유레이스

3. 구조

유레이스의 활성 부위에는 두 개의 니켈 이온(Ni²⁺)이 존재한다는 특징이 있다.^[7] 이 니켈 이온 쌍은 약 3.5 Å의 원자간 거리를 가지며, 약하게 반강자성 결합을 하고 있다.^[5][13] X선 흡수 분광법 (XAS) 연구에 따르면, 니켈 이온은 5개 또는 6개의 산소(O) 또는 질소(N) 리간드와 배위 결합을 형성하며, 여기에는 니켈당 2개의 이미다졸 리간드가 포함된다.^[8][15] 활성 부위 입구 쪽에는 물 분자들이 수소 결합을 통해 사면체 클러스터를 형성하며 공간을 채우고 있다.^[3] 특정 아미노산 잔기들은 활성 부위로 들어오는 기질을 조절하는 문(gate) 역할을 하는 유연한 덮개(flap) 구조를 형성하는 것으로 여겨진다.^[3] 시스테인 잔기는 이 덮개 영역에서 흔히 발견되며, 직접적인 촉매 작용에는 필수적이지 않지만 활성 부위의 다른 주요 잔기들을 올바르게 배치하는 데 중요한 역할을 한다.^[14]

세균의 유레이스는 일반적으로 세 종류의 소단위체로 구성된다: 큰 촉매 소단위체인 α (알파, 60–76 kDa), 그리고 두 개의 작은 소단위체인 β (베타, 8–21 kDa)와 γ (감마, 6–14 kDa)이다. 이들은 보통 (αβγ)₃ 형태로 조립되어 삼합체(trimer)를 이루며, 전체 분자량은 190~300 kDa 범위이다.^[9] 대부분의 세균 유레이스는 세포질 내에 존재한다.^[9]

하지만 ''헬리코박터 파일로리'' (''Helicobacter pylori'')의 유레이스는 예외적인 구조를 가진다. 이 효소는 α (26–31 kDa)와 β (61–66 kDa) 두 종류의 소단위체로만 구성되며, 이 αβ 단위체가 12번 반복되어 (αβ)₁₂ 형태의 거대한 십이합체(dodecamer) 복합체를 형성한다. 각 αβ 소단위체 쌍마다 활성 부위가 있어 총 12개의 활성 부위를 갖는다.^[10] ''헬리코박터 파일로리''의 유레이스는 세포질뿐만 아니라 세포 외부에서도 활성을 나타낸다.^[9]

진균과 식물의 유레이스는 세균과 달리 동일한 종류의 소단위체(약 90 kDa)로 구성되며, 이 소단위체들이 모여 삼합체나 육합체(hexamer)를 형성한다. 예를 들어, 강낭콩 유레이스는 6개의 동일한 소단위체가 모인 육합체 구조를 가지며, 각 소단위체는 활성 부위를 포함하는 α 소단위체에 해당한다. 강낭콩 유레이스 소단위체는 840개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 니켈 이온을 제외한 분자량은 90.77 kDa이다. 12개의 니켈 이온을 포함하는 전체 육합체의 질량은 545.34 kDa이다.^[9] 콩, 비둘기콩, 목화 씨앗의 유레이스도 이러한 육합체 구조를 가진다.^[9] 식물 유레이스는 모두 세포질 내에 존재한다.^[9]

이처럼 다양한 생물종의 유레이스는 서로 다른 소단위체 구성과 조립 방식을 보이지만, 아미노산 서열 상동성은 매우 높다. 구조적으로 볼 때, 단일 식물 유레이스 소단위체 사슬은 세균의 γ-β-α 소단위체가 융합된 것과 유사하다. 또한 ''헬리코박터''의 "α" 소단위체는 일반적인 세균의 γ-β 소단위체가 융합된 형태와 유사하며, "β" 소단위체는 일반적인 세균의 α 소단위체와 유사하다.^[9] 이러한 구조적 유사성은 세 개의 사슬로 구성된 형태가 진화적으로 더 오래된 조상 형태일 가능성을 시사한다.^[12]

아직까지 요소가 유레이스의 활성 부위에 직접 결합한 모습은 실험적으로 관찰되지 않았다.^[9]

4. 촉매 메커니즘

유레이스는 요소(k_cat)/K_m 값을 기준으로 볼 때, 요소의 비촉매적 가수분해 반응 속도보다 10¹⁴배 더 빠르게 반응을 촉진한다.^[5] 이러한 높은 효율성은 활성 부위 내에서 요소가 촉매 그룹에 가깝게 위치하고 올바른 방향으로 배향되어 가수분해가 신속하게 일어나기 때문이다. 요소 자체는 공명 구조 때문에 매우 안정하며, 이 안정성은 약 30–40 kcal/mol로 추정되는 공명 에너지에 기인한다.^[5] 요소의 쯔비터이온 공명 형태는 카르보닐 탄소에 전자를 기여하여 친핵성 공격에 대한 반응성을 낮춘다.^[5]

