벡터 (분자생물학)

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1. 개요

벡터는 분자생물학에서 유전 물질을 세포 내로 전달하는 데 사용되는 운반체로, 플라스미드, 바이러스 벡터, 인공 염색체 등으로 분류된다. 플라스미드는 세균에서 유래하여 유전자 클로닝에 활용되며, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 등을 활용하여 유전자 치료, 백신 개발 등에 기여한다. 인공 염색체는 유전체 연구에 사용되며, 비바이러스성 벡터는 안전성을 확보하기 위해 연구되고 있다. 벡터는 복제 기점, 프로모터, 클로닝 부위, 유전자 마커, 리포터 유전자, 단백질 정제 태그 등을 포함하며, 유전자 클로닝, 발현, 치료, 형질전환 등에 활용된다.

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벡터 (분자생물학)

2. 벡터의 종류

벡터는 크게 플라스미드, 바이러스 벡터, 인공 염색체 등으로 나눌 수 있다.

플라스미드 - 원핵생물과 균류에서 발견되며 조작이 용이하여 많이 사용되는 벡터이다. 제한 효소로 절단되었을 때 점착성 말단이 형성되면 DNA 연결이 용이하다. 엠피실린, 카나마이신, 클로람페니클 등의 항생제 내성 유전자가 유전적 표지 역할을 하며, 진핵생물과는 복제원점이 달라 플라스미드가 발현되지 않는다.
바이러스 벡터 - 비감염성으로 개조된 바이러스나 파지(세균에 감염되는 바이러스)의 복제 시스템을 이용한다. 바이러스 프로모터를 통해 도입 유전자의 전사 및 번역을 수행할 수 있다.
인공 염색체 - 효모 인공 염색체(YAC), 세균 인공 염색체(BAC), 사람 인공 염색체(HAC) 등으로 나뉜다. 다른 벡터에 비해 매우 큰 DNA 단편을 삽입할 수 있어 유전체 연구 등에 활용된다.^[20]
비바이러스성 벡터 - 대량 생산이 가능하고, 바이러스 재생산 염려가 없으며, 삽입 가능한 유전자 크기 제한이 없다는 장점이 있다. 대표적인 예로는 리포솜을 들 수 있다. 하지만 효율이 낮다.

pBR322 플라스미드는 클로닝 벡터로 널리 사용되는 플라스미드 중 하나이다.

2. 1. 플라스미드 벡터

플라스미드는 세균 내에서 염색체와 독립적으로 증식하는 고리형 DNA이다. 조작이 용이하고 대량 생산이 가능하여 가장 널리 사용되는 벡터이다.^[7] 플라스미드 벡터는 숙주 내에서 플라스미드의 반독립적 복제를 허용하는 복제 기점을 반드시 가지고 있다.^[8] 플라스미드는 대장균과 같은 많은 세균에서 널리 발견되며, 사카로마이세스 세레비시에와 같은 일부 진핵생물에서도 발견될 수 있다.^[8]

플라스미드는 접합성과 비접합성으로 나눌 수 있다.

접합성 플라스미드: 접합을 통해 DNA 전달을 매개하여 개체군 내의 세균 세포 사이에서 빠르게 확산된다. (예: F 플라스미드)
비접합성 플라스미드: 접합을 통해 DNA를 매개하지 않는다.

실험실에서는 클로닝 목적으로 특수하게 구성된 플라스미드가 흔히 사용된다. 이러한 플라스미드는 일반적으로 비접합성이며, 여러 제한 효소 절단 부위가 있는 "다중 클로닝 부위"를 가지고 있어 형질전환 유전자 삽입이 용이하다. 플라스미드를 포함하는 세균은 몇 시간 만에 수백만 개의 벡터 사본을 생성할 수 있으며, 증폭된 벡터는 추가 조작을 위해 세균에서 추출할 수 있다.

플라스미드는 전사 벡터로 사용될 수 있으며, 이 경우 단백질 발현에 중요한 서열이 없을 수 있다. 발현 벡터라고 하는 단백질 발현에 사용되는 플라스미드는 리보솜 결합 부위, 개시 코돈, 종결 코돈과 같은 단백질 번역 요소를 포함한다.

대표적인 플라스미드 벡터로는 pBR322, pUC 플라스미드, pET 플라스미드 등이 있다.

