과 관련된 연구 분야이다. 150년 이상 연구가 진행되었으며, 1840년 지렁이 혈액 샘플에서 결정 물질을 발견한 것을 시작으로, 헤모글로빈 결정화 연구가 이루어졌다. 단백질 결정화는 열역학적 원리에 따라 진행되며, 핵 생성과 결정 성장 단계를 거친다. 증기 확산법, 마이크로배치법, 미세투석법 등 다양한 방법이 사용되며, pH, 온도, 화학 첨가제 등의 요인이 결정화에 영향을 미친다. 고속 결정화 스크리닝, 단백질 공학 기술을 활용하여 결정화 성공률을 높이며, X선 회절 등을 통해 단백질의 구조를 분석하고, 제약 및 구조 생물학 분야에 활용된다.

더 읽어볼만한 페이지

결정학 - 점군
점군은 도형의 병진 조작을 제외한 대칭 조작들의 집합으로 군론의 공리를 만족하며, 쉐인플리스 기호나 허먼-모건 기호로 표기되고, 대칭 조작에 대응하는 행렬 표현은 가약 표현과 기약 표현으로 분해될 수 있다.
결정학 - 역격자
역격자는 브라베 격자의 쌍대 개념으로, 해당 격자의 모든 벡터와의 내적이 정수가 되는 벡터들의 집합으로 정의되며, 결정 구조 분석 및 블로흐 정리와 관련된 브릴루앙 영역 연구에 활용되는 또 다른 브라베 격자이다.
단백질 구조 - 메틸화
메틸화는 메틸기를 분자에 첨가하는 과정으로, 생물학에서 유전자 발현 조절 등 생명현상에 관여하고 유기화학에서 유기 합성에 활용되며, 다양한 생물종에 존재하는 중요한 생리적 과정이다.
단백질 구조 - 녹색 형광 단백질
녹색 형광 단백질(GFP)은 해파리에서 발견된 단백질로, 특정 파장의 빛을 흡수하여 녹색 형광을 방출하며, 자체 발색단 형성 능력과 유전자 조작을 통한 개량형 개발로 생물학 연구에서 리포터 유전자로 널리 사용되지만, 실험 결과 해석 시 주의가 필요하고 대체 기술 또한 개발 중이다.

단백질의 결정
개요
리소자임의 결정 구조
정의	단백질 결정화는 단백질 분자를 규칙적인 3차원 격자로 배열하여 결정을 형성하는 과정임.
관련 분야	구조 생물학 생화학 재료 과학
중요성
구조 결정	결정화된 단백질은 X선 결정학을 통해 원자 수준의 구조를 결정하는 데 사용될 수 있음.
약물 개발	단백질 구조 기반의 약물 설계에 필수적임.
연구	단백질의 기능, 상호 작용, 질병 메커니즘 연구에 중요한 도구임.
과정
용액 준비	고순도 단백질 샘플을 적절한 완충 용액에 용해함.
과포화	단백질 농도를 용해도 이상으로 높여 과포화 상태를 유도함.
핵 형성	초기 결정 핵이 형성되는 단계.
결정 성장	핵에 단백질 분자가 부착되어 결정 크기가 커지는 단계.
방법
증기 확산법	현적법 역 현적법
투석법	막을 이용하여 용매를 제거하여 과포화를 유도함.
배치법	단백질 용액과 침전제를 혼합하여 방치함.
자유 계면 확산법	두 용액의 계면에서 결정이 성장하도록 함.
미세 배치법	작은 부피의 용액을 사용하여 결정화함.
고려 사항
단백질 순도	높은 순도의 단백질이 필요함.
용해도	단백질의 용해도를 조절해야 함.
pH	최적의 pH 조건이 필요함.
온도	온도 변화가 결정 성장에 영향을 미침.
첨가제	염, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 유기 용매 등을 사용하여 결정화를 촉진함.
결정 품질 향상
시드 결정	작은 결정 조각을 넣어 핵 형성을 유도함.
미세 조정	pH, 온도, 침전제 농도를 미세하게 조절함.
돌연변이 유발	단백질의 특정 부위를 변경하여 결정성을 높임.
응용
구조 기반 약물 설계	질병 표적 단백질의 구조를 이용하여 약물을 개발함.
효소 활성 연구	효소의 활성 부위 구조를 분석하여 반응 메커니즘을 연구함.
단백질 공학	단백질 구조 정보를 바탕으로 원하는 기능을 갖도록 단백질을 개량함.

