핵자기 공명 분광법

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1. 개요

핵자기 공명 분광법(NMR)은 자기장 내에서 특정 원자핵이 공명 주파수에서 전자기파를 흡수하는 현상을 이용하여 물질의 분자 구조를 분석하는 기술이다. 이 기술은 이시도어 아이작 라비가 처음 발견했으며, 1940년대에 퍼셀과 블로흐 연구팀에 의해 독립적으로 개발되어 1952년 노벨 물리학상을 수상했다. NMR은 핵 스핀 양자수가 0이 아닌 원자핵, 특히 ¹H, ¹³C, ¹⁵N, ³¹P와 같은 핵종을 분석에 활용하며, 공명 주파수, 시료 처리, 중수소화 용매 사용, 쉬밍 및 록, 스펙트럼 획득, 스펙트럼 해석 등의 특징을 갖는다. NMR 스펙트럼은 화학적 이동, J-결합, 자기적 비등가성, 핵 오버하우저 효과(NOE)와 같은 요소를 통해 분석되며, 2D-NMR, 고체 NMR, 생체 분자 NMR(단백질, 핵산, 탄수화물) 등 다양한 응용 분야에서 활용된다. NMR 분광기는 자석, 프로브, 분광기 본체, 컴퓨터로 구성되며, 용액, 고압, 저온 등 다양한 측정 방법이 존재한다.

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핵자기 공명 분광법
핵자기 공명 분광법
핵자기 공명 분광계
개요
유형	분광법
관련 학문	물리학, 화학
사용 분야	분자 구조 분자 역학 생화학 생물학 고분자 연구
원리
측정 대상	원자핵
측정 원리	핵자기 공명 현상 자기장 속에서 원자핵의 자기 모멘트 상호작용
분석 방법	특정 주파수의 전자기파 흡수 및 방출
주파수 영역	무선 주파수 (Radio Frequency) 영역
장비
핵심 구성 요소	자석 (강력한 영구자석 또는 초전도 자석) 무선 주파수 발생 및 감지 장치 시료 튜브
자기장 세기	테슬라 단위로 측정 (현재 최대 28.2 테슬라)
활용
분석 정보	분자 구조 정보 (원자 간 결합, 거리, 각도) 분자 운동 정보 화학적 환경 정보 (결합 상태)
분석 물질	액체 고체 기체
응용 분야	의약품 개발 재료 과학 연구 생체 분자 구조 연구 대사체학 연구 식품 분석
역사
발견	아이작 라비 (1938년) 핵자기 공명 현상 발견 펠릭스 블로흐와 에드워드 밀스 퍼셀 (1946년) 액체 및 고체에서 핵자기 공명 현상 관측
노벨상	아이작 라비, 펠릭스 블로흐, 에드워드 밀스 퍼셀에게 핵자기 공명 관련 노벨상 수여
발전	분광기 개발 푸리에 변환 핵자기 공명 분광법 개발 (1960년대) 다차원 핵자기 공명 분광법 개발 (1970년대)
최신 동향	초고자기장 핵자기 공명 분광법 발전 (1 GHz 이상) 마이크로 프로브 개발 및 소형화
추가 정보
기타 명칭	자기 공명 분광법
가격	고가 장비 (수백만 달러)

2. 역사

핵자기 공명(NMR) 발견의 공로는 1944년 노벨 물리학상을 수상한 이시도어 아이작 라비에게 돌아간다.^[6] 1940년대 후반과 1950년대 초, 하버드 대학교의 퍼셀(Purcell) 연구팀과 스탠퍼드 대학교의 블로흐(Bloch) 연구팀은 독립적으로 NMR 분광법을 개발했다. 에드워드 밀스 퍼셀과 펠릭스 블로흐는 NMR 분광법 개발 공로로 1952년 노벨 물리학상을 공동 수상했다.^[7]

3. NMR 활성 조건

원자핵의 NMR 활성 여부는 핵 스핀 양자수(''I'')에 의해 결정된다. 핵 스핀 양자수는 원자의 "스핀"과 유사하며, 핵의 각운동량을 나타내는 고유한 양자적 특성이다. 핵이 NMR 활성을 가지려면 0이 아닌 핵 스핀(''I'' ≠ 0)을 가져야 한다.^[8] 0이 아닌 스핀을 갖는 핵은 외부 자기장과 상호작용하여 NMR 신호를 나타낼 수 있다.

양성자와 중성자의 수에 따라 핵 스핀 양자수는 다음과 같이 결정된다.

양성자와 중성자의 합이 홀수인 원자: 반정수 핵 스핀 양자수(''I'' = 1/2, 3/2, 5/2 등)를 가지며, NMR 활성을 띤다.
양성자와 중성자의 합이 짝수이지만, 양성자와 중성자 수가 모두 홀수인 원자: 정수 핵 스핀 양자수(''I'' = 1, 2, 3 등)를 가지며, NMR 활성을 띤다.
양성자와 중성자 수가 모두 짝수인 원자: 핵 스핀 양자수가 0(''I'' = 0)이므로 NMR 활성을 띠지 않는다.^[9]

NMR 활성 핵, 특히 스핀 양자수가 1/2인 핵은 NMR 분광법에서 매우 중요하다. 예를 들어 ¹H, ¹³C, ¹⁵N, ³¹P 등이 있다.^[10] 스핀이 매우 높은 일부 원자(예: ⁹⁹Tc의 경우 9/2)도 NMR 분광법으로 광범위하게 연구되고 있다.^[11] 반면, ¹²C와 ¹⁶O는 핵 스핀을 가지지 않으므로 검출할 수 없다.^[43]

원자 번호와 질량수가 모두 짝수가 아닌 원자핵은 0이 아닌 핵스핀 양자수 ''I''와 자기쌍극자 모멘트를 가지며, 작은 자석으로 간주할 수 있다.