2. 1. 1. pBR322

pBR322는 클로닝 벡터로 널리 사용된 최초의 플라스미드 중 하나이다.

pBR322는 1977년에 구축된 초기형 클로닝 벡터이다. 암피실린 내성 유전자와 테트라사이클린 내성 유전자를 가지며, 제한 효소 절단 부위를 이용하여 목적 유전자를 클로닝할 수 있다. ColE1형으로, 1개의 세포당 15~20개의 플라스미드가 유지된다. pBR322를 바탕으로 많은 개량형 플라스미드 벡터가 만들어졌다.^[7]

2. 1. 2. pUC 플라스미드 벡터

pUC19/pUC18 등은 대표적인 pUC 플라스미드 벡터이다. 암피실린 내성 유전자를 가지고 있으며, 삽입된 DNA 단편 유무를 블루-화이트 스크리닝으로 판별할 수 있어, 일반적으로 서브클로닝 실험이나 플라스미드의 대량 조제에 이용된다.^[18] ColE1 복제 기점을 가지며, 세포당 500~700개의 플라스미드가 유지된다.^[19]

pUC 플라스미드는 다음 구성 요소를 포함한다.

구성 요소	설명
lac 프로모터	락토스 오페론의 프로모터로, IPTG(이소프로필-1-티오-β-갈락토시드) 등의 존재 하에 lacZ α와 MCS에 삽입된 서열을 전사한다.
MCS	멀티 클로닝 사이트(Multiple Cloning Site). 다양한 제한 효소에 인식되는 서열이 존재하는 부위로, 외래 DNA 서열을 삽입하는 데 사용된다.
lacZ α	lacZ의 α 절편. MCS에 외래 DNA가 삽입되면 기능하는 lacZ α 단백질이 번역되지 않아, lacZ ω를 가진 숙주에 형질전환했을 때 블루-화이트 스크리닝으로 삽입 단편 유무를 간이 검정할 수 있다.
암피실린 내성 유전자	항생 물질 내성 유전자의 일종. 암피실린 존재 하에서도 숙주 대장균이 증식할 수 있도록 하여, 벡터를 가진 대장균만을 선택적으로 얻을 수 있게 한다.
ColE1	대장균 내에서 플라스미드를 복제하기 위한 복제 기점. 비교적 많은 수의 플라스미드를 하나의 세포 내에 유지한다.

2. 1. 3. pET 계열 플라스미드 벡터

pET 계열 플라스미드는 T7 프로모터를 이용하여 목적 유전자를 연결하고, T7 RNA 중합효소에 의한 특이적 전사를 통해 유도형 고발현을 유도하는 플라스미드 벡터이다. 주로 암피실린 또는 카나마이신 내성 유전자를 가지며, ColE1 복제 기점을 가져 세포당 15–20개 정도 유지된다.

2. 2. 바이러스 벡터

바이러스 벡터는 유전자 조작된 바이러스로, 감염성이 없도록 수정된 바이러스 DNA 또는 RNA를 운반하지만, 여전히 바이러스 프로모터를 통해 형질전환 유전자의 번역을 가능하게 한다. 바이러스 벡터는 종종 삽입체를 숙주 게놈에 영구적으로 통합하도록 설계되어 형질전환 유전자를 통합한 후 숙주 게놈에 뚜렷한 유전자 표지를 남긴다. 예를 들어, 레트로바이러스는 삽입 후 특징적인 레트로바이러스 통합 패턴을 남기며, 이는 감지 가능하며 바이러스 벡터가 숙주 게놈에 통합되었음을 나타낸다.^[14]

비감염성으로 개조된 바이러스나 파지(세균에 감염되는 바이러스)의 복제 시스템을 이용한다. 바이러스 프로모터를 통해 도입 유전자의 전사 및 번역을 수행할 수 있다. λ 파지 벡터나 RSV 벡터 등의 바이러스 벡터를 제외하고, 재조합 바이러스는 대부분 단독으로는 바이러스 입자로 패키징되지 않는다. 따라서 결실 유전자를 보충하기 위해 패키징 세포를 생성하고, 여기에 감염시킬 필요가 있다. 이 세포에서 생성된 재조합 바이러스는 숙주에 감염되면 외래 유전자를 발현할 수 있지만, 패키징에 필요한 유전자를 가지고 있지 않으므로 자기 복제는 할 수 없다. 이러한 특성을 이용하여, 사람에 대한 유전자 치료에 사용되기도 한다.^[1]

레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스의 특징은 다음과 같다.

종류	설명
레트로바이러스	RNA 바이러스의 일종으로, 역전사 효소를 이용하여 자신의 유전 정보를 DNA 형태로 숙주 세포의 유전체에 삽입한다. 분열 중인 세포에만 감염될 수 있다는 특징이 있다.
아데노바이러스	DNA 바이러스로, 다양한 세포에 감염될 수 있으며, 숙주 세포의 DNA에 삽입되지 않아 비교적 안전하다고 평가된다. 하지만, 감기를 통해 이미 항체를 가진 사람이 많아 면역 반응이 나타날 수 있다.
아데노 관련 바이러스	다른 바이러스(주로 아데노바이러스)의 도움을 받아야 증식할 수 있는 작은 DNA 바이러스이다. 면역원성이 낮고 장기간 유전자 발현이 가능하다는 장점이 있다.

