DNA 클로닝
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1. 개요
DNA 클로닝은 특정 DNA 조각을 복제하여 대량으로 증폭하는 분자 생물학 기술이다. 1970년대에 제한 효소와 DNA 연결 효소의 발견으로 가능해졌으며, 유전자 연구와 유전 공학 발전에 기여했다. DNA 클로닝은 숙주와 클로닝 벡터 선택, DNA 준비, 재조합 DNA 생성, 숙주 유기체 도입, 재조합 DNA 포함 유기체 선택, 클론 선별 등의 단계를 거쳐 진행된다. 이 기술은 유전자 발현 연구, 재조합 단백질 생산, 유전자 변형 생물체 개발, 유전자 치료 등 다양한 분야에 응용되며, 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 클로닝 실험을 미리 계획할 수도 있다.
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텔로머레이스는 진핵세포 염색체 말단의 텔로미어 DNA 반복 서열을 연장하는 역전사 효소로, 세포 분열 시 텔로미어 단축을 막아 세포 수명 유지에 중요한 역할을 하며, RNA 구성 요소(TERC)와 역전사 효소(TERT) 복합체로 구성되어 세포 노화, 암, 유전 질환 연구와 관련이 있고, 텔로미어와 텔로머레이스 기능 연구로 엘리자베스 블랙번, 캐럴 W. 그리더, 잭 W. 쇼스택이 2009년 노벨 생리학·의학상을 수상했다.
| DNA 클로닝 | |
|---|---|
| 개요 | |
| 명칭 | 분자 클로닝 |
| 분야 | 분자생물학 |
| 유형 | 분자생물학 실험 기법 |
| 상세 정보 | |
| 정의 | 특정 DNA 분자를 생체 내에서 대량으로 복제하는 과정 |
| 목적 | 특정 DNA 서열의 분리, 증폭, 보존, 또는 조작 |
| 기본 단계 | DNA 절단 DNA 조각 삽입 숙주 세포로의 전달 클론 선별 |
| 관련 기술 | 제한 효소 처리 DNA 리가아제 연결 형질전환 벡터 사용 |
| 응용 분야 | 유전자 연구 단백질 생산 유전자 치료 생명공학 |
| 핵심 요소 | DNA 절단 효소 (제한 효소) DNA 연결 효소 (DNA 리가아제) DNA 운반체 (벡터) 숙주 세포 (세균, 효모, 동물 세포 등) |
| 클로닝 벡터 종류 | 플라스미드 박테리오파지 코스미드 BAC YAC |
2. 역사
1970년대 이전에는 복잡한 유기체에서 개별 유전자를 분리하고 연구할 수 없어 유전학과 분자 생물학에 대한 이해가 심각하게 방해받았다. 이러한 상황은 분자 클로닝 방법의 출현으로 극적으로 변화했다. 미생물학자들은 세균 내에서 세균의 성장을 제한하는 분자 기전을 이해하고자 특정 DNA 염기 서열을 만날 때만 DNA 분자를 절단할 수 있는 효소인 제한 효소를 분리했다.[6] 그들은 제한 효소가 염색체 길이의 DNA 분자를 특정 위치에서 절단하며, 더 큰 분자의 특정 부분을 크기 분획을 통해 정제할 수 있음을 보여주었다. 두 번째 효소인 DNA 연결 효소를 사용하면 제한 효소에 의해 생성된 단편들을 새로운 조합으로 결합할 수 있었으며, 이를 재조합 DNA라고 불렀다. 관심 있는 DNA 절편을 세균 내에서 자연적으로 복제되는 세균 또는 플라스미드와 같은 벡터 DNA와 재조합함으로써, 세균 배양에서 대량의 정제된 재조합 DNA 분자를 생산할 수 있었다. 최초의 재조합 DNA 분자는 1972년에 생성 및 연구되었다.[7][8]
분자생물학에서 DNA 클로닝은 특정 유전자를 연구하기 위해 동일한 DNA를 대량으로 만드는 기술이다. 자연 상태의 DNA 분자는 매우 길고 많은 유전자를 포함하며, 특정 유전자와 비암호화 염기서열을 구별하기 어렵다. 이러한 문제를 해결하기 위해 과학자들은 박테리아를 이용하여 DNA를 클로닝하는 방법을 개발했다.
분자 클로닝은 DNA 서열의 복제를 허용한다는 점에서 PCR과 유사하지만, 다음과 같은 중요한 차이점이 있다. 분자 클로닝은 살아있는 미생물 내에서 DNA를 복제하는 반면, PCR은 살아있는 세포가 없는 ''생체외'' 용액에서 DNA를 복제한다.