2. 역사

단백질 분자가 결정화될 수 있다는 사실은 19세기 중반부터 알려져 왔다.^[6] 이후 여러 과학자들의 노력을 통해 단백질 결정을 얻고 분석하는 기술이 발전했으며, X선 결정학과 같은 방법을 통해 단백질의 3차원 구조를 밝히는 것이 가능해졌다. 오늘날 단백질 결정 구조 연구는 생화학 및 의학 분야에서 매우 중요한 역할을 하고 있다.

2. 1. 초기 연구

150년 이상 동안, 전 세계의 과학자들은 단백질 분자의 결정화에 대해 알고 있었다.^[6]

1840년, 프리드리히 루드비히 휘네펠트(Friedrich Ludwig Hünefeld)는 두 개의 유리 슬라이드 아래에 보관된 지렁이 혈액 샘플에서 결정 물질이 형성되는 것을 우연히 발견했으며, 건조된 돼지 또는 인간 혈액 샘플에서도 작은 판 모양의 결정을 관찰했다. 이 결정들은 1864년 펠릭스 호페-자일러(Felix Hoppe-Seyler)에 의해 '헤모글로빈'으로 명명되었다. 휘네펠트의 발견은 이후 단백질 결정 연구에 중요한 기초를 마련했다.^[7]

1851년, 오토 푼케(Otto Funke)는 순수한 물, 알코올 또는 에테르와 같은 용매로 적혈구를 희석한 후, 단백질 용액에서 용매를 천천히 증발시켜 인간 헤모글로빈 결정을 생성하는 구체적인 방법을 설명했다. 이어서 1871년, 예나 대학교의 교수인 윌리엄 T. 프레이어(William T. Preyer)는 약 50종의 다양한 동물(포유류, 조류, 파충류, 어류)의 헤모글로빈 결정 특징을 상세히 기술한 책 ''Die Blutkrystalle''(피의 결정)를 출판하여 헤모글로빈 결정 연구를 진전시켰다.^[7]

1909년에는 생리학자 에드워드 T. 라이처트(Edward T. Reichert)와 광물학자 아모스 P. 브라운(Amos P. Brown)이 협력하여, 태즈메이니아 늑대와 같은 멸종된 종을 포함한 수백 종의 동물에서 얻은 헤모글로빈 결정의 제조법, 생리학적 특성, 기하학적 구조에 대한 포괄적인 논문을 발표했다. 이러한 연구들을 통해 단백질 결정에 대한 이해가 점차 깊어졌다.^[7]

단백질 결정 연구의 중요한 전환점은 1934년에 마련되었다. 존 데스몬드 버널과 그의 제자 도로시 호지킨은 단백질 결정이 건조된 상태보다 원래의 용액(모액)에 둘러싸여 있을 때 더 선명한 회절 패턴을 보인다는 사실을 발견했다. 그들은 펩신 결정을 이용하여 젖은 상태의 구형 단백질에서 최초로 뚜렷한 회절 패턴을 얻는 데 성공했다. 버널과 호지킨 이전의 단백질 결정학 연구는 주로 건조된 결정을 대상으로 이루어져 일관성 있고 신뢰할 만한 결과를 얻기 어려웠으나, 이들의 발견은 단백질 구조 분석의 새로운 길을 열었다.^[8]

이후 X선 결정학 기술은 단백질 구조 규명에 결정적인 역할을 했다. 1958년, 존 켄드루는 미오글로빈(헴을 포함하는 붉은색 단백질)의 3차원 구조를 X선 결정학을 이용하여 최초로 규명하고 그 결과를 발표했다.^[9] 이 획기적인 업적으로 켄드루는 맥스 페루츠와 함께 1962년 노벨 화학상을 수상했다.^[4]

2. 2. 결정학 발전

150년 이상 동안 과학자들은 단백질 분자가 결정화될 수 있다는 사실을 알고 있었다.^[6]

1840년, 프리드리히 루드비히 휘네펠트(Friedrich Ludwig Hünefeld)는 지렁이 혈액 샘플에서 우연히 결정 형성을 발견했으며, 이는 나중에 헤모글로빈으로 밝혀졌다.^[7] 이후 오토 푼케(Otto Funke, 1851년)는 헤모글로빈 결정을 만드는 방법을 설명했고, 윌리엄 T. 프레이어(William T. Preyer, 1871년)는 다양한 동물의 헤모글로빈 결정을 연구했다.^[7]

단백질 결정학 연구는 20세기에 들어 더욱 활발해졌다. 1909년, 생리학자 에드워드 T. 라이처트(Edward T. Reichert)와 광물학자 아모스 P. 브라운(Amos P. Brown)은 멸종된 태즈메이니아 늑대를 포함한 수백 종 동물의 헤모글로빈 결정에 대한 포괄적인 연구 결과를 발표했다.^[7]