2. 2. 1. 레트로바이러스 벡터

레트로바이러스는 RNA 바이러스의 일종으로, 역전사 효소를 이용하여 자신의 유전 정보를 DNA 형태로 숙주 세포의 유전체에 삽입한다. 레트로바이러스 벡터는 분열 중인 세포에만 감염될 수 있으며, 숙주 게놈에 삽입된 후에는 레트로바이러스 통합 패턴을 남겨 삽입 여부를 확인할 수 있다.^[1] 그러나 무작위적인 유전자 삽입으로 인해 돌연변이를 유발할 가능성이 있다는 단점이 존재한다.

과거 황우석 박사의 줄기세포 연구 과정에서 레트로바이러스 벡터가 사용되었는데, 이와 관련하여 안전성 문제 및 윤리적 논란이 제기되기도 하였다.

2. 2. 2. 아데노바이러스 벡터

아데노바이러스는 DNA 바이러스로, 다양한 세포에 감염될 수 있으며, 숙주 세포의 DNA에 삽입되지 않아 비교적 안전하다고 평가된다. 사람에 대한 유전자 치료에도 사용된다. 그러나 감기를 통해 이미 항체를 가진 사람이 많아 면역 반응이 나타날 수 있고, 장기간 유전자 발현이 어렵다는 단점이 있다.^[1]

한국의 여러 제약 회사들이 아데노바이러스 벡터를 기반으로 한 코로나19 백신 개발에 참여하여, 국민들에게 백신 접종 기회를 제공하고 감염병 확산 방지에 기여했다.^[1]

2. 2. 3. 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터

아데노 관련 바이러스는 다른 바이러스(주로 아데노바이러스)의 도움을 받아야 증식할 수 있는 작은 DNA 바이러스이다. 면역원성이 낮고 장기간 유전자 발현이 가능하다는 장점이 있어 사람에 대한 유전자 치료에 사용되기도 한다.^[1]

2. 3. 인공 염색체 벡터

인공 염색체는 효모 인공 염색체(YAC), 세균 인공 염색체(BAC), 인간 인공 염색체(HAC) 등으로 나뉜다. 다른 벡터에 비해 매우 큰 DNA 단편을 삽입할 수 있어 유전체 연구 등에 활용된다.^[9] 인공 염색체는 복제 기점, 중심체, 텔로미어 말단 서열을 필수 요소로 포함하며, YAC와 BAC는 최대 300,000개의 뉴클레오티드로 구성된 DNA 조각을 운반할 수 있다.^[10]

2. 3. 1. 효모 인공 염색체 (YAC)

출아 효모를 숙주로 하는 인공 염색체 벡터이다. 클로닝할 수 있는 DNA 단편이 수 Mb로 거대하기 때문에 장대한 컨티그를 제작하는 데 적합하지만, 키메라 클론이 발생하기 쉽고, 클로닝한 단편을 안정적으로 보존할 수 없다는 단점이 있다.

2. 3. 2. 세균 인공 염색체 (BAC)

대장균을 숙주로 하는 인공 염색체 벡터이다. F 플라스미드의 복제계를 이용하며, 최대 약 300kb 크기의 DNA 단편을 안정적으로 클로닝할 수 있다.

2. 3. 3. P1 유래 인공 염색체 (PAC)

P1 파지의 복제계를 이용하는 클로닝 벡터이다. 세균 인공 염색체(BAC)와 마찬가지로 최대 약 300kb의 DNA 단편을 안정적으로 클론화할 수 있다.

2. 4. 비바이러스성 벡터

비바이러스성 벡터는 대량 생산이 가능하고 위험성이 없다는 장점이 있다. 또한 바이러스 벡터는 원래의 바이러스를 재생산할 수 있는 단점이 있는 반면, 비바이러스성 벡터는 그럴 염려가 없으며 벡터에 삽입 가능한 유전자 크기 제한이 없다. 대표적인 예로는 리포솜을 들 수 있다. 하지만 효율이 낮다.

3. 벡터의 특징

현대적으로 인공 제작된 벡터는 필수 구성 요소 외에도 다양한 기능을 포함할 수 있다.