3. 원리
DNA 클로닝 과정은 다음과 같다. 먼저, 플라스미드를 박테리아에서 분리하고 외부 DNA를 플라스미드에 삽입하여 재조합 DNA를 만든다. 이 재조합 플라스미드를 다시 박테리아 세포에 넣으면 재조합 박테리아가 된다. 재조합 박테리아는 세포분열을 통해 유전적으로 동일한 클론(유전적 복제품)을 생성하며, 이를 통해 유전자를 대량으로 복제할 수 있다. 이 과정을 유전자 클로닝이라고 한다.
유전자 클로닝은 특정 염기서열을 인식하고 절단하는 제한 효소의 발견으로 가능해졌다. 제한 효소는 제한효소자리(restriction site)라는 특정 염기서열을 인지하고 DNA 두 가닥을 자른다. 박테리아는 자신의 DNA 제한효소자리에 메틸기를 첨가하여 제한효소로부터 자신의 DNA를 보호한다. 제한 효소는 다양한 크기의 제한효소절편(restriction fragment)을 만들 수 있으며, 엇갈린 방식으로 DNA를 절단하여 점착말단(sticky end)을 생성한다. 점착말단은 동일한 효소로 절단된 DNA의 상보적인 점착말단과 수소결합 염기쌍을 형성할 수 있으며, DNA 연결 효소에 의해 영구적으로 결합하여 재조합 DNA 분자를 생성한다.
1970년대 이전에는 복잡한 유기체에서 개별 유전자를 분리하고 연구할 수 없었지만, 분자 클로닝 방법의 출현으로 이러한 상황이 극적으로 변화했다. 1972년에 최초의 재조합 DNA 분자가 생성 및 연구되었다.[7][8]
DNA의 화학 구조는 모든 생명체에서 근본적으로 동일하므로, 분자 클로닝을 통해 모든 유기체의 DNA를 복제할 수 있다. 분자 클로닝은 살아있는 미생물 내에서 DNA를 복제하는 반면, PCR은 ''생체외'' 용액에서 DNA를 복제한다는 차이점이 있다.
4. 단계
표준 분자 클로닝 실험에서, 임의의 DNA 단편을 클로닝하는 과정은 본질적으로 다음 일곱 단계로 구성된다.[3]
# 숙주 유기체 및 클로닝 벡터의 선택
# 벡터 DNA의 준비
# 클로닝할 DNA의 준비
# 재조합 DNA의 생성
# 숙주 유기체에 재조합 DNA의 도입
# 재조합 DNA를 포함하는 유기체의 선택
# 원하는 DNA 삽입물과 생물학적 특성을 가진 클론의 선별
특히, DNA 합성 기술의 발전은 분자 공학에서 더욱 복잡한 설계를 가능하게 한다. 이러한 프로젝트에는 개별 서열이 아닌, 매우 긴 새로운 DNA 서열 가닥 및/또는 전체 라이브러리를 동시에 테스트하는 것이 포함될 수 있다. 이러한 변화는 설계를 평면적인 뉴클레오티드 기반 표현에서 벗어나 더 높은 수준의 추상화로 이동해야 하는 복잡성을 야기한다.
1. 숙주 유기체 및 클로닝 벡터의 선택대부분의 분자 클로닝 실험은 세균의 실험실 균주인 ''대장균''( ''Escherichia coli'')과 플라스미드 벡터를 사용하여 시작된다. ''대장균''과 플라스미드 벡터는 기술적으로 정교하고 다용도이며 널리 사용 가능하고, 최소한의 장비로 재조합 생물체의 빠른 성장을 제공하기 때문에 널리 사용된다.[3] 클로닝할 DNA가 매우 큰 경우 (수십만에서 수백만 염기쌍), 세균 인공 염색체[10] 또는 효모 인공 염색체 벡터를 선택하는 경우가 많다.
특수한 응용 분야에서는 특수한 숙주-벡터 시스템이 필요할 수 있다. 예를 들어, 실험자가 재조합 생물체에서 특정 단백질을 수확하려는 경우, 원하는 숙주 생물체에서 전사 및 번역에 적합한 신호를 포함하는 발현 벡터를 선택한다. 또는 다른 종에서 DNA 복제를 원하는 경우 (예: 세균에서 식물로 DNA 전달), 다중 숙주 범위 벡터 (일명 셔틀 벡터)를 선택할 수 있다. 그러나 실제로 특수한 분자 클로닝 실험은 일반적으로 세균 플라스미드로 클로닝을 시작한 다음 특수 벡터로 서브클로닝하는 것으로 시작한다.