유레이스의 활성 부위는 α(알파) 단백질 소단위체에 위치하며, 두 개의 μ-히드록소 이량체 니켈(II) 중심을 포함한다. 이 니켈 중심 간의 거리는 약 3.5 Å이다.^[5] 두 Ni(II) 이온은 약하게 반강자성으로 결합되어 있다.^[13] ''강낭콩'', ''Klebsiella aerogenes'', 그리고 ''Sporosarcina pasteurii(과거 ''Bacillus pasteurii''로 알려짐)''에 대한 X선 흡수 분광법 (XAS) 연구^[15]는 니켈 이온이 5개 또는 6개의 리간드와 배위 결합을 형성하며, 니켈당 2개의 이미다졸 리간드를 포함하여 전적으로 산소(O) 또는 질소(N) 리간드와 결합함을 확인했다.^[8] 요소 기질은 기존의 아쿠오 리간드를 치환하는 것으로 제안된다.

활성 부위 입구 근처에 위치한 물 분자들은 수소 결합을 통해 공동 부위를 채우는 사면체 클러스터를 형성한다. 일부 아미노산 잔기는 기질의 출입을 조절하는 문(gate) 역할을 하는 '가동성 플랩(mobile flap)'을 형성하는 것으로 제안된다.^[3] 플랩 영역에서 흔히 발견되는 시스테인 잔기는 촉매 작용에 직접적으로 필수적이지는 않지만, 활성 부위 내 다른 주요 잔기들을 적절하게 배치하는 데 관여하는 것으로 밝혀졌다.^[14] ''Sporosarcina pasteurii'' 유레이스에서는 플랩이 열린 형태로 관찰되었으나, 실제 반응에는 닫힌 형태가 필요한 것으로 보인다.^[15]

참고로, ''헬리코박터 파일로리'' 유레이스를 포함한 다른 세균성 유레이스의 α 소단위체 구조는 강낭콩 유레이스와 유사하다.^[14]

요소가 유레이스의 활성 부위에 결합하는 모습은 실험적으로 직접 관찰되지 않았기 때문에^[9], 여러 가지 촉매 메커니즘이 제안되었다.
블레이클리(Blakeley)와 제르너(Zerner) 메커니즘^[16]

이 메커니즘은 요소 분자의 카르보닐 산소가 5배위 니켈(Ni-1)에 친핵성 공격을 하면서 시작된다. 이 과정에서 약하게 배위된 물 리간드가 치환된다. 요소 분자의 질소 원자 중 하나에서 나온 고독 전자쌍은 중심 탄소와 이중 결합을 형성하고, 그 결과 생성된 NH₂⁻ 기는 근처의 양전하 그룹과 상호 작용한다. (블레이클리와 제르너는 이 그룹을 카르복실산염 이온으로 제안했으나, 탈양성자화된 카르복실산염은 음전하를 띤다는 문제가 있다.)

이후 6배위 니켈(Ni-2)의 수산화물 리간드가 염기에 의해 탈양성자화된다. 카르보닐 탄소는 전기음성도가 큰 산소 원자에 의해 공격받는다. 질소-탄소 이중 결합의 전자쌍은 질소로 돌아가 전하를 중화시키고, 탄소는 사면체 중간체 구조를 형성한다.

이 중간체의 분해는 활성 부위 근처에 위치한 시스테인의 설프히드릴기(싸이올기)에 의해 도움을 받는다. 수소가 질소 원자 중 하나와 수소 결합을 형성하여 탄소와의 결합을 끊고 암모니아(NH₃) 분자를 방출한다. 동시에 산소와 6배위 니켈 사이의 결합도 끊어진다. 이 결과 5배위 니켈에 카르밤산염 이온이 배위된 상태로 남게 되며, 이는 다시 물 분자에 의해 치환되어 효소를 원래 상태로 재생시킨다.

생성된 카르밤산염은 이후 자발적으로 분해되어 또 다른 암모니아 분자와 탄산을 생성한다.^[17]
하우징거(Hausinger)와 카플러스(Karplus) 메커니즘^[5]

이 메커니즘은 블레이클리/제르너 경로의 몇 가지 문제점을 해결하고자 제안되었다. ''K. aerogenes'' 유레이스의 결정 구조 분석 결과, 이전 메커니즘에서 일반 염기로 제안된 His³²⁰ 잔기가 Ni-2에 결합된 물 분자와 너무 멀리 떨어져 있어 물을 탈양성자화시켜 공격하는 수산화물 이온을 형성하기 어렵다는 점이 지적되었다. 또한, 요소의 질소를 양성자화하는 데 필요한 일반 산성 리간드도 명확히 확인되지 않았다.^[18]