결정학 기술의 중요한 발전은 1934년에 이루어졌다. 존 데스몬드 버널과 그의 제자 도로시 호지킨은 단백질 결정을 건조시키지 않고 모액(mother liquor)에 둘러싸인 상태로 두었을 때 훨씬 더 선명한 X선 회절 패턴을 얻을 수 있다는 것을 발견했다. 이들은 펩신 결정을 이용하여 젖은 상태의 구상 단백질에서 처음으로 의미 있는 회절 패턴을 얻는 데 성공했다. 이 발견 이전에는 건조된 결정만을 사용했기 때문에 결과가 불안정하고 신뢰하기 어려웠다. 버널과 호지킨의 연구는 단백질 구조 분석의 새로운 길을 열었다.^[8]

이러한 발전을 바탕으로, 1958년 존 켄드루는 X선 결정학을 이용하여 미오글로빈(헴을 포함하는 붉은색 단백질)의 3차원 구조를 최초로 규명했다.^[9] 이 업적으로 켄드루는 1962년 맥스 페루츠와 함께 노벨 화학상을 수상했다.^[4]

현재 단백질 결정 구조 분석은 생화학 및 의학 연구에 필수적인 도구로 활용되고 있다.

3. 원리

단백질이 결정을 이루는 과정은 염화나트륨(소금)과 같은 무기물이 결정을 형성하는 것과 동일한 물리 법칙, 특히 열역학의 원리를 따른다.^[10] 어떤 현상이 자발적으로 일어나려면, 그 결과 상태가 열역학적으로 더 안정해야 하는데, 이는 깁스 자유 에너지(∆G) 변화를 통해 설명할 수 있다. 결정화가 일어나기 위해서는 이 깁스 자유 에너지 변화량이 음수 값을 가져야 한다.^[10]

단백질 분자들이 용액 속에서 자유롭게 떠다니는 상태는 무질서하지만, 결정 상태는 매우 규칙적으로 배열된 상태이다. 즉, 결정화는 시스템의 무질서도(엔트로피, ∆S)가 감소하는 과정이므로 열역학적으로 불리한 경향이 있다. 따라서 결정이 형성되려면 이러한 엔트로피 감소를 상쇄할 만큼 시스템의 에너지(엔탈피, ∆H)가 충분히 낮아지거나, 온도를 포함한 외부 조건을 조절하여 전체적인 깁스 자유 에너지(∆G)를 음수로 만들어야 한다.^[10] 많은 단백질은 일반적인 조건에서 자발적으로 결정화되지 않기 때문에, 용액을 과포화 상태로 만드는 등 조건을 인위적으로 조절하여 결정화를 유도한다.^[3]

결정이 만들어지는 과정은 크게 두 단계로 나뉜다: 핵 생성(Nucleation)과 결정 성장(Crystal Growth)이다.^[3] 핵 생성은 용액 속 단백질 분자들이 모여 안정적인 작은 결정 씨앗(핵)을 형성하는 첫 단계이며,^[3] 결정 성장은 이 핵에 주변의 단백질 분자들이 달라붙어 결정의 크기가 점차 커지는 단계이다.^[3] 이 두 단계를 거쳐 최종적으로 단백질 결정이 완성된다.^[3]

3. 1. 열역학적 관점

단백질 결정화는 염화나트륨과 같은 무기 결정이 형성되는 것과 동일한 물리 법칙의 지배를 받는다. 어떤 과정이 자발적으로 일어나려면, 그 결과 상태가 열역학적으로 더 안정해야 한다. 결정화의 자발성은 깁스 자유 에너지(∆G) 변화로 설명할 수 있다. 깁스 자유 에너지는 ∆G = ∆H - T∆S 식으로 정의되며, 여기서 ∆H는 엔탈피 변화(시스템의 에너지 변화), ∆S는 엔트로피 변화(시스템의 무질서도 변화), T는 절대 온도를 나타낸다.^[10]

엔트로피는 시스템의 무질서한 정도를 나타내는 척도이다. 단백질 분자들이 용액 속에서 자유롭게 움직이는 상태는 무질서한 상태(높은 엔트로피)인 반면, 단백질 결정은 분자들이 규칙적으로 배열된 고도로 정렬된 상태(낮은 엔트로피)이다. 따라서 단백질 용액이 결정으로 변하는 과정은 엔트로피가 감소하는(∆S < 0) 과정이며, 이는 열역학적으로 불리한 경향을 보인다.