어떤 숙주와 벡터의 조합이 사용되든, 벡터는 거의 항상 다음 네 가지 DNA 세그먼트를 포함한다:[3]
2. 벡터 DNA의 준비클로닝 벡터는 제한 효소로 처리하여 외래 DNA가 삽입될 부위의 DNA를 절단한다. 제한 효소는 절단 부위에서 외래 DNA의 말단과 호환되는 구성을 생성하도록 선택된다. 일반적으로, 이는 벡터 DNA와 외래 DNA를 동일한 제한 효소 또는 제한 핵산 분해 효소 (예: EcoRI)로 절단함으로써 수행된다.[11] 대부분의 현대 벡터는 벡터 분자 내에서 고유한 다양한 편리한 절단 부위를 포함하며, 재조합체와 비재조합 유기체를 구별하는 데 사용할 수 있는 유전자 (자주 베타-갈락토시다제) 내에 위치한다. 재조합체와 비재조합 유기체의 비율을 개선하기 위해, 절단된 벡터는 벡터 말단을 탈인산화하는 효소 (알칼리성 인산 분해 효소)로 처리할 수 있다. 탈인산화된 말단을 가진 벡터 분자는 복제할 수 없으며, 외래 DNA가 절단 부위에 통합된 경우에만 복제가 복원될 수 있다.[12]
3. 클로닝할 DNA의 준비
게놈 DNA 클로닝의 경우, 클로닝할 DNA는 관심 있는 유기체에서 추출한다. DNA가 광범위하게 분해되지 않는 한 사실상 모든 조직 소스 (심지어 멸종된 동물의 조직)도 사용할 수 있다.[13] 그런 다음 오염 단백질 (페놀 추출), RNA (리보뉴클레아제) 및 더 작은 분자 (침전 및/또는 크로마토그래피)를 제거하기 위해 간단한 방법으로 DNA를 정제한다. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법은 분자 클로닝 전에 특정 DNA 또는 RNA (RT-PCR) 서열의 증폭에 자주 사용된다.
클로닝 실험을 위한 DNA는 역전사 효소를 사용하여 RNA로부터 얻거나 (상보 DNA 또는 cDNA 클로닝), 합성 DNA 형태로 얻을 수도 있다 (인공 유전자 합성). cDNA 클로닝은 일반적으로 관심 있는 세포의 mRNA 집단을 나타내는 클론을 얻는 데 사용되며, 합성 DNA는 설계자가 정의한 정확한 서열을 얻는 데 사용된다. 이러한 설계된 서열은 유전 암호 간에 유전자를 이동시킬 때 (예: 미토콘드리아에서 핵으로)[14] 또는 단순히 코돈 최적화를 통해 발현을 증가시킬 때 필요할 수 있다.[15]
정제된 DNA는 벡터의 것과 연결될 수 있는 말단을 가진 조각을 생성하기 위해 제한 효소로 처리된다. 필요한 경우, 원하는 제한 부위를 포함하는 짧은 이중 가닥 DNA 세그먼트 (''링커'')를 추가하여 벡터와 호환되는 말단 구조를 생성할 수 있다.[3][12]
4. 재조합 DNA의 생성재조합 DNA의 생성은 분자 클로닝 과정의 가장 간단한 단계이다. 벡터와 이종 유전자원으로부터 준비된 DNA는 적절한 농도로 단순히 혼합되어, 말단을 공유 결합적으로 연결하는 효소 (DNA 연결효소)에 노출된다. 이러한 결합 반응은 종종 연결이라고 불린다. 무작위로 연결된 말단을 포함하는 결과적인 DNA 혼합물은 숙주 생물체로 도입될 준비가 된다.