4. NMR 분광법의 주요 특징

핵자기 공명(NMR) 분광법은 원자핵이 외부 자기장과 상호작용하여 특정 주파수의 전자기파를 흡수하는 현상을 이용한다. 이때 흡수하는 주파수를 공명 주파수라고 하며, 이는 자기장의 세기에 비례한다.^[12] 예를 들어, 21 테슬라(T) 자기장에서 수소 핵은 900 MHz에서 공명한다. 하지만 다른 핵들은 자기장 세기에서 핵자기모멘트에 비례하는 다른 주파수에서 공명한다.

원자핵의 자기쌍극자 모멘트가 세차운동을 하는 주파수를 라머 주파수라고 한다. 이 원자핵에 라머 주파수와 같은 주파수로 회전하는 자기장(전자기파)을 가하면 공명이 일어난다. 제만 효과에 의해 자기장 세기에 비례하여 일정한 에너지 차이를 가지는 에너지 상태가 생기며, 이 에너지 차이는 라머 주파수를 가진 광자의 에너지와 같다. 따라서 공명 시에 전자기파의 공명 흡수 또는 방출이 일어나고, 이를 통해 공명 현상을 감지한다.

분광법으로 얻은 데이터는 가로축이 주파수, 세로축이 강도인 스펙트럼으로 나타난다. 그러나 원자의 공명 주파수는 외부 자기장에 따라 변하므로, 원자 고유의 성질을 나타내기 위해 화학적 이동을 사용한다. 화학적 이동은 다음과 같이 정의된다.

:(관측 대상 원자의 라머 주파수 − 기준 주파수) / (자기 회전 비 × 외부 정자기장 세기)

NMR 스펙트럼의 가로축은 보통 화학적 이동으로 나타내며, 공명 위치에 나타나는 피크를 '피크' 또는 '신호'라고 부른다.

NMR 실험을 위해 얇은 유리관(NMR 시험관)에 시료를 준비한다.^[13]^[14]

핵자기 공명(NMR) 시료는 얇은 벽의 유리관, 즉 NMR 시험관에 준비된다.

핵자기 공명 분광기(NMR spectrometer)는 회전하는 시료 홀더, 고주파 송신기, 수신기, 프로브(안테나), 확산 측정을 위한 기울기 코일(선택 사항) 및 제어 전자 장치로 구성된다.

중수소화 용매는 용매 속 수소 원자 신호가 분석을 방해하는 것을 막기 위해 사용된다.^[15] 대부분의 용매는 탄화수소이고 NMR 활성 수소-1 핵을 포함하기 때문에, 중수소화 용매를 사용하여 용매 신호를 줄인다. 가장 흔히 사용되는 중수소화 용매는 중클로로포름(CDCl₃)이다. 분자의 화학적 이동은 용매에 따라 약간씩 달라지므로, 사용된 용매는 화학적 이동과 함께 보고된다.^[16]^[17] 전자석이나 초전도자석을 이용한 측정에는 중수소화 용매를 사용하며, 이는 자기장 고정(locking)을 위한 것이다. 장시간 측정 시 실온 변동 등으로 초전도자석의 자기장 세기가 변할 수 있는데, NMR에서는 미세한 주파수 차이를 구별해야 하므로 자기장 세기 변화는 치명적이다. 자기장 고정은 중수소화 용매의 중수소 원자핵 NMR 신호(고정 신호)를 측정하고, 일정한 주파수를 유지하도록 자기장을 조정하는 것이다.

고해상도 NMR 분광기는 자기장 균질성을 위해 쉬밍을 사용한다.^[18] 분광기는 잠금 장치를 사용하여 용매 중수소 주파수를 "잠금" 상태로 유지하여 자기장 불균일성과 변화를 보상한다.^[18] 최신 NMR 분광기는 자동 쉬밍을 지원하지만, 최상의 해상도를 위해 수동 조정이 필요할 수 있다.^[18]^[19] NMR 측정 시 시료 내부 자기장의 불균일성은 스펙트럼 분해능을 저하시킨다. 따라서 시료 내부 자기장은 균일해야 하며, 이를 위해 심(코일)이라는 별도의 코일이 자석 내부에 설치되어 있다. 심 코일의 전류량을 조정하여 자기장을 균일하게 하는 것을 심 조정이라고 한다.

무선주파수(60–1000 MHz) 펄스로 시료를 여기시키면 핵자기 공명 반응과 자유 유도 감쇠(FID)가 나타난다. 매우 약한 신호이므로 민감한 무선 수신기가 필요하며, 원시 FID로부터 푸리에 변환을 통해 주파수 영역 스펙트럼을 얻는다. 단일 FID의 스펙트럼은 신호 대 잡음비가 낮지만, 반복하여 얻은 신호를 평균하면 향상된다. 펄스를 가한 후 핵은 분광기 자기장에 대해 특정 각도로 여기되며, 여기 정도는 펄스 폭으로 제어한다. 이완 효율에 따라 여기 감쇠 시간이 달라지며, 이완이 완료되기 전에 두 번째 펄스를 가하면 신호 강도에 예측할 수 없는 영향을 미친다. 반전 회복 실험을 통해 이완 시간과 펄스 사이의 지연 시간을 결정할 수 있다.^[20]

시료에 전자기파 펄스를 가하고 자화 벡터를 검출하는 장치가 프로브(probe)이다. 프로브는 원통형이며 상부에 시료관을 삽입하는 오목한 부분이 있고, 이 부분 주위에 코일이 감겨 있다.

4. 1. 공명 주파수

NMR 활성 핵은 외부 자기장 하에서 특정 주파수의 전자기파를 흡수하는데, 이를 공명 주파수라고 한다.^[12] 공명 주파수, 흡수된 방사선의 에너지, 그리고 신호의 세기는 자기장의 세기에 비례한다. 예를 들어 21테슬라(21 T) 자기장에서 수소 핵(양성자)은 900 MHz에서 공명한다. 수소가 가장 일반적으로 검출되는 핵이기 때문에 21 T 자석을 900 MHz 자석이라고 부르는 것이 일반적이다. 그러나 다른 핵들은 이 자기장 세기에서 핵자기모멘트에 비례하는 다른 주파수에서 공명한다.