복제 기점: 숙주 세포 내에서 벡터가 복제되고 유지되기 위해 필요하다.
프로모터: 벡터 내 유전자(도입 유전자, 항생제 내성 유전자 등)의 전사를 촉진한다. 클로닝 벡터에는 삽입물에 대한 프로모터가 필요 없을 수 있지만, 발현 벡터에서는 필수적이다.
클로닝 부위: 외래 DNA를 벡터에 삽입할 수 있는 멀티플 클로닝 부위 등의 영역이다.
유전자 마커: 벡터가 숙주 게놈 DNA와 통합되었는지 확인하는 데 사용된다.
항생제 내성 유전자: 항생제가 포함된 배지에서 벡터를 흡수한 세포만 생존할 수 있게 하여, 벡터를 가진 세포를 선택적으로 배양할 수 있다.
항원 결정기: 일부 벡터는 특정 항원 결정기 서열을 포함하여, 발현된 단백질에 대한 항체 식별을 용이하게 한다.
리포터 유전자: 삽입된 DNA 서열을 포함하는 플라스미드를 쉽게 식별할 수 있게 해주는 유전자이다. 예를 들어, ''lacZ-α'' 유전자는 β-갈락토시다아제의 N-말단 단편을 코딩하며, 멀티플 클로닝 부위가 이 유전자 내에 위치한다. 외래 DNA 삽입 성공 시 ''lacZ-α'' 유전자가 파괴되어 청백색 스크리닝으로 쉽게 확인 가능하다.
타겟팅 서열: 발현된 단백질을 세포 내 특정 위치(세포 소기관, 페리플라즘 등)로 유도하는 서열을 추가할 수 있다.
단백질 정제 태그: 폴리히스티딘 태그, 글루타티온-S-전이효소 등 발현된 단백질의 정제를 쉽게 하는 서열을 포함한다. 일부 태그는 단백질 용해도를 높이기도 하며, 프로테아제 절단 부위를 통해 추후 제거 가능하다.

벡터는 단순한 DNA 및 RNA 서열로, 삽입 서열(도입 유전자)을 다른 세포에 도입하는 운반체 역할을 한다. 일반적으로 유전 정보를 세포에 도입하는 목적은 표적 세포에서 도입 유전자를 분리, 증폭(클로닝), 발현하는 것이다. 모든 벡터는 클로닝에 사용 가능하지만, 클로닝 목적에 특화된 '''클로닝 벡터'''가 주로 이용된다. 도입 유전자의 전사 및 단백질 발현을 위한 '''발현 벡터'''는 프로모터 서열을 통해 번역을 촉진한다. '''전사 벡터'''는 전사만을 목적으로 하며, mRNA 증폭에 사용된다.

DNA 조작은 주로 대장균 벡터로 수행되지만, 효모, 식물, 포유동물 세포 등에서 사용되는 셔틀 벡터도 존재한다. 셔틀 벡터는 비세균 숙주 생물에 이입 가능한 세균·바이러스적 요소를 가진다.^[14]

벡터를 세포에 넣는 방법은 세균 세포의 경우 형질전환^[15], 진핵생물 세포는 트랜스펙션^[16], 바이러스 벡터는 형질도입^[17]이라고 한다.

3. 1. 복제 기점

플라스미드 벡터는 숙주 내에서 플라스미드의 반독립적 복제를 허용하는 복제 기점으로 구성된다.^[7] 복제 기점은 숙주 세포에서 벡터의 복제 및 유지를 위해 필요하다.

3. 2. 프로모터

프로모터는 전사를 유도하는 데 사용되는 DNA 서열이다. 일부 클로닝 벡터는 클론된 삽입물에 대한 프로모터가 필요하지 않지만, 클론된 생성물을 발현할 수 있도록 하는 발현 벡터의 필수 구성 요소이다.^[22] 유전자는 전사를 통해 여러 개의 mRNA를 생성하며, mRNA의 복제본 수는 벡터에 사용된 프로모터에 따라 달라진다.^[23]

발현은 구성적일 수 있는데, 이는 단백질이 지속적으로 생성됨을 의미하며, 유도 가능할 수도 있는데, 이는 특정 조건(예: 화학적 유도제를 첨가했을 때)에서만 단백질이 발현됨을 의미한다. 이 두 가지 유형의 발현은 사용된 프로모터와 오퍼레이터의 유형에 따라 달라진다.^[24]

바이러스 프로모터는 많은 세포주 및 유형에서 일정한 전사를 강제하기 때문에 플라스미드와 바이러스 벡터에서 구성적 발현에 자주 사용된다.^[13] 유도 가능한 발현은 유도 조건에 반응하는 프로모터에 따라 달라진다. 예를 들어, 생쥐 유선 종양 바이러스 프로모터는 덱사메타손 투여 후에만 전사를 시작하며, ''초파리'' 열 충격 프로모터는 고온 후에만 전사를 시작한다.