하우징거와 카플러스는 '역 양성자화(reverse protonation)' 방식을 제안했다. 이 방식에서는 양성자화된 형태의 His³²⁰ 리간드가 일반 산 역할을 하고, Ni-2에 결합된 물은 이미 탈양성자화된 수산화물 상태에 있다고 가정한다.^[5] 이 메커니즘은 일반 염기가 필요 없으며, His³²⁰이 양성자를 기증하여 암모니아 분자 형성을 돕고, 이는 효소로부터 방출된다. 전체 유레이스 효소 중 약 0.3%만이 언제든지 활성 상태일 것으로 계산되었지만, 활성 형태의 반응성이 증가하여 이러한 불리함을 상쇄할 수 있다고 보았다.^[5] 또한, 이 메커니즘은 가동성 플랩의 일부인 His³²⁰ 리간드를 필수 구성 요소로 포함시킨다. 따라서 요소 기질이 결합하면 이 플랩이 활성 부위 위로 닫히고, 포켓 내 다른 리간드로부터 요소로의 수소 결합 패턴이 형성되어 유레이스 효소의 요소 선택성을 설명하는 데 기여한다.^[5]
치울리(Ciurli)와 망가니(Mangani) 메커니즘^[19]

이 메커니즘은 유레이스 작용 원리에 대한 가장 최근의, 그리고 현재 비교적 널리 받아들여지는 견해 중 하나이다. 이는 활성 부위의 두 니켈 이온이 서로 다른 역할을 수행한다는 점에 초점을 맞춘다.^[15] 즉, 하나의 니켈 이온(Ni1)은 요소를 결합하고 활성화하며, 다른 니켈 이온(Ni2)은 친핵성 물 분자를 결합하고 활성화한다.^[15]

이 제안에 따르면, 이동 가능한 '플랩'이 열리면 요소가 활성 부위의 공동으로 들어간다. 요소는 수소 결합 네트워크를 통해 안정화되어 촉매 공동으로 향하게 된다.^[15] 요소는 카르보닐 산소 원자를 사용하여 5배위 니켈(Ni1)에 결합한다. 또한, 아미노기 중 하나를 사용하여 6배위 니켈(Ni2)에 접근하여 두 니켈 중심을 연결(bridging)한다.^[15] 요소 카르보닐 산소 원자가 Ni1에 결합하는 것은 His^α222 Nε의 양성자화 상태를 통해 안정화된다. 플랩이 열린 상태에서 닫힌 상태로 형태가 변하면 Ala^α222 카르보닐기의 재배열이 일어나 산소 원자가 Ni2를 향하게 된다.^[15] Ala^α170와 Ala^α366 잔기는 이제 카르보닐기가 요소의 NH₂ 그룹에 대한 수소 결합 수용체 역할을 하도록 방향을 잡아, NH₂ 그룹이 Ni2에 결합하는 것을 돕는다.^[15] 요소 자체는 NH₂ 그룹의 낮은 루이스 염기 특성 때문에 매우 약한 킬레이트 리간드이지만, 이들 알라닌 잔기의 카르보닐 산소가 NH₂ 그룹의 염기성을 향상시켜 Ni2에 결합할 수 있게 만든다.^[15] 따라서 이 메커니즘에서는 활성 부위 잔기들의 구조적 특징(Ni1 근처의 수소 결합 공여체 역할, Ni2 근처의 수용체 역할)이 요소의 적절한 배치를 유도한다.^[15] 치울리/망가니 메커니즘과 다른 두 메커니즘의 주요 구조적 차이점은, 이 메커니즘에서는 질소와 산소 원자로 두 니켈을 연결하는 요소 분자가 가교 수산화물에 의해 공격을 받는다는 점이다.^[17]

5. 생물학적 역할 및 병원성

세균 유레이스는 여러 질병의 발병 기전과 관련이 깊다. 대표적으로 간성 뇌증 및 간성 혼수, 감염성 요로 결석, 소화성 궤양 등이 있다.^[20]

감염으로 인해 발생하는 요로 결석은 주로 스트루바이트(MgNH₄PO₄•6H₂O)와 탄산염 인회석(Ca₁₀(PO₄)₆•CO₃)이 섞여 이루어진다.^[20] 이들 다가 이온은 원래 물에 녹지만, 미생물이 만든 유레이스가 요소를 가수분해하여 암모니아(NH₃)를 생성하면 주변 환경의 pH가 약 6.5에서 9까지 상승하게 된다.^[20] 이러한 알칼리화는 결국 결석 결정화를 유발한다.^[20] 사람에게 감염성 요로 결석을 일으키는 가장 흔한 미생물 유레이스는 ''프로테우스 미라빌리스''(''Proteus mirabilis'')이다.^[21]