원자핵의 자기쌍극자 모멘트의 세차운동 주파수는 라머 주파수라고 불리며, 이 원자핵에 대해 라머 주파수와 같은 주파수로 회전하는 회전 자기장(전자기파)을 걸면 자기장과 원자핵 사이에 공명이 일어난다.

제만 효과에 의해 자기장의 세기에 비례하여, 일정한 에너지 차이를 가진 에너지 상태를 가지며, 이 에너지 차이는 주파수가 라머 주파수인 광자가 가진 에너지와 정확히 일치한다. 따라서 공명 시에 전자기파의 공명 흡수 또는 방출이 일어나고, 이에 따라 공명 현상을 감지할 수 있다.

분광법이므로 얻어지는 데이터는 가로축이 주파수이고 세로축이 강도인 스펙트럼이 된다. 하지만, 어떤 원자의 공명 주파수는 외부 정자기장의 세기에 비례하여 변하므로, 그 관측 대상 원자 고유의 성질이 되지는 않는다. 그러나,

:(관측 대상 원자의 라머 주파수 − 기준 주파수) / (자기 회전 비 × 외부 정자기장 세기)

로 정의되는 화학적 이동은 관측 대상 원자 고유의 값이 되므로, NMR 스펙트럼의 가로축은 화학적 이동으로 나타내는 것이 일반적이다. 공명 위치에 나타나는 피크를 단순히 피크 또는 시그널, 신호라고 부른다.

예를 들어 수소의 라머 주파수는 이고, 질소의 라머 주파수는 이다.^[43]

4. 2. 시료 처리

핵자기 공명(NMR) 시료는 얇은 벽의 유리관, 즉 NMR 시험관에 준비된다. 핵자기 공명 분광기(NMR spectrometer)는 회전하는 시료 홀더, 고주파 송신기, 수신기, 프로브(안테나), 확산 측정을 위한 기울기 코일(선택 사항) 및 제어 전자 장치로 구성된다. 시료를 회전시키는 것은 확산 운동을 평균화하는 데 필요하지만, 용액 이동이 중요한 경우에는 정지된 시료를 사용하기도 한다. 예를 들어 확산 계수(확산 순서 분광법 또는 DOSY) 측정은 정지된 시료를 사용한다.^[13]^[14]

4. 3. 중수소화 용매

중수소화 용매는 용매에 포함된 수소 원자의 신호가 분석을 방해하는 것을 막기 위해 사용된다.^[15] 용액 내 대부분의 분자는 용매 분자이며, 대부분의 일반적인 용매는 탄화수소이므로 NMR 활성 수소-1 핵을 포함하고 있다. 따라서 용매 수소 원자의 신호가 실험 결과를 압도하여 용해된 분석 물질의 분석을 방해하는 것을 피하기 위해, 수소 원자의 99% 이상이 중수소(수소-2)로 치환된 중수소화 용매를 사용한다. 가장 널리 사용되는 중수소화 용매는 중클로로포름(CDCl₃)이지만, 시료의 용해도, 수소 결합 제어, 또는 녹는점이나 끓는점 등의 다양한 이유로 다른 용매를 사용할 수 있다. 분자의 화학적 이동은 용매에 따라 약간씩 변하므로, 사용된 용매는 화학적 이동과 함께 거의 항상 보고된다.

양성자 NMR 스펙트럼은 종종 0의 화학적 이동으로 통상적으로 정의되는 테트라메틸실란(TMS)을 첨가하는 대신, 알려진 용매 잔류 양성자 피크^[16]를 기준으로 보정한다.^[17]

전자석이나 초전도자석을 이용한 장치에서 측정할 때는 중수소화된 용매를 사용하는 것이 일반적이다. 이것은 자기장 고정(locking)을 위한 것이다. 비교적 장시간 측정을 하면 그 사이에 실온의 변동 등을 원인으로 초전도자석의 자기장 세기가 변하는 경우가 있다. NMR에서는 화학적 이동이나 스핀 커플링처럼 주파수의 미세한 차이를 구별할 필요가 있으므로, 자기장 세기의 변화는 치명적이다. 그래서 자기장 세기의 변화를 추적하여 보정하는 메커니즘이 있으며, 이것이 자기장 고정이다. 자기장 고정은 중수소화된 용매의 중수소 원자핵의 NMR 신호(고정 신호)를 측정하고, 이것이 항상 일정한 주파수로 유지되도록 자기장을 조정하는 것에 의해 이루어진다.

4. 4. 심(Shim) 및 록(Lock)

고해상도 NMR 분광기는 자기장의 균질성을 수십억 분의 일(ppb) 수준으로 미세 조정하기 위해 쉬밍을 사용한다.^[18] 분광기는 별도의 잠금 장치를 사용하여 용매 중수소 주파수를 "잠금" 상태로 유지하여 자기장의 불균일성과 변화(drift)를 감지하고 보상하는데,^[18] 이는 관심 있는 시료의 핵이 아닌 잠금 핵(중수소)에 맞춰 조정된 추가적인 송신기 및 RF 프로세서이다.^[18] 최신 NMR 분광기에서는 쉬밍이 자동으로 조정되지만, 최상의 해상도를 얻기 위해 사용자가 수동으로 쉬밍 매개변수를 최적화해야 하는 경우도 있다.^[18]^[19]

전자석이나 초전도자석을 이용한 장치에서 측정할 때는 중수소화된 용매를 사용하는 것이 일반적이다. 이것은 자기장 고정(locking)을 위한 것이다. 장시간 측정 시 실온 변동 등으로 인해 초전도자석의 자기장 세기가 변할 수 있다. NMR에서는 화학적 이동이나 스핀 커플링처럼 주파수의 미세한 차이를 구별해야 하므로, 자기장 세기 변화는 치명적이다. 따라서 자기장 세기 변화를 추적하고 보정하는 메커니즘이 필요한데, 이것이 자기장 고정(locking)이다. 자기장 고정은 중수소화된 용매의 중수소 원자핵의 NMR 신호(고정 신호)를 측정하고, 이것이 항상 일정한 주파수로 유지되도록 자기장을 조정하는 방식으로 이루어진다.