일반적으로 사용되는 유도 프로모터는 ''lac'' 오페론과 T7 프로모터에서 유래한 프로모터이다. 또한, 다른 강력한 프로모터로 Trp 프로모터와 Lac Operon 프로모터의 하이브리드인 Trp 프로모터와 Tac-Promoter가 있다.

3. 3. 클로닝 부위 (MCS)

다중 클로닝 부위(Multiple Cloning Site, MCS)는 다양한 제한 효소 인식 서열이 모여 있는 영역이다. 이 부위를 적절한 제한 효소를 사용하여 절단하고, 외부 DNA 서열을 삽입할 수 있다.^[7] 다중 클로닝 부위는 ''lacZ'' α 절편 내에 위치하여, 외부 DNA가 삽입되면 기능하는 lacZ α 단백질이 번역되지 않는다. 이러한 특징은 블루-화이트 스크리닝을 통해 삽입된 DNA 단편 유무를 쉽게 확인할 수 있게 해준다.^[7]

3. 4. 유전자 마커

유전자 마커는 벡터가 숙주 세포에 성공적으로 도입되었는지 확인하는 데 사용되는 유전자이다. 바이러스 벡터의 경우, 유전자 마커를 통해 벡터가 숙주 게놈 DNA와 통합되었는지 확인할 수 있다.^[7]

일부 벡터는 삽입된 DNA 서열을 포함하는 플라스미드를 식별할 수 있는 리포터 유전자를 포함하기도 한다. 예를 들어, ''lacZ-α''는 β-갈락토시다아제의 N-말단 단편을 코딩하는데, 이 유전자 내에 다중 클로닝 부위가 위치한다. 외래 DNA가 성공적으로 삽입되면 ''lacZ-α'' 유전자 서열이 파괴되어 비활성 β-갈락토시다아제가 생성된다. 이를 X-gal을 포함하는 배지에서 배양하여 청백색 스크리닝으로 쉽게 확인할 수 있다. 즉, β-갈락토시다아제를 발현하는 세포는 파란색 콜로니를 형성하고, 삽입물을 포함할 가능성이 있는 세포는 흰색 콜로니를 형성한다.^[7]

이 외에도 녹색 형광 단백질, 루시페라아제 등이 리포터 유전자로 사용될 수 있다.^[7]

3. 5. 항생제 내성 유전자

항생제 내성 개방형 리딩 프레임을 가진 벡터는 항생제가 포함된 배지에서 항생제 선택을 통해 벡터를 흡수한 세포가 생존할 수 있게 한다.^[7] 이러한 항생제 내성 유전자는 암피실린과 같은 항생제가 있는 환경에서도 대장균이 증식할 수 있게 하여, 벡터를 가진 대장균만을 선택적으로 배양할 수 있도록 돕는다.

3. 6. 리포터 유전자

리포터 유전자는 삽입된 DNA 단편의 유무를 쉽게 확인할 수 있도록 하는 유전자이다. β-갈락토시다아제(LacZ), 녹색 형광 단백질(GFP), 루시페라아제 등이 주로 사용된다.^[7]

일반적으로 사용되는 리포터 유전자는 다음과 같다.

'''β-갈락토시다아제''': 갈락토스를 분해하는 효소의 N-말단 단편을 코딩하는 ''lacZ-α''를 이용한다. 멀티플 클로닝 부위(MCS)가 ''lacZ-α'' 내에 위치하며, 성공적으로 DNA 단편이 삽입되면 유전자 서열이 파괴되어 β-갈락토시다아제가 비활성화된다. X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드)과 같은 갈락토스 유사체를 포함하는 배지에서 세포를 배양하면, β-갈락토시다아제를 발현하는 세포(삽입물이 없는 세포)는 파란색 콜로니를 형성하고, 삽입물이 있는 세포는 흰색 콜로니를 형성한다. 이를 청백색 선택이라고 한다.
'''녹색 형광 단백질(GFP)'''
'''루시페라아제'''

과거 리포터 유전자를 활용한 연구 결과를 왜곡하여 대중을 현혹시키려는 시도가 있었다.

3. 7. 단백질 정제 태그

일부 발현 벡터는 발현된 단백질의 정제를 쉽게 하기 위해 단백질 또는 펩타이드 서열을 포함하는데, 이를 단백질 정제 태그라고 한다. 주로 사용되는 단백질 정제 태그에는 폴리히스티딘 태그, 글루타티온-S-전이효소, 말토스 결합 단백질 등이 있다.^[8] 이 태그들 중 일부는 표적 단백질의 용해도를 높이기도 한다. 표적 단백질은 단백질 태그와 융합되지만, 단백질과 태그 사이의 폴리펩타이드 링커 영역에 프로테아제 절단 부위를 배치하여 나중에 태그를 제거할 수 있다.^[8]

4. 벡터의 활용

벡터는 DNA 및 RNA 서열이며, 삽입 서열(도입 유전자)을 다른 세포 등에 도입하기 위한 운반체(백본)로 기능한다. 일반적으로 세포에 유전 정보를 이입하는 목적은 표적 세포에서 도입 유전자를 단리(isolate)하거나, 증폭(cloning)하거나, 발현(express)시키는 경우가 많다.