또한, ''헬리코박터 파일로리''(''Helicobacter pylori'')는 간 경변 환자에게 간성 뇌증 및 간성 혼수를 유발하는 원인 중 하나로 연구되고 있다.^[22] ''헬리코박터 파일로리''는 위에서 유레이스를 분비하여 요소를 암모니아와 탄산으로 분해한다. 이 박테리아는 주로 위에 머무르기 때문에, 생성된 암모니아는 위 강에서 순환계로 쉽게 흡수될 수 있다.^[22] 이는 혈중 암모니아 농도를 높이는 고암모니아혈증 상태로 이어질 수 있으며, ''헬리코박터 파일로리''를 제거하면 혈중 암모니아 수치가 눈에 띄게 감소하는 것으로 보고되었다.^[22]

''헬리코박터 파일로리''는 소화성 궤양의 주요 원인이기도 하며, 보고된 사례의 55~68%에서 발견된다.^[23] 이 병원체를 제거하면 궤양 출혈이 줄어들고 재발률도 낮아지는 것으로 확인되었다.^[23] 위에서 요소 가수분해가 일어나면 점막 내 pH가 상승하여, 위샘과 위 강 사이의 수소 이온 이동을 방해한다.^[20] 뿐만 아니라, 높은 농도의 암모니아는 세포 사이의 밀착 연접에 영향을 주어 투과성을 높이고 위 점막을 손상시킬 수 있다.^[20][24]

6. 농업 분야 응용

요소는 전 세계적으로 사용되는 합성 질소 비료의 절반 이상을 차지할 정도로 농업에서 중요한 역할을 한다.^[25] 하지만 요소 비료는 토양 속 미생물이 가진 유레이스(우레아제)에 의해 빠르게 분해되는 경향이 있다. 이 빠른 분해는 비료 효율을 떨어뜨리고, 과도하게 사용될 경우 부영양화와 같은 환경 문제를 일으킬 수 있다.^[26]

이러한 문제 때문에 요소 비료의 분해 속도를 늦추는 유레이스 억제제 개발이 중요하게 다루어진다. 억제제는 요소가 너무 빨리 분해되는 것을 막아 비료의 낭비를 줄이고 환경에 미치는 부정적인 영향을 완화하는 데 도움을 준다.^[28] 대표적인 유레이스 억제제로는 페닐 포스포로디아미데이트와 N-(n-부틸)티오포스포르산 트리아미드 등이 있다.^[29] 토양 환경에서 유레이스 활성은 종종 미생물 군집의 건강 상태를 나타내는 지표로 활용되기도 한다.^[27]

6. 1. 생물 광물화

7. 진단 검사

많은 위장관이나 요로 감염을 일으키는 병원체는 유레이스(요소 분해 효소)를 만들어낸다. 따라서 급속 요소 분해 효소 검사와 같은 유레이스 존재 여부를 확인하는 검사를 통해 이러한 병원체의 감염 여부를 진단할 수 있다.

유레이스 양성 반응을 보이는 주요 병원체는 다음과 같다.

• ''미라빌리스 프로테우스'' 및 ''불가리스 프로테우스''
• ''유레아플라스마 유레알리티쿰'', ''마이코플라스마'' 속(spp.)의 친척
• ''노카르디아''
• ''코리네박테리움 유레알리티쿰''
• 기회 감염을 일으키는 곰팡이인 ''크립토코쿠스'' 속(spp.)
• ''헬리코박터 파일로리''
• 특정 장내 세균 (예: ''프로테우스'' 속, ''클레브시엘라'' 속, ''모르가넬라'' 속, ''프로비덴시아'' 속, 그리고 ''세라티아'' 속 등)
• ''브루셀라''
• ''사프로피티쿠스 포도상구균''
• ''황색 포도상구균'' ^[32]

8. 저해제

요소 분해 효소(유레이스)의 활동을 억제하는 것은 농업 분야에서 중요한 과제이다. 요소 기반 비료가 너무 빨리 분해되면 비료 성분이 낭비될 뿐만 아니라 환경 오염 문제도 일으킬 수 있기 때문이다.^[28] 농업 현장에서는 페닐 포스포로디아미데이트와 ''N''-(''n''-부틸)티오포스포르산 트리아미드 (NBPT) 등이 유레이스 저해제로 사용된다.^[29]

다양한 화학 구조를 가진 유레이스 저해제들이 알려져 있다. 이러한 저해제들은 농업 분야 외에도 의학 분야에서도 관심을 받고 있는데, 예를 들어 위궤양 등을 유발하는 ''헬리코박터 파일로리''와 같은 병원균은 생존 전략의 하나로 유레이스를 만들기 때문이다. 주요 유레이스 저해제들은 다음과 같은 종류로 나눌 수 있다.^[33][34]

참조

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