NMR 측정 시 시료 내부 자기장의 방향 및 세기에 불균일성이 있으면, 동종의 핵이라도 라모어 주파수에 폭이 생겨 스펙트럼의 분해능이 저하된다. 따라서 시료 내부 자기장은 완전히 균일해야 한다. 메인 자석만으로는 자기장의 미세 조정이 불가능하므로, 자기장 미세 조정용 별도의 코일이 자석 내부에 설치되어 있다. 이것을 심(코일)이라고 한다. 초전도 자석 크라이오스타트 내부의 심 코일을 크라이오심(코일), 자석의 크라이오스타트 외부, 보어 내 프로브의 바깥쪽에 있는 심 코일을 상온심(코일)이라고 한다. 이러한 코일을 흐르는 전류량을 조정하여 자기장을 균일하게 하는 것을 심 조정이라고 한다.

크라이오심은 자석을 초전도 상태로 안정화시킨 직후 설치업체가 조정하며, 그 이외에는 조정하는 일이 거의 없다. 반면, 상온심은 각 측정마다 조정할 필요가 있다. 측정 시료에 따라 자화율이 다르기 때문에, 각 시료마다 시료 내부 자기장이 변하기 때문이다.

일반적으로 심 조정은 록 신호를 이용하여 수행한다. 즉, 자기장이 균일해질수록 록 신호의 라모어 주파수 폭이 작아지고 신호의 강도가 강해지는 것을 이용하여, 신호가 최대한 강해지는 방향으로 심 코일의 전류를 조정한다. 심 코일에 사용되는 코일은 여러 종류가 있으며, z1, z2, z3, …, x1, x2, y1, y2, xy, x2y, … 등으로 불린다. 이러한 이름은 예를 들어 x²y라면 시료 내부에 x²y에 비례하는 세기를 가진 자기장을 만드는 코일이라는 것을 의미한다. NMR의 액체 측정 시료의 대부분은 직경 5 mm의 관에 4~5 cm 정도 높이의 용액을 넣는다. 따라서 관의 직경 방향인 xy 방향보다 관의 높이 방향인 z 방향의 자기장 불균일의 영향이 크다. 그래서 일상적인 측정에서는 z1, z2, z3 심만 조정하고, 스피닝 사이드 밴드가 관찰되는 등 xy 방향 자기장 불균일의 영향이 나타나는 경우에 x, y 심을 조정한다.

또한, 자장 기울기 펄스를 이용하여 시료 내부 자기장을 측정하고, 그에 따라 심의 값을 자동 설정하는 그래디언트 심이라고 불리는 조정법이나, FID를 측정하면서 그 포락선의 형태를 보면서 심 조정하는 방법도 있다.

심은 덧댐이라는 의미로, 전자석으로 NMR을 측정하던 시대에 자기장을 균일하게 조정하기 위해 장치에 나무판을 덧대어 조정하던 것에서 유래한다.

4. 5. 스펙트럼 획득

무선주파수(60–1000 MHz) 펄스로 시료를 여기시키면 핵자기 공명 반응과 자유 유도 감쇠(FID)가 나타난다. 이 신호는 매우 약하므로 민감한 무선 수신기가 필요하다. 원시 시간 영역 FID로부터 주파수 영역 스펙트럼을 얻기 위해 푸리에 변환을 수행한다. 단일 FID의 스펙트럼은 신호 대 잡음비가 낮지만, 반복하여 얻은 신호를 평균하면 쉽게 향상된다. 좋은 ¹H NMR 스펙트럼은 16회 반복으로 얻을 수 있으며, 이는 몇 분밖에 걸리지 않는다. 그러나 수소보다 무거운 원소는 이완 시간이 상당히 길다. 예를 들어 ¹³C의 경우 약 8초 정도이다. 따라서 정량적인 무거운 원소 스펙트럼 획득은 수십 분에서 수 시간이 걸릴 수 있다.

펄스를 가한 후, 핵은 평균적으로 분광기 자기장에 대해 특정 각도로 여기된다. 여기 정도는 펄스 폭으로 제어할 수 있으며, 일반적으로 최적의 90° 펄스는 약 3–8 μs이다. 펄스 폭은 (부호가 있는) 강도를 펄스 폭의 함수로 나타내어 결정할 수 있다. 이 그래프는 사인 곡선을 따르며, 180° 및 360° 펄스에 해당하는 펄스 폭에서 부호가 바뀐다.

일반적으로 초 단위로 측정되는 여기의 감쇠 시간은 이완 효율에 따라 달라진다. 이완은 가벼운 핵과 고체에서 더 빠르고, 무거운 핵과 용액에서 더 느리며, 기체에서는 매우 길 수 있다. 이완이 완료되기 전에 두 번째 여기 펄스를 가하면 평균 자화 벡터가 바닥 상태로 돌아오지 않아 신호 강도에 예측할 수 없는 영향을 미친다. 실제로 피크 면적은 화학량론에 비례하지 않으며, 작용기가 있는지 여부만 알 수 있을 뿐 양은 알 수 없다. 이완 시간과 펄스 사이의 필요한 지연 시간을 결정하기 위해 반전 회복 실험을 할 수 있다. 180° 펄스, 조정 가능한 지연 시간, 90° 펄스를 차례로 가한다. 90° 펄스가 신호를 정확히 상쇄할 때 지연 시간은 90° 이완에 필요한 시간에 해당한다.^[20] 반전 회복은 정량적인 ¹³C, ²D 및 기타 시간이 오래 걸리는 실험에 유용하다.

시료에 전자기파 펄스를 가하고 시료의 자화 벡터를 검출하는 장치가 프로브(probe)이다. 프로브는 원통형이며 상부에 시료관을 삽입하는 오목한 부분이 있다. 이 부분 주위에 펄스 조사 및 신호 검출을 위한 코일이 감겨 있다. 사용하는 시료관이 액체용인지 고체용인지, 그리고 시료관의 두께에 따라 사용 가능한 프로브가 결정된다. 프로브는 자석 하부 중앙에서 자석 내부로 삽입되며, 필요에 따라 교체할 수 있다.