벡터는 다음과 같은 다양한 분야에서 활용된다.

'''유전자 클로닝:''' 클로닝 목적에 특화되어 설계된 '''클로닝 벡터'''는 라이브러리 작성에 이용된다.
'''유전자 발현:''' 도입 유전자의 전사나 단백질 발현 등의 목적을 위해 설계된 '''발현 벡터'''는 프로모터 서열을 결합하여 삽입한 DNA 단편으로부터 단백질의 번역을 촉진시킨다.
'''전사 벡터''': 전사만을 목적으로 하며, 도입 대상 세포 내에서 복제는 가능하지만, 도입 유전자의 번역은 수행할 수 없다. 따라서 삽입 유전자를 mRNA로 증폭하는 목적으로 사용된다.
'''유전자 치료''': 비감염성으로 개조된 바이러스나 파지(세균에 감염되는 바이러스)의 복제 시스템을 이용한다. 바이러스 프로모터를 통해 도입 유전자의 전사 및 번역을 수행할 수 있다.
'''백신 개발''': 바이러스 벡터는 특정 병원체의 유전자를 벡터에 삽입하여 체내에 주입함으로써 면역 반응을 유도하는 데 사용된다.

4. 1. 유전자 클로닝

플라스미드는 이중 가닥의 염색체 외 DNA 서열로, 일반적으로 원형이며 숙주 세포의 복제 기구를 사용하여 복제할 수 있다.^[7] 플라스미드 벡터는 최소한 숙주 내에서 플라스미드의 반독립적 복제를 허용하는 복제 기점으로 구성된다. 특수하게 구성된 기능을 가진 플라스미드는 실험실에서 클로닝 목적으로 흔히 사용된다. 이러한 플라스미드는 일반적으로 비접합성이지만 더 많은 기능을 가질 수 있으며, 특히 여러 제한 효소 절단 부위가 있는 "다중 클로닝 부위"가 있어 형질전환 유전자 삽입물을 삽입할 수 있다. 플라스미드를 포함하는 박테리아는 몇 시간 만에 박테리아 내에서 벡터의 수백만 개 사본을 생성할 수 있으며, 증폭된 벡터는 추가 조작을 위해 박테리아에서 추출할 수 있다. 플라스미드는 특히 전사 벡터로 사용될 수 있으며, 이러한 플라스미드는 단백질 발현에 중요한 서열이 없을 수 있다. 발현 벡터라고 하는 단백질 발현에 사용되는 플라스미드는 리보솜 결합 부위, 개시 코돈 및 종결 코돈과 같은 단백질 번역 요소를 포함한다.

클로닝 벡터의 예시에는 다음과 같은 요소들이 포함될 수 있다.

요소	설명
lac 프로모터	락토스 오페론의 프로모터. IPTG 등의 존재 하에 lacZ α와 MCS에 삽입된 서열을 전사한다.
MCS	다중 클로닝 부위. 다양한 제한 효소에 인식되는 서열이 존재하는 부위. 이것을 적당한 제한 효소로 절단하여 외래 DNA 서열을 삽입한다.
lacZ α	lacZ의 α 절편. MCS에 외래 DNA가 삽입되면 기능하는 lacZ α 단백질이 번역되지 않게 된다. 이 때문에 lacZ ω를 가진 숙주에 형질전환했을 때 블루-화이트 스크리닝으로 삽입 단편의 유무를 간이 검정할 수 있다.
암피실린 내성 유전자	항생 물질 내성 유전자의 일종. 암피실린 존재 하에서도 숙주 대장균이 증식하는 것을 가능하게 한다. 따라서 이 벡터를 가지고 있는 대장균만을 선택적으로 얻을 수 있게 된다. 다른 항생 물질의 내성 유전자를 가진 벡터도 있다.
ColE1	대장균 내에서 플라스미드를 복제하기 위한 복제 기점. 비교적 다수의 플라스미드를 1 세포 내에 유지한다.