결정이 자발적으로 형성되려면 전체 깁스 자유 에너지 변화(∆G)가 음수여야 한다 (∆G < 0). 즉, 엔트로피 감소(음의 ∆S)로 인한 불리함을 상쇄할 만큼 충분한 엔탈피 감소(음의 ∆H, 즉 에너지 방출)가 있어야 한다. 염화나트륨과 같은 일반적인 무기 염 결정은 결정 상태가 용액 상태보다 에너지가 낮기 때문에(∆H < 0) 상온에서 자발적으로 형성된다.

그러나 일부 단백질의 경우, 결정화 과정에서 엔트로피가 감소할 뿐만 아니라(∆S < 0), 오히려 에너지가 증가할 수도 있다(∆H > 0). 이런 경우 ∆G는 양수가 되어 상온과 같은 일반적인 조건에서는 결정이 자발적으로 형성되지 않는다. 이러한 단백질을 결정화하기 위해서는 결정 형성이 에너지적으로 유리하도록(∆G < 0) 조건을 인위적으로 조절해야 한다. 대표적인 방법 중 하나는 단백질 용액을 과포화 상태로 만드는 것이다.^[3]

3. 2. 분자 수준의 과정

단백질 결정화는 소금과 같은 무기물이 결정되는 것과 동일한 물리 법칙의 영향을 받는다. 어떤 과정이 자발적으로 일어나려면, 그 결과로 생기는 상태가 열역학적으로 더 안정해야 한다. 이는 깁스 자유 에너지(∆G)라는 값으로 설명할 수 있는데, ∆G = ∆H - T∆S로 계산된다. 여기서 ∆H는 과정 중의 엔탈피(에너지 변화량), ∆S는 엔트로피(무질서도의 척도) 변화량, T는 온도를 의미한다.^[10]

단백질 결정처럼 매우 규칙적으로 배열된 상태는 용액 속 단백질처럼 무질서하게 흩어져 있는 상태보다 엔트로피가 낮다. 즉, 더 정렬된 상태로 변하면 시스템 전체의 엔트로피는 감소한다(∆S < 0). 따라서 결정이 저절로 만들어지려면(∆G < 0), 엔트로피 감소로 인한 불리함을 상쇄할 만큼 충분한 에너지 감소(음수의 ∆H)가 있거나, 온도의 영향(T∆S)을 고려했을 때 전체적인 자유 에너지가 감소해야 한다.^[10] 염화나트륨 같은 무기 결정은 결정 상태가 되는 것이 에너지적으로 유리(∆H < 0)하기 때문에 일반적인 조건에서 자발적으로 형성된다. 하지만 일부 단백질의 경우, 결정화 과정에서 오히려 에너지가 증가(∆H > 0)하고 엔트로피는 감소(∆S < 0)하여 자발적으로 결정이 생기기 어렵다. 이런 단백질을 결정화시키려면, 결정 형성이 에너지적으로 유리하도록 조건을 인위적으로 조절해야 한다. 이는 주로 단백질 용액을 과포화 상태로 만들어 해결한다.^[3]

결정이 만들어지는 과정은 크게 두 단계로 나눌 수 있다: 핵 생성과 결정 성장이다.^[3]

핵 생성(Nucleation): 결정화의 첫 단계로,^[3] 용액 속의 단백질 분자들이 서로 뭉쳐서 안정적인 작은 고체 덩어리, 즉 '핵'을 만드는 과정이다.^[3] 이 단계는 매우 중요한데, 무질서한 액체 상태에서 규칙적인 고체 상태로 변하는 1차 상전이이기 때문이다. 이때 분자들의 자유도가 크게 감소한다.^[3] 성공적인 핵 생성을 위해서는 온도, pH, 침전제 농도 등 결정화 조건을 정밀하게 조절하여 단백질의 용해도를 의도적으로 낮추는 것이 필요하다.^[3]
결정 성장(Crystal Growth): 일단 안정적인 핵이 만들어지면, 주변 용액의 단백질 분자들이 이 핵 표면에 달라붙으면서 결정의 크기가 점점 커지는 단계이다.^[3]

단백질의 농도가 용해도 한계를 넘어서면, 즉 과포화 상태가 되면 핵이 생성되고 결정이 성장하여 결국 결정화가 완료된다.^[3]