5. 스펙트럼 해석

NMR 신호는 일반적으로 화학적 이동, 스핀-스핀 커플링(J-결합), 완화 시간의 세 가지 변수로 특징지어진다.

5. 1. 화학적 이동

화학적 이동의 예: 헥사보란 B₆H₁₀의 NMR 스펙트럼은 주파수가 이동된 피크를 보여주는데, 이는 분자 구조에 대한 단서를 제공한다.

핵 스핀 상태 간의 에너지 차이(Δ''E'')는 자기장에 비례하며, 핵의 전자 환경에 따라 달라지는 화학적 이동(δ) 현상을 일으킨다. 가장 간단한 NMR 그래프는 분자 내에서 연구되는 핵의 서로 다른 화학적 이동을 나타낸다. δ 값은 "차폐"라는 용어로 표현되는데, 차폐된 핵은 더 높은 Δ''E''를 갖는다. δ 값의 범위를 분산이라고 한다. ¹H 신호의 경우 분산이 작지만, 다른 핵의 경우 훨씬 크다. NMR 신호는 일반적으로 테트라메틸실란(TMS)의 신호를 기준으로 보고된다.^[21] 화학적 이동은 구조 정보를 제공한다.

화학적 이동 변환을 스펙트럼 ''할당''이라고 한다. 반자성 유기 화합물의 경우, ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼 할당은 매우 정교하다. 양성자의 화학적 이동은 주로 차폐 효과(전자 밀도)에 의해 결정되기 때문에 예측하기 쉽다. 그러나 무거운 핵의 화학적 이동은 여기 상태를 포함한 다른 요인의 영향을 많이 받는다. 이러한 반자성 기여는 화학적 이동의 추세를 방해하여 할당을 복잡하게 하고, 매우 넓은 화학적 이동 범위를 생성한다. 예를 들어, 대부분 유기 화합물의 ¹H NMR 신호는 15 ppm 이내이지만, ³¹P NMR의 경우 범위는 수백 ppm이다.^[22]

상자성 NMR 분광법에서 시료는 짝짓지 않은 전자를 포함하는 상자성을 띤다. 상자성은 매우 다양한 화학적 이동을 생성하는데, ¹H NMR 분광법에서 화학적 이동 범위는 최대 수천 ppm에 이를 수 있다.^[23]

측정을 통해 얻어진 피크 위치는 자기장 세기에 따라 달라지므로, 기준 물질과의 주파수 차이를 자기장 세기로 나눈 화학적 이동 δ로 나타낸다. (δ = (흡수가 있었던 전자기파 주파수 − 기준 물질의 흡수 주파수) / (자기장 세기)). 화학적 이동은 보통 수~수백 헤르츠인데 반해, 일반적인 NMR 장치 자기장 세기는 수백 메가헤르츠이므로, δ값은 ppm으로 나타낸다. 고주파수(δ가 큰) 쪽을 저자기장, 저주파수(δ가 작은) 쪽을 고자기장이라고 부른다. 초기 NMR 문헌에서는 화학적 이동 τ가 사용되는 경우가 있는데, τ 스케일의 화학적 이동은 δ 스케일의 화학적 이동과 τ = 10 − δ 관계가 있다.

기준 물질로는 ¹H나 ¹³C에서는 테트라메틸실란(TMS)을 사용하고, 이 시그널을 0 ppm으로 한다. 일반적으로 내부 표준으로 시료 용액에 용해시키지만, 측정 용매가 중수 등일 때는 TMS가 용해되지 않으므로 외부 표준으로 하거나, 다른 물질을 사용한다. ¹H에서는 용매에 포함된 미중수소화체, ¹³C에서는 용매 자체의 피크가 기준으로 사용되는 경우도 있다. 화학적 이동은 측정하는 화합물의 구조와 전기적·물리적 상황, 용매 등에 따라 결정되며, 이들로부터 얻을 수 있는 정보를 이용하여 화합물 동정이나 구조 추정을 한다. 유기 분자 부분 구조와 화학적 이동 값에는 상관관계가 있으며 구조 추정에 이용할 수 있다.

차폐란 관측하는 핵 주위에 외부 자기장과 반대 방향 자기장이 발생하여 두 상태 간의 에너지 차이, 즉 라모어 주파수를 작게 하는 효과이다. 이 에너지 차이(스펙트럼 상에서는 화학적 이동)와 관측 핵 주위에 존재하는 치환기의 전자 공여성 및 전자 흡인성에는 큰 상관관계가 있다. 이는 관측하는 핵 주위 전자 밀도가 높을수록 차폐가 강하게 일어나기 때문이다. 반대로 외부 자기장과 같은 방향 자기장이 발생하여 라모어 주파수가 커지는 것을 탈차폐라고 한다. 전자에 의해 강하게 차폐된 핵일수록 고자장인 오른쪽에, 탈차폐된 핵일수록 저자장인 왼쪽에 피크가 나타난다.

5. 2. J-결합 (스핀-스핀 결합)

J-결합은 분자 내 화학 결합을 통해 핵 스핀 상태가 상호작용하여 발생하는 현상이다. 이 상호작용은 NMR 신호를 여러 개의 피크로 분리시키는데, 이를 통해 분자 내 원자 간 연결성에 대한 정보를 파악할 수 있다.^[21]

J-결합에 의한 분리 패턴은 결합된 핵의 수와 스핀에 따라 달라진다. 예를 들어, ''n''개의 동일한 스핀-1/2 핵에 결합되면 신호는 ''n'' + 1 개의 다중선으로 분리되며, 각 피크의 세기 비율은 파스칼의 삼각형을 따른다. 아래 표는 다중도에 따른 강도 비를 나타낸다.

다중도	강도 비
싱글릿 (s)	1
더블릿 (d)	1:1
트리플릿 (t)	1:2:1
쿼텟 (q)	1:3:3:1
퀸텟	1:4:6:4:1
섹스텟	1:5:10:10:5:1
셉텟	1:6:15:20:15:6:1

추가적인 스핀이 결합에 관여하면, 다중선의 각 구성 요소는 다시 분리된다. 예를 들어, 서로 다른 결합 상수를 가진 두 개의 스핀-1/2 핵에 결합되면 ''더블릿 오브 더블릿''(dd)이 생성된다.