4. 2. 유전자 발현

발현 벡터는 특정 유전자를 세포 내에서 발현시켜 단백질을 생산하는 데 사용된다.^[22] 유전자 발현이 필요할 때 벡터의 필수적인 요소는 복제된 유전자의 전사이다. 하나의 유전자는 전사를 통해 증폭되어 여러 개의 mRNA를 생성할 수 있으며, 이는 번역을 통해 단백질이 생성되는 주형이 된다.^[11] mRNA 복제본 수는 벡터에 사용된 프로모터에 따라 달라지며, 더 많은 수의 mRNA는 더 많은 양의 단백질을 발현시킨다.^[12]

발현은 구성적일 수 있는데, 이는 단백질이 지속적으로 생성됨을 의미한다. 또는 유도 가능할 수도 있는데, 이는 특정 조건(예: 화학적 유도제 첨가)에서만 단백질이 발현됨을 의미한다. 이 두 가지 유형의 발현은 사용된 프로모터와 오퍼레이터의 유형에 따라 달라진다.^[23]

바이러스 프로모터는 일반적으로 많은 세포주와 유형에서 일정한 전사를 강제하기 때문에 플라스미드와 바이러스 벡터에서 구성적 발현에 자주 사용된다.^[13] 유도 가능한 발현은 유도 조건에 반응하는 프로모터에 따라 달라진다. 예를 들어, 생쥐 유선 종양 바이러스 프로모터는 덱사메타손 투여 후에만 전사를 시작하며, ''초파리'' 열 충격 프로모터는 고온 후에만 전사를 시작한다.^[24]

일부 벡터는 ''생체 외'' mRNA 생산과 같이 전사만을 위해 설계되었으며, 이러한 벡터를 전사 벡터라고 한다. 이들은 폴리아데닐화 및 종결에 필요한 서열이 없을 수 있으므로 단백질 생산에 사용될 수 없다.

발현 벡터는 삽입된 유전자의 전사 및 그에 따른 mRNA의 번역을 통해 단백질을 생성한다. 따라서 단순 전사 벡터보다 더 많은 구성 요소가 필요하다. 서로 다른 숙주 생물체에서의 발현에는 서로 다른 요소가 필요하다. 예를 들어, 전사 개시를 위한 프로모터, 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위, 종결 신호 등이 있다.

프로모터 - 일반적으로 사용되는 유도성 프로모터는 ''lac'' 오페론 및 T7 프로모터에서 파생된 프로모터이다. 사용되는 다른 강력한 프로모터로는 Trp 프로모터와 Trp 및 Lac 오페론 프로모터의 하이브리드인 Tac 프로모터가 있다.
리보솜 결합 부위(RBS) - 프로모터 뒤에 위치하며, 관심 단백질의 효율적인 번역을 촉진한다.
번역 개시 부위 - AUG 개시 코돈의 8개 염기쌍 상류에 있는 RBS에 포함된 샤인-달가노 서열.

진핵 세포 발현 벡터는 다음을 인코딩하는 서열이 필요하다.

폴리아데닐화 꼬리: 전사된 pre-mRNA의 끝에 폴리아데닐화 꼬리를 생성하여 mRNA를 엑소뉴클레아제로부터 보호하고 전사 및 번역 종결을 보장한다. mRNA 생성을 안정화시킨다.
최소 UTR 길이: UTR은 전사 또는 번역을 방해할 수 있는 특정 특성을 포함하므로 가장 짧은 UTR 또는 전혀 없는 UTR이 최적의 발현 벡터에 인코딩된다.
코작 서열: 벡터는 mRNA에 코작 서열을 인코딩해야 하며, 이는 mRNA의 번역을 위해 리보솜을 조립한다.

4. 3. 유전자 치료

바이러스 벡터는 유전자 조작된 바이러스로, 감염성이 없도록 수정된 바이러스 DNA 또는 RNA를 운반하지만, 여전히 바이러스 프로모터와 형질전환 유전자를 포함하고 있어 바이러스 프로모터를 통해 형질전환 유전자의 번역을 가능하게 한다. 그러나 바이러스 벡터는 감염성 서열이 없는 경우가 많기 때문에 대규모 형질감염을 위해서는 헬퍼 바이러스 또는 패키징 라인이 필요하다. 바이러스 벡터는 종종 삽입체를 숙주 게놈에 영구적으로 통합하도록 설계되어 형질전환 유전자를 통합한 후 숙주 게놈에 뚜렷한 유전자 표지를 남긴다.^[1] 예를 들어, 레트로바이러스는 삽입 후 특징적인 레트로바이러스 통합 패턴을 남기며, 이는 감지 가능하며 바이러스 벡터가 숙주 게놈에 통합되었음을 나타낸다.^[1]