DNA 연결효소는 선형 DNA 분자의 말단만을 인식하고 작용하며, 일반적으로 무작위로 연결된 말단을 가진 복잡한 DNA 분자 혼합물을 생성한다. 원하는 생성물 (이종 DNA에 공유 결합적으로 연결된 벡터 DNA)이 존재하지만, 다른 서열 (예: 자체적으로 연결된 이종 DNA, 자체적으로 연결된 벡터 DNA, 그리고 벡터와 이종 DNA의 고차 조합)도 일반적으로 존재한다. 이러한 복잡한 혼합물은 DNA 혼합물이 세포 내로 도입된 후 클로닝 과정의 후속 단계에서 분류된다.[3][12]
5. 숙주 유기체에 재조합 DNA의 도입DNA 혼합물은 이전에 시험관 내에서 조작되었으며, 숙주 생물이라고 불리는 살아있는 세포로 다시 옮겨진다. DNA를 세포 내로 넣는 데 사용되는 방법은 다양하며, 분자 클로닝 과정의 이 단계에 적용되는 이름은 선택된 실험 방법에 따라 달라지는 경우가 많다(예: 형질전환, 형질도입, 트랜스펙션, 전기천공법).[3][12]
미생물이 주변 환경에서 DNA를 흡수하고 복제할 수 있을 때, 이 과정을 형질전환이라고 하며, DNA를 흡수할 수 있는 생리적 상태에 있는 세포를 능력이 있다고 한다.[16] 포유류 세포 배양에서, DNA를 세포 내로 도입하는 유사한 과정은 일반적으로 트랜스펙션이라고 한다. 형질전환과 트랜스펙션은 모두 일반적으로 사용되는 특정 종과 세포 유형에 따라 달라지는 특수한 성장 방식과 화학적 처리 과정을 통해 세포를 준비해야 한다.
전기천공법은 고전압 전기 펄스를 사용하여 세포막 (및 세포벽이 있는 경우 세포벽)을 가로질러 DNA를 이동시킨다.[17] 반대로, 형질도입은 DNA를 바이러스 유래 입자에 포장하고, 이러한 바이러스 유사 입자를 사용하여 캡슐화된 DNA를 바이러스 감염과 유사한 과정을 통해 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 전기천공법과 형질도입은 매우 특수한 방법이지만, DNA를 세포 내로 이동시키는 가장 효율적인 방법일 수 있다.
6. 재조합 DNA를 포함하는 유기체의 선택어떤 방법을 사용하든, 재조합 DNA를 선택된 숙주 유기체에 도입하는 것은 일반적으로 효율이 낮은 과정이다. 즉, 실제로 DNA를 섭취하는 세포는 소수이다. 실험 과학자들은 인공적인 유전자 선택 단계를 통해 이 문제를 해결한다. 이 단계에서 DNA를 섭취하지 않은 세포는 선택적으로 사멸되고, 벡터에 의해 암호화된 선택 마커 유전자를 포함하는 DNA를 활발하게 복제할 수 있는 세포만 생존할 수 있다.[3][12]
세균 세포가 숙주 유기체로 사용될 때, 선택 마커는 일반적으로 세포를 죽일 수 있는 항생제 (일반적으로 암피실린)에 대한 내성을 부여하는 유전자이다. 플라스미드를 가지고 있는 세포는 항생제에 노출되었을 때 생존하는 반면, 플라스미드 서열을 섭취하지 못한 세포는 죽는다. 포유류 세포 (예: 인간 또는 마우스 세포)가 사용될 때는 유사한 전략이 사용되지만, 마커 유전자 (이 경우 일반적으로 kanMX 카세트의 일부로 암호화됨)는 항생제 제네티신에 대한 내성을 부여한다.
7. 원하는 DNA 삽입물과 생물학적 특성을 가진 클론의 선별현대적인 세균 클로닝 벡터 (예: pUC19 및 이후 파생물, pGEM 벡터 포함)는 형질전환 세포 (클론)와 모체 벡터 (즉, 삽입된 재조합 서열이 없는 벡터 DNA)를 구분하기 위해 블루-화이트 스크리닝 시스템을 사용한다. 이러한 벡터에서 외래 DNA는 이 작업에 사용되는 배지에서 효소 활성의 결과로 파란색 콜로니를 형성하는 효소인 베타-갈락토시다제의 필수적인 부분을 암호화하는 서열에 삽입된다. 외래 DNA를 베타-갈락토시다제 코딩 서열에 삽입하면 효소의 기능이 비활성화되어 형질전환된 DNA를 포함하는 콜로니는 무색 (흰색)으로 유지된다. 따라서 실험자는 재조합 DNA를 포함하지 않는 콜로니를 무시하면서 형질전환 세균 클론을 쉽게 식별하고 추가 연구를 수행할 수 있다.