에탄올의 ¹H NMR 스펙트럼에서 CH₃ 기는 인접한 CH₂의 두 양성자에 의해 1:2:1 비율의 ''트리플릿''으로 분리된다. CH₂는 CH₃의 세 양성자에 의해 1:3:3:1 비율의 ''쿼텟''으로 분리된다. OH 양성자는 분자 간 교환으로 인해 결합 정보가 손실되어 단일 피크로 나타난다.

스핀이 1/2보다 큰 핵, 예를 들어 중수소(스핀-1)는 세 가지 스핀 상태를 가지므로 1:1:1 ''트리플릿''으로 신호를 분리시킨다. ³⁵Cl(스핀-3/2)은 1:1:1:1 ''쿼텟''으로 분리시킨다.

J-결합의 크기(결합 상수 ''J'')는 핵 사이의 결합 거리, 핵의 자기 모멘트, 이면각 등에 영향을 받는다. J-결합은 화학적 이동과 함께 분자 구조를 분석하는 데 중요한 정보를 제공하며, 특히 서로 다른 핵을 구별하는 데 유용하다.

5. 2. 1. 2차 결합 (강한 결합)

결합 상수가 핵 간 주파수 차이에 비해 클 때 2차 결합 효과가 나타난다. 2차 결합은 다중선 세기 패턴을 왜곡시키고 분석을 어렵게 만든다.^[24] 이동 분리가 감소하거나 결합 강도가 증가하면 다중선 세기 패턴은 먼저 왜곡되고, 그런 다음 더 복잡해진다. 다중선의 일부 피크 강화는 나머지 피크를 희생하여 이루어지는데, 때로는 배경 노이즈에서 거의 사라지기도 하지만 피크 아래의 적분 면적은 일정하게 유지된다.

그러나 대부분의 고자장 NMR에서는 왜곡이 보통 미미하며, 특징적인 왜곡(지붕 모양)은 실제로 관련 피크를 식별하는 데 도움이 될 수 있다. 포플 방법을 사용하여 이러한 패턴 중 일부를 분석할 수 있지만, 그 범위는 제한적이다.

2차 효과는 다중선 간의 주파수 차이가 증가함에 따라 감소하므로 고자장(즉, 고주파수) NMR 스펙트럼은 저주파수 스펙트럼보다 왜곡이 적다. 초기 60MHz 스펙트럼은 일반적으로 200MHz 이상의 주파수로 작동하는 후기 기기의 스펙트럼보다 왜곡되기 쉬웠다.

멘톨의 ¹H NMR 스펙트럼. 수평축은 ppm 단위의 화학적 이동을 나타낸다. 각각 자기적으로 비등가적인 양성자는 특징적인 이동을 가지며, 다른 양성자와의 결합은 피크가 다중선으로 분리되어 나타난다.

또한, J 결합을 사용하여 고리의 오쏘-메타-파라 치환을 식별할 수 있다. 오쏘 결합은 15Hz에서 가장 강하며, 메타 결합은 평균 2Hz이고, 파라 결합은 일반적으로 연구에 있어 무시할 수 있다.

5. 2. 2. 자기적 비등가성

화학적으로 등가인 스핀(대칭성에 의해 관련되어 동일한 NMR 주파수를 갖는 핵)이 외부 스핀과 다른 결합 관계를 갖는 경우 더 미묘한 효과가 발생할 수 있다. 화학적으로는 등가이지만 결합 관계를 기반으로 구별할 수 없는 스핀은 자기적으로 비등가라고 한다. 예를 들어, 1,2-디클로로벤젠의 4개의 H 자리는 대칭성에 의해 두 개의 화학적으로 등가인 쌍으로 나뉘지만, 한 쌍의 개별 구성원은 다른 쌍을 구성하는 스핀과 다른 결합을 갖는다.^[60]

자기적 비등가성은 계산 모델링을 통해서만 분석할 수 있는 매우 복잡한 스펙트럼으로 이어질 수 있다.^[61] 이러한 효과는 방향족 및 기타 비강직성 시스템의 NMR 스펙트럼에서 더 흔하며, 유연한 분자의 C−C 결합에 대한 배좌 평균화는 인접한 탄소 원자 상의 양성자 간의 결합을 동일하게 만들어 자기적 비등가성과 관련된 문제를 줄이는 경향이 있다.^[62]^[63]

5. 3. 용매 효과

화학적 이동 값은 기본적으로 용매에 따라 크게 변하지 않는다. 하지만 방향족 화합물 등은 고리 전류 효과에 의해 용질 분자에 차폐 효과를 가져온다. 또한, 용매는 그 극성의 차이 등에 따라 분자 간 및 분자 내 상호작용에도 영향을 준다.

5. 4. 핵 오버하우저 효과 (NOE)

어떤 원자 A가 흡수하는 주파수의 전자기파를 조사하면서 전자기파를 주사하여 전체 흡수를 측정한다고 하자. 이때 모든 원자에 대해 그 에너지 차이 자체는 변하지 않는다. 그러나 원자 A와 공간적으로 가까운 위치에 있는 원자는 원자 A에 대한 조사가 없었을 때와 비교하여 두 에너지 상태의 점유율이 변한다. 따라서, 보통 측정한 NMR 스펙트럼과 조사를 이용하여 측정한 1차원 NMR 스펙트럼을 비교하면 피크의 면적(적분값)이 다르다. 이와 같이 조사에 의해 에너지 준위의 점유율이 변하는 것, 그리고 그것에 수반되는 스펙트럼의 변화를 핵 오버하우저 효과(NOE)라고 한다. NOE를 이용하면 원자 A와 적분값이 변한 피크에 상당하는 원자는 입체적으로 가까운 위치에 있다는 것을 알 수 있다.