4. 방법

단백질 결정 생성의 주요 방법들. A: 행잉 드롭, B: 시팅 드롭 (증기 확산법), C: 미세투석법

단백질 결정을 얻기 위해 다양한 실험 방법들이 개발되어 사용되고 있다. 가장 일반적으로 사용되는 방법은 증기 확산법으로, 단백질 용액 방울과 더 높은 농도의 용액이 담긴 저장소 사이의 증기압 차이를 이용해 서서히 과포화 상태를 유도하여 결정을 성장시킨다. 마이크로배치법은 매우 적은 양의 단백질 용액을 오일 등에 넣어 증발을 막고 결정화를 시도하는 방법이다. 미세투석법은 반투과성 막을 경계로 용질 농도 구배를 만들어 단백질 용액의 과포화를 유도하는 방식이며, 주로 염석 원리를 이용한다. 자유 계면 확산법은 단백질 용액과 침전 용액을 직접 섞지 않고 확산을 통해 접촉시켜 결정 성장을 유도하는 방법이다. 각 방법의 구체적인 원리와 절차는 하위 섹션에서 더 자세히 설명한다.

4. 1. 증기 확산법

기체 확산법은 단백질 결정화에 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. 이 방법은 정제된 단백질, 완충액, 침전제를 섞은 작은 용액 방울(액적)을, 같은 성분이지만 농도가 더 높은 용액이 담긴 큰 통(저장소) 안에 넣고 밀봉하여 평형 상태에 도달하게 하는 원리를 이용한다. 처음에는 액적 속 단백질과 침전제의 농도가 낮지만, 시간이 지나면서 액적의 물이 증발하여 농도가 높은 저장소 쪽으로 이동하고, 액적과 저장소 사이의 농도 차이가 점차 줄어들면서 평형 상태에 가까워진다. 이 과정에서 액적 속 단백질과 침전제의 농도는 서서히 증가한다. 단백질 종류에 맞는 적절한 결정화 조건을 사용하면, 농도가 높아진 액적 안에서 단백질 결정이 자라나게 된다.^[11]^[12] 기체 확산법은 단백질과 침전제의 농도를 부드럽고 점진적으로 변화시켜 크고 질서정연한 결정을 만드는 데 유리하기 때문에 널리 사용된다.

기체 확산법은 크게 행잉 드롭(Hanging Drop, 현적법)과 시팅 드롭(Sitting Drop, 좌적법) 두 가지 방식으로 수행할 수 있다. 행잉 드롭 방식은 뚜껑 역할을 하는 얇은 판(커버 슬립) 아래쪽에 단백질 용액 방울을 매달아 놓고, 이를 저장소 위에 거꾸로 덮어 밀봉하는 방식이다. 반면, 시팅 드롭 방식은 저장소와 분리된 작은 받침대 위에 단백질 용액 방울을 올려놓고 밀봉한다. 두 방식 모두 액적과 저장소 사이의 기체 확산을 통해 평형이 이루어지도록 외부와 차단된 밀폐된 환경을 유지하는 것이 중요하다.^[11]^[13]

4. 2. 마이크로배치법

마이크로배치법은 일반적으로 매우 적은 양의 단백질 용액 방울을 오일에 담가 결정화를 유도하는 방법이다. 사용하는 단백질 용액의 양은 1μL 정도로 매우 적다. 이렇게 적은 양의 용액을 사용하기 때문에, 용액이 증발하는 것을 막아 수용액 상태를 유지하기 위해 오일이 필요하다. 주로 사용되는 오일에는 파라핀 오일과 실리콘 오일 등이 있다. 오일 대신 필름이나 테이프를 사용하여 용액 방울이 담긴 웰 플레이트를 밀봉하는 방법도 있다.

이 방법은 필요한 단백질 샘플의 양이 매우 적다는 장점 외에도, 실험 과정에서 용액이 공기에 노출되지 않아 공기 중 오염으로부터 샘플을 보호할 수 있다는 추가적인 장점이 있다.

4. 3. 미세투석법

마이크로다이얼리시스는 작은 분자와 이온은 통과할 수 있지만, 단백질과 같은 큰 고분자는 통과할 수 없는 반투과성 막을 이용하는 방법이다. 이 막을 사이에 두고 용질의 농도 차이를 만들면, 시스템이 평형 상태에 도달하는 과정에서 서서히 과포화 상태가 된다. 이 지점에서 단백질 결정이 형성될 수 있다.

미세투석법은 단백질의 용해도를 감소시키는 고농도의 염 또는 막을 통과할 수 있는 다른 작은 화합물을 사용하여 염석 방식으로 결정을 생성할 수 있다. 아주 드물게는, 일부 단백질은 순수한 물에 투석하여 용질을 제거함으로써 스스로 뭉쳐 결정화되는 경우도 있는데, 이는 염석을 통해 이루어질 수 있다.