사람에 대한 유전자 치료에는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 등을 이용하며, 이러한 바이러스 벡터는 결함이 있는 유전자를 정상 유전자로 대체하거나 새로운 유전자를 도입하여 질병을 치료하는 데 사용된다. 비감염성으로 개조된 바이러스나 파지(세균에 감염되는 바이러스)의 복제 시스템을 이용하며, 바이러스 프로모터를 통해 도입 유전자의 전사 및 번역을 수행할 수 있다.^[2]

완전한 복제 능력을 가진 λ 파지 벡터나 RSV 벡터 등의 바이러스 벡터를 제외하고, 재조합 바이러스는 대부분 단독으로는 바이러스 입자로 패키징되지 않는다. 따라서 결실 유전자를 보충하기 위해 패키징 세포를 생성하고, 여기에 감염시킬 필요가 있다. 이 세포에서 생성된 재조합 바이러스는 숙주에 감염되면 외래 유전자를 발현할 수 있지만, 패키징에 필요한 유전자를 가지고 있지 않으므로 자기 복제는 할 수 없다.^[2] 이러한 특성은 난치병 치료의 새로운 가능성을 제시하지만, 윤리적, 사회적 문제를 야기할 수 있으므로 신중한 접근이 필요하다.

4. 4. 백신 개발

바이러스 벡터는 특정 병원체의 유전자를 벡터에 삽입하여 체내에 주입함으로써 면역 반응을 유도하는 데 사용된다. 바이러스 벡터는 감염성이 없도록 조작된 바이러스 DNA 또는 RNA를 운반하지만, 바이러스 프로모터와 형질전환 유전자를 포함하고 있어 바이러스 프로모터를 통해 형질전환 유전자의 번역을 가능하게 한다.^[1]

바이러스나 파지(세균에 감염되는 바이러스)의 복제 시스템을 이용하며, 바이러스 프로모터를 통해 도입 유전자의 전사 및 번역을 수행할 수 있다.^[1]

λ 파지 벡터나 RSV 벡터 등 완전한 복제 능력을 가진 바이러스 벡터를 제외하고, 재조합 바이러스는 대부분 단독으로 바이러스 입자로 패키징되지 않는다. 따라서 결실 유전자를 보충하기 위해 패키징 세포를 생성하고, 여기에 감염시킬 필요가 있다. 이 세포에서 생성된 재조합 바이러스는 숙주에 감염되면 외래 유전자를 발현할 수 있지만, 패키징에 필요한 유전자를 가지고 있지 않으므로 자기 복제는 할 수 없다. 이러한 특성을 이용하여, 사람에 대한 유전자 치료 (레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 등)에 사용되기도 한다.^[1]

참조

_[1] 웹사이트 Vector http://www.genome.go[...] 2022-04-16
_[2] 서적 Molecular Cell Biology W. H. Freeman 2000
_[3] 서적 Principles of Plant Genetics and Breeding https://books.google[...] John Wiley & Sons Inc 2012-08-16
_[4] 논문 Bacterial transformation: distribution, shared mechanisms and divergent control 2014-03
_[5] 웹사이트 MeSH Browser https://meshb.nlm.ni[...] 2018-04-16
_[6] 서적 Genetics: principles and analysis https://archive.org/[...] Jones and Bartlett Publishers 1998
_[7] 논문 Replication and Control of Circular Bacterial Plasmids 1998-06
_[8] 서적 Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction Wiley-Blackwell 2010
_[9] 서적 Molecular Life Sciences Springer, New York, NY 2014
_[10] 논문 Artificial Chromosomes 1987-11
_[11] 서적 Biology Brooks/Cole Thomson Learning 2005
_[12] 논문 A comparative analysis of constitutive promoters located in adeno-associated viral vectors 2014-08-29
_[13] 논문 Viral promoters can initiate expression of toxin genes introduced into Escherichia coli 2005-06
_[14] 서적 Principles of Plant Genetics and Breeding https://books.google[...] John Wiley & Sons Inc 2012-08-16
_[15] 논문 Bacterial transformation: distribution, shared mechanisms and divergent control 2014-03
_[16] 웹사이트 MeSH Browser https://meshb.nlm.ni[...] 2018-04-16
_[17] 서적 Genetics: principles and analysis https://archive.org/[...] Jones and Bartlett Publishers 1998
_[18] 논문 Replication and Control of Circular Bacterial Plasmids 1998-06
_[19] 서적 Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction Wiley-Blackwell 2010
_[20] 서적 Molecular Life Sciences Springer, New York, NY 2014
_[21] 논문 Artificial Chromosomes null 1987-11
_[22] 서적 Biology Brooks/Cole Thomson Learning 2005
_[23] 논문 A comparative analysis of constitutive promoters located in adeno-associated viral vectors 2014-08-29
_[24] 논문 Viral promoters can initiate expression of toxin genes introduced into Escherichia coli 2005-06

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