6. 상관 분광법 (2D-NMR)

상관 분광법은 여러 종류의 2차원 핵자기 공명(NMR) 분광법 (2D-NMR) 중 하나이다. 이러한 유형의 NMR 실험은 약어인 COSY로 가장 잘 알려져 있다. 다른 유형의 2차원 NMR에는 J-분광법, 교환 분광법(EXSY), 핵 오버하우저 효과 분광법(NOESY), 전체 상관 분광법(TOCSY) 및 HSQC, HMQC, HMBC와 같은 이핵 상관 실험이 포함된다. 상관 분광법에서 방출은 개별 핵의 피크에 집중된다. 만약 그 자기장이 공유 결합(COSY, HSQC 등) 또는 공간적(NOE) 결합을 통해 다른 핵과 상관관계가 있다면, 상관된 핵의 주파수에서도 반응을 감지할 수 있다. 2차원 NMR 스펙트럼은 1차원 NMR 스펙트럼보다 분자에 대한 더 많은 정보를 제공하며, 특히 1차원 NMR을 사용하여 작업하기에는 너무 복잡한 분자의 구조를 결정하는 데 유용하다. 최초의 2차원 실험인 COSY는 1971년 브뤼셀 자유 대학교의 교수인 Jean Jeener에 의해 제안되었다.^[25]^[26] 이 실험은 나중에 Walter P. Aue, Enrico Bartholdi 및 리처드 어니스트에 의해 구현되었으며, 그들은 1976년에 그들의 연구 결과를 발표했다.^[27]

7. 고체 NMR

다양한 물리적 상황에서 분자를 용액 상태에서 연구할 수 없으며, 다른 분광 기술을 사용하더라도 원자 수준까지 연구할 수 없는 경우가 있다. 결정, 미세결정 분말, 젤, 이방성 용액 등과 같은 고체상 매질에서 핵 스핀 시스템의 거동에 있어 쌍극자 결합 및 화학적 이동 이방성이 특히 중요해진다. 기존의 용액 상태 NMR 분광법에서는 이러한 추가적인 상호작용으로 인해 스펙트럼 선의 상당한 폭이 넓어진다. 다양한 기술을 통해 고해상도 조건을 확립할 수 있으며, 적어도 ¹³C 스펙트럼의 경우 용액 상태 NMR 스펙트럼과 비교할 수 있다.

고해상도 고체 NMR 분광법에 중요한 두 가지 개념은 시료 방향에 따른 분자 방향의 제한과 시료 회전을 통한 이방성 핵 자기 상호작용의 감소이다. 후자의 방법 중 마법각(magic angle) 주위의 고속 회전은 시스템에 스핀-1/2 핵이 포함되어 있는 경우 매우 중요한 방법이다. 약 20,000Hz의 회전 속도가 사용되며, 이를 위해서는 특수 장비가 필요하다. 부분 정렬 또는 이동성이 감소된 시료를 사용하는 여러 중간 기술이 현재 NMR 분광법에 사용되고 있다.

고체 NMR 효과가 나타나는 응용 분야는 종종 막 단백질, 단백질 섬유 또는 모든 종류의 중합체에 대한 구조 연구, 무기 화학에서의 화학 분석과 관련이 있지만, 식물 잎과 연료 전지와 같은 "특이한" 응용 분야도 포함된다. 예를 들어, Rahmani 등은 중수소 NMR 분광법을 사용하여 압력과 온도가 이중 세포 구조의 자기 조립에 미치는 영향을 연구했다.^[29] 고체 NMR은 또한 X선 비정질 금속 시료(나노 크기 내화 금속 ⁹⁹Tc와 같음)의 경우 금속 구조 이해에 유용하다.^[30]

측정하려는 시료의 용해도가 낮을 때(고분자 등) 또는 고체 상태에서 분자의 동적 거동 등을 조사하고 싶을 때 사용된다. 기본적인 원리는 용액 NMR과 같지만, 용액 상태와 달리 분자의 회전 운동 등이 구속되어 있으므로, 분자의 방향에 따라 다른 화학적 이동을 주어 선폭이 넓어지는 경우가 드물지 않다. 또한, 시료관을 자기장 방향에 대해 54.7도 ( $\cos \theta =\frac{1}{\sqrt{3}}$ ) 기울인 매직 앵글에서 고속으로 회전시킴으로써 선폭을 가늘게 하는 방법도 있다(매직 각 회전).

또한, 고체 NMR에는, 쌍극자 상호 작용, 사극자 상호 작용 등, 용액 NMR에서는 분자 운동 때문에 평균화되어 보이지 않게 된 정보가 포함되어 있으므로, 그것들을 측정하는 목적으로 사용되는 경우도 있다.

8. 생체 분자 NMR

생체 고분자는 단백질, 핵산, 탄수화물과 같이 분자량이 큰 분자를 말한다. 생체 고분자의 구조와 동역학을 연구하기 위해 핵자기 공명(NMR) 분광법을 이용할 수 있다.

NMR^영어을 이용한 생체 분자 연구는 주로 단백질을 대상으로 하는 단백질 NMR 분야에서 많은 발전이 있었다. 이 방법은 X선 결정학과 유사하게 단백질의 3차원 구조를 밝히는 데 사용되지만, X선 결정학으로 연구하기 어려운 35 kDa 보다 큰 단백질이나, 본질적으로 비구조화된 단백질의 구조를 밝힐 수 있다는 장점이 있다.

핵산의 구조와 동역학을 연구하는 데 사용되는 핵자기 공명 분광법을 핵산 NMR이라고 한다. 2003년 기준으로 알려진 RNA 구조의 거의 절반이 NMR 분광법을 통해 밝혀졌다.^[31] 핵산은 단백질에 비해 수소 원자의 비율이 낮고, 핵산 이중 나선은 뻣뻣하고 직선형이라 "장거리" 상관관계를 제공하지 않는다는 특징이 있다.^[32]

탄수화물의 구조와 형태를 연구하는 데 사용되는 핵자기 공명 분광법을 탄수화물 NMR이라고 부른다. 탄수화물은 작용기의 변화가 제한적이기 때문에 1H NMR 스펙트럼에서 좁은 영역에 공명이 집중되어 나타나는 경향이 있다.