4. 4. 자유 계면 확산법

이 기법은 단백질 용액과 침전 용액을 미리 섞지 않고, 채널의 양쪽 끝에서 각각 주입하여 확산을 통해 평형 상태에 도달하게 하는 방법이다. 두 용액은 시약 챔버에서 가장 높은 농도로 만나 자발적인 핵 생성을 시작한다. 이후 시스템이 평형 상태로 가면서 과포화 수준이 낮아지고, 이는 결정 성장을 촉진한다.^[14]

5. 영향 요인

단백질 결정화는 분자 간 상호 작용을 통해 형성될 수 있는 결합 수를 최적화하는 과정이며^[3], 여러 요인의 영향을 받는다. 이러한 상호 작용은 분자의 전자 밀도와 pH에 따라 변하는 단백질 측쇄의 상태에 달려있다.^[10]

주요 영향 요인으로는 다음과 같은 것들이 있다.

pH: 용액의 pH는 단백질 측쇄의 전하 상태를 변화시켜 분자 간 상호 작용에 영향을 미치므로, 최적의 결정화 조건을 찾는 데 있어 가장 강력하게 조절할 수 있는 요인 중 하나이다.^[10]
온도: 단백질의 용해도는 온도에 따라 달라지기 때문에, 온도를 조절하는 것은 성공적인 결정을 얻기 위해 흔히 사용되는 전략이다.^[15] 완충액 제조 온도나 실제 실험 온도 등 다양한 단계의 온도가 결과에 영향을 줄 수 있다.^[16]
화학 첨가제: 결정화 과정에 첨가되어 결정의 수율을 높이는 작은 화학 화합물이다.^[17] 과거에는 오염물질로 여겨지기도 했으나, 현재는 결정화 실험의 성공률을 높이는 중요한 변수로 인식되고 있다.^[17]

이러한 요인들을 적절히 조절하는 것은 성공적인 단백질 결정을 얻는 데 매우 중요하다.

5. 1. pH

단백질이 결정화되는 기본적인 원리는 분자 간의 상호작용을 통해 다른 단백질 분자와 형성할 수 있는 결합의 수를 최대로 만드는 것이다.^[3] 이러한 상호작용은 단백질을 구성하는 아미노산 측쇄의 상태에 따라 달라지는데, 이 측쇄의 상태는 분자의 전자 밀도와 주변 용액의 pH에 따라 변한다.^[10] 단백질의 3차 구조와 4차 구조는 아미노산 측쇄 사이의 분자 간 상호작용에 의해 결정된다. 일반적으로 물과 친한(친수성) 그룹들은 용매인 물 쪽을 향해 수화 껍질을 형성한다.^[10] 용액의 pH가 변하면, 이러한 극성을 띤 측쇄들의 전하 또한 용액의 pH와 단백질 고유의 산 해리 상수인 pKa 값에 따라 변하게 된다. 따라서 적절한 pH를 선택하는 것은 단백질 분자 간의 결합이 물 분자와의 결합보다 더 유리해져서 결정을 형성하는 데 매우 중요하다.^[10] pH는 최적의 결정화 조건을 찾아내는 데 사용할 수 있는 가장 강력한 조절 요인 중 하나이다.

5. 2. 온도

온도는 단백질의 용해도가 온도에 따라 변하기 때문에 단백질 결정화에서 중요한 요소이다.^[15] 이 때문에 성공적인 결정을 얻기 위해 온도를 조절하는 것은 흔히 사용되는 전략 중 하나이다. pH와 달리, 온도는 완충액 제조^[16]나 실제 결정화 실험 진행 등 다양한 단계의 온도가 최종 결과에 영향을 미칠 수 있다.

5. 3. 화학 첨가제

화학 첨가제는 결정화 과정에 첨가되어 결정의 수율을 높이는 작은 화학 화합물이다.^[17] 과거에는 단백질 결정화 과정에서 작은 분자들이 주로 오염물질로 여겨졌기 때문에, 화학 첨가제의 역할이 제대로 주목받지 못했다.^[17] 작은 분자는 단백질과 같은 거대 분자보다 더 쉽게 결정화되는 경향이 있어, 맥퍼슨(McPherson)의 연구 이전까지는 화학 첨가제의 사용이 제한적이었다. 그러나 현재는 화학 첨가제가 결정화 실험에서 중요한 변수로 인식되고 있으며, 생화학자와 결정학자들이 더욱 주목하고 연구해야 할 분야로 여겨진다.^[17]

6. 기술

단백질 결정화 연구를 위해서는 다양한 최신 기술들이 활용된다. 실험의 효율성을 높이기 위해, 성공적인 결정 성장에 필요한 여러 조건을 빠르게 탐색하는 고속 처리 방법(High-throughput screening^eng)이 개발되었다. 이미 성공 가능성이 검증된 재료들을 포함한 상업용 키트^[18]나, 많은 수의 실험을 동시에 자동으로 처리하는 액체 처리 로봇^[12] 등을 이용하여 시간과 노력을 절약하고 실험의 정확도를 높일 수 있다.