분자 클로닝 실험에서 얻은 개별 클론의 전체 집단을 종종 DNA 라이브러리라고 한다. 라이브러리는 (유기체로부터 완전한 게놈 DNA를 클로닝할 때처럼) 매우 복잡하거나 (이전에 클로닝된 DNA 단편을 다른 플라스미드로 옮길 때처럼) 비교적 단순할 수 있지만, 원하는 DNA 구조체를 얻을 수 있도록 여러 다른 클론을 검사해야 하는 경우가 거의 항상 필요하다. 이는 핵산 하이브리드화, 항체 프로브, 중합효소 연쇄 반응, 제한 효소 절편 분석 및/또는 DNA 염기서열 분석을 포함한 매우 광범위한 실험 방법들을 통해 수행될 수 있다.[3][12]
5. ''In silico'' 클로닝 및 시뮬레이션
대부분의 클로닝 실험은 실제 실험실에서 수행하기 전에 특수 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터에서 계획된다. 클로닝의 상세한 계획은 PCR 프라이머 설계를 위한 온라인 유틸리티와 함께 모든 텍스트 편집기에서 수행할 수 있지만, 이 목적을 위한 전용 소프트웨어가 존재한다. 예를 들어 ApE[1] (오픈 소스), DNAStrider[2] (오픈 소스), Serial Cloner[3] (무료), Collagene[4] (오픈 소스), 그리고 SnapGene[5] (상용) 등이 있다. 이러한 프로그램들은 PCR 반응, 제한 효소 절단, 연결 등을 시뮬레이션할 수 있다.
6. 응용
분자 클로닝은 다양한 생물학 분야에 응용된다.
- 게놈 연구: 여러 종의 게놈 DNA 서열을 밝히고, 종 내 유전적 다양성을 연구하는 데 사용된다. 무작위로 클로닝된 DNA 단편의 서열을 결정하고, 겹치는 서열을 조합하는 방식으로 이루어진다.
- 유전자 기능 연구: 프로브를 생성하여 유전자의 발현 양상과 생물학적 과정과의 관계를 조사한다. 유전자 불활성화, 부위 특이적 돌연변이 유발 등을 통해 유전자의 기능을 연구할 수 있다. 기능적 클로닝을 통해 발현된 단백질의 기능을 기반으로 유전자를 선별하기도 한다.
- 재조합 단백질 생산: 클로닝된 유전자를 이용하여 유용한 단백질을 생산할 수 있다. 예를 들어, 혈액 응고 인자 VIII([18]), 인슐린 ([19]), 조직 플라스미노겐 활성제 ([20]), B형 간염 백신 ([21]) 등이 있다.
- 유전자 변형 생물체 (GMO) 생산: 특정 유전자를 생물체에 삽입하여 형질전환 생물체를 만든다. 기초 생물학 연구(예: 형질전환 생쥐)뿐만 아니라, 의약품 생산, 제초제 내성 작물, 형광 열대어 (글로피쉬) ([1]) 등 상업적 목적으로도 활용된다.
- 유전자 치료: 유전자 치료는 기능성 유전자를 이용하여 질병을 치료하는 방법이다. (하위 섹션 '윤리적 문제'에서 자세히 다룸)
6. 1. 윤리적 문제
유전자 치료는 기능을 제대로 하지 못하는 세포에 기능성 유전자를 넣어 유전 질환이나 후천성 질환을 고치는 것을 목표로 한다. 유전자 치료는 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 첫 번째는 정자나 난자 같은 생식 세포를 바꾸는 것이다. 이는 전체 유기체와 다음 세대에 영구적인 유전적 변화를 일으킨다. 많은 사람들은 이러한 "생식 계열 유전자 치료"를 인간에게 비윤리적인 것으로 생각한다.[22] 두 번째 유형의 유전자 치료는 "체세포 유전자 치료"인데, 이는 장기 이식과 비슷하다. 이 경우에는 하나 이상의 특정 조직을 직접 치료하거나, 조직을 제거하고 실험실에서 치료 유전자 또는 유전자들을 추가한 다음, 치료된 세포를 환자에게 다시 돌려주는 방식으로 치료한다. 체세포 유전자 치료의 임상 시험은 1990년대 후반에 시작되었으며, 주로 암, 혈액, 간, 폐 질환 치료를 위해 시행되었다.[23]많은 홍보와 약속에도 불구하고, 인간 유전자 치료의 역사는 비교적 제한적인 성공을 거두었다.[23] 유전자를 세포에 넣는 것은 종종 치료받는 질병 증상에 대해 부분적이고 일시적인 완화만을 가져온다. 일부 유전자 치료 시험 환자는 치료 자체의 부작용으로 사망하기도 했다. 어떤 경우에는 삽입 불활성화로 인해 환자의 게놈 내 필수 유전자가 파괴되어 부작용이 생기기도 한다. 또 다른 경우에는 유전자 치료에 사용된 바이러스 벡터가 감염성 바이러스로 오염되기도 했다. 그럼에도 불구하고, 유전자 치료는 여전히 미래 의학의 유망한 분야로 여겨지며, 많은 연구 개발 활동이 이루어지고 있다.
참조
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