또한, 단백질 자체를 조작하여 결정화 성공 가능성을 높이는 단백질 공학 기법도 사용된다. 단백질 표면의 엔트로피를 줄이거나^[19] 결정이 잘 생성되도록 접촉 부위를 조작하는^[20] 방식이 대표적이다. 예를 들어, 이황화 결합을 형성하여 단백질 응집을 유발할 수 있는 시스테인 잔기를 다른 아미노산(예: 알라닌)으로 바꾸거나, 단백질의 유연성을 줄이기 위해 특정 아미노산(라이신, 글루탐산 등)을 변경하는 방법 등이 있다.

6. 1. 고속 결정화 스크리닝

고속 처리(High throughput) 방법은 성공적인 단백질 결정 성장에 필요한 다양한 조건을 탐색하는 데 요구되는 많은 실험 과정을 간소화하는 데 도움을 준다. 이미 성공적인 결정 생성이 확인된 시스템을 기반으로 구성된 재료를 적용하는 다양한 상업용 키트가 있다. 이러한 키트를 사용하면 과학자들은 단백질을 정제하고 적절한 결정화 조건을 결정하는 번거로움을 줄일 수 있다.^[18]

액체 처리 로봇은 많은 수의 결정화 실험을 동시에 설정하고 자동화하는 데 활용될 수 있다. 사람이 직접 수행할 경우 시간이 많이 걸리고 오류가 발생하기 쉬운 과정을 자동화된 시스템을 통해 효율적이고 정확하게 수행할 수 있다. 로봇 결정화 시스템은 기존의 결정화 방법과 동일한 구성 요소를 사용하지만, 각 단계를 신속하게 처리하며 많은 수의 복제 실험을 동시에 진행한다. 각 실험에는 소량의 용액만이 사용되는데, 이는 두 가지 주요 장점을 가진다. 첫째, 더 적은 양의 시료를 사용하므로 정제된 단백질의 소모를 줄일 수 있다. 둘째, 용액의 부피가 작을수록 결정화가 더 빠르게 유도된다. 각 실험은 카메라로 결정 성장을 모니터링한다.^[12]

6. 2. 단백질 공학

단백질 공학 기술을 이용하여 단백질 결정화의 성공 가능성을 높일 수 있다. 이러한 기술에는 표면 엔트로피 감소^[19]나 결정 접촉점 조작 등이 있다.^[20] 예를 들어, 문제가 될 수 있는 시스테인 잔기는 이황화 결합으로 인한 응집을 막기 위해 알라닌으로 바꿀 수 있다. 또한, 라이신, 글루탐산, 글루타민과 같은 아미노산 잔기는 단백질 자체의 유연성을 줄여 결정화를 방해하는 요소를 제거하기 위해 알라닌으로 변경하기도 한다.

7. 응용

단백질 결정화 기술은 다양한 과학 및 산업 분야에서 중요한 역할을 수행한다. 주요 응용 분야는 다음과 같다.

구조 생물학 연구: 단백질 결정은 X선 회절, 극저온 전자 현미경(CryoEM), 중성자 회절 등 다양한 분석 기법을 통해 단백질과 같은 거대 분자의 3차원 구조를 원자 수준에서 규명하는 데 핵심적으로 사용된다. 이를 통해 생명 현상의 근본 원리를 이해하고 질병 메커니즘을 밝히는 데 기여한다.
제약 산업: 단백질 결정화는 단백질 기반 의약품의 안정성을 높이고 효과적인 전달 시스템을 개발하는 등 제형화 과정에 활용될 수 있다. 또한, 신약 개발 과정에서 표적 단백질의 구조를 분석하여 약물 후보 물질을 설계하고 최적화하는 데 필수적인 정보를 제공한다.

7. 1. 구조 생물학

구조 생물학에서는 단백질 결정을 이용하여 거대 분자의 3차원 구조를 밝히는 연구를 수행한다. 단백질 구조를 규명하는 데 사용되는 주요 실험 기법은 다음과 같다.

X선 회절 (X선 결정학): 단백질 결정에 X선을 쏘아 회절되는 패턴을 분석하여 원자 수준의 구조 정보를 얻는 가장 전통적이고 널리 사용되는 방법이다.
극저온 전자 현미경 (CryoEM): 단백질 시료를 극저온 상태로 급속 동결시킨 후 전자빔을 투과시켜 이미지를 얻고, 이를 3차원 구조로 재구성하는 기술이다. 특히 전자 결정학이나 미세 결정 전자 회절 (MicroED)과 같이 작은 결정이나 비결정성 시료 분석에도 활용된다. 최근 기술 발전으로 X선 결정학에 버금가는 고해상도 구조 분석이 가능해졌다.
중성자 회절: X선 회절과 유사하지만 중성자빔을 사용하여 수소 원자의 위치를 포함한 더 자세한 구조 정보를 얻을 수 있다.
소각 X선 산란 (SAXS): 용액 상태의 단백질에 X선을 조사하여 전체적인 형태와 크기 정보를 얻는 방법이다.

이러한 방법들을 통해 얻어진 단백질 구조 정보는 생명 현상을 이해하는 기초를 제공할 뿐만 아니라, 신약 개발 과정에서 특정 단백질을 표적으로 하는 약물을 설계하고 최적화하는 데 중요한 역할을 한다. 단백질 결정화 기술 자체도 약물의 안정성을 높이고 전달 효율을 개선하는 등 제약 목적으로 단백질을 제형화하는 데 응용될 수 있다.

7. 2. 제약 산업

단백질 결정화는 제약 목적으로 단백질을 제형화하는 데에도 유용하게 사용될 수 있다.

참조

_[1] 논문 Aquaporins in the eye: expression, function, and roles in ocular disease 2014-05
_[2] 논문 Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals 2005-12
_[3] 논문 Introduction to protein crystallization 2014-01
_[4] 논문 Protein crystallography and drug discovery: recollections of knowledge exchange between academia and industry 2017-07
_[5] 논문 Ribociclib (LEE011): Mechanism of Action and Clinical Impact of This Selective Cyclin-Dependent Kinase 4/6 Inhibitor in Various Solid Tumors 2017-07
_[6] 논문 Lehninger principles of biochemistry (4th ed.): Nelson, D., and Cox, M. 2005-01
_[7] 논문 A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day 2013-12
_[8] 논문 Chapter 35. The Protein Structure Project, 1950–1959: First Concerted Effort of a Protein Structure Determination in the U.S. Elsevier 1996
_[9] 논문 A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis 1958-03
_[10] 논문 Whey proteins solubility as function of temperature and pH 2005-02
_[11] 서적 Crystallography Made Crystal Clear: A Guide for Users of Macromolecular Models Academic Press 2006
_[12] 웹사이트 The Crystal Robot http://www.eurekaler[...] 2000-12
_[13] 서적 Practical Protein Crystallography https://books.google[...] Academic Press
_[14] 서적 Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology https://books.google[...] Garland Science 2009-10-20
_[15] 논문 An ignored variable: solution preparation temperature in protein crystallization 2015-01
_[16] 논문 Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules https://escholarship[...] 2006-12
_[17] 논문 What's happened over the last five years with high-throughput protein crystallization screening? 2018-08
_[18] 논문 Protein crystallization by surface entropy reduction: optimization of the SER strategy 2007-05
_[19] 논문 Design of ordered two-dimensional arrays mediated by noncovalent protein-protein interfaces 2015-06
_[20] 논문 Diamonds in the rough: protein crystals from a formulation perspective 2001-11
_[21] 저널 Aquaporins in the eye: Expression, function, and roles in ocular disease https://linkinghub.e[...] 2014-05

본 사이트는 AI가 위키백과와 뉴스 기사,정부 간행물,학술 논문등을 바탕으로 정보를 가공하여 제공하는 백과사전형 서비스입니다.
모든 문서는 AI에 의해 자동 생성되며, CC BY-SA 4.0 라이선스에 따라 이용할 수 있습니다.
하지만, 위키백과나 뉴스 기사 자체에 오류, 부정확한 정보, 또는 가짜 뉴스가 포함될 수 있으며, AI는 이러한 내용을 완벽하게 걸러내지 못할 수 있습니다.
따라서 제공되는 정보에 일부 오류나 편향이 있을 수 있으므로, 중요한 정보는 반드시 다른 출처를 통해 교차 검증하시기 바랍니다.

문의하기 : help@durumis.com