8. 1. 단백질 NMR

핵자기 공명(NMR) 분광법의 많은 혁신은 단백질 NMR 분광법 분야에서 이루어졌으며, 이는 구조 생물학에서 중요한 기술이다. 이러한 연구의 일반적인 목표는 X선 결정학으로 달성할 수 있는 것과 유사하게 단백질의 고해상도 3차원 구조를 얻는 것이다. X선 결정학과 달리, NMR 분광법은 일반적으로 35 kDa보다 작은 단백질로 제한되지만, 더 큰 구조도 해결되었다. NMR 분광법은 부분적으로 또는 완전히 본질적으로 비구조화된 단백질에 대한 고해상도 정보를 얻는 유일한 방법인 경우가 많다. 이제는 예를 들어 약물 후보와의 상호 작용 전후의 구조를 알려진 생화학적 활성과 비교하는 구조-활성 상관관계를 결정하는 일반적인 도구이다.

단백질은 이 글 앞부분에서 논의된 작은 유기 분자보다 수십 배 이상 크지만, 기본적인 NMR 기술과 일부 NMR 이론도 적용된다. 작은 유기 화합물과 비교하여 단백질 분자에 존재하는 원자의 수가 훨씬 많기 때문에, 기본적인 1D 스펙트럼은 겹치는 신호로 가득 차서 직접적인 스펙트럼 분석이 불가능해진다. 따라서 이 문제를 해결하기 위해 다차원(2, 3 또는 4D) 실험이 고안되었다. 이러한 실험을 용이하게 하기 위해, 주로 자연적으로 발생하는 동위원소인 ¹²C는 NMR 활성이 없고, 주로 자연적으로 발생하는 ¹⁴N 동위원소의 핵 사중극자 모멘트는 이 질소 동위원소로부터 고해상도 정보를 얻는 것을 방지하기 때문에, 단백질을 ¹³C와 ¹⁵N으로 동위원소 표지하는 것이 바람직하다.

단백질 구조 결정에 사용되는 가장 중요한 방법은 분자 내 원자 사이의 거리를 측정하기 위해 NOE 실험을 이용하는 것이다. 그 후 얻어진 거리를 사용하여 거리 기하학 문제를 해결하여 분자의 3D 구조를 생성한다. NMR은 단백질의 서로 다른 영역의 역동성과 구조적 유연성에 대한 정보를 얻는 데에도 사용할 수 있다.

8. 2. 핵산 NMR

핵산 NMR은 핵자기 공명 분광법을 이용하여 DNA 또는 RNA와 같은 폴리핵산의 구조와 역동성에 대한 정보를 얻는 방법이다. 2003년 기준으로 알려진 RNA 구조의 거의 절반이 NMR 분광법을 통해 규명되었다.^[31]

핵산과 단백질 NMR 분광법은 유사하지만, 몇 가지 차이점이 존재한다. 핵산은 일반적으로 NMR 분광법에서 관찰되는 수소 원자의 비율이 더 작다. 또한 핵산 이중 나선은 단단하고 대략적으로 직선형이기 때문에 스스로 접히지 않아 "장거리" 상관관계를 제공하지 않는다.^[32] 핵산에 일반적으로 사용되는 NMR 유형은 ¹H 또는 양성자 NMR, ¹³C NMR, ¹⁵N NMR 및 ³¹P NMR이다. 2차원 NMR 방법(예: 상관 분광법(COSY) 및 전체 코히어런스 전달 분광법(TOCSY)을 통한 결합 핵 커플링 검출, 그리고 핵 오버하우저 효과 분광법(NOESY)을 통한 공간적으로 서로 가까운 핵 간의 커플링 검출)이 거의 항상 사용된다.^[33]

스펙트럼에서 얻은 매개변수(주로 NOESY 크로스 피크 및 결합 상수)는 글리코시드 결합 각도, 이면각( 카플러스 방정식 사용), 그리고 당 푸커 형태와 같은 국소적 구조적 특징을 결정하는 데 사용할 수 있다. 대규모 구조의 경우, 이러한 국소적 매개변수는 다른 구조적 가정이나 모델로 보완되어야 한다. 이중 나선을 가로지를 때 오차가 누적되고, 단백질과 달리 이중 나선은 콤팩트한 내부가 없고 스스로 접히지 않기 때문이다. NMR은 굽은 나선, 비왓슨-크릭 염기쌍 및 동축 스태킹과 같은 비표준 기하학적 구조를 조사하는 데에도 유용하다. 특히 스템-루프 및 슈도낫과 같은 복잡한 구조를 취하는 천연 RNA 올리고뉴클레오티드의 구조를 조사하는 데 유용하다. 또한 다른 분자(예: 단백질 또는 약물)의 결합에 의해 공명이 어떻게 이동하는지 확인하여 핵산 분자가 다른 분자에 결합하는 것을 조사하는 데에도 유용하다.^[33]

8. 3. 탄수화물 NMR

탄수화물 NMR 분광법은 탄수화물의 구조와 형태를 연구하는데 사용된다. 작용기의 제한된 변화로 인해 1H NMR을 이용한 탄수화물 분석은 어려운데, 이는 NMR 스펙트럼의 좁은 영역에 1H 공명이 집중되어 나타나기 때문이다. 다시 말해, 스펙트럼 분산이 좋지 않다. 아노머 탄소가 두 개의 산소 원자를 가지고 있다는 사실 때문에 아노머 양성자 공명은 다른 공명들과 분리된다. 작은 탄수화물의 경우, 아노머 양성자 공명의 분산은 1D TOCSY 실험을 사용하여 개별 탄수화물 잔기의 전체 스핀 시스템을 조사하는 것을 용이하게 한다.

연속파(continuous wave) NMR(CW-NMR)은 초기의 측정 방법으로, 일정한 자기장 하에서 시료에 전자기파를 주파수를 연속적으로 변화시키면서 조사하여 흡수량을 측정하거나, 또는 자기장을 변화시키면서 일정 주파수의 전자기파를 조사하여 흡수량을 측정하는 방법이다. 일반적인 전자석을 사용하는 경우 자기장을 변화시키는 것이 주파수를 변화시키는 것보다 고정밀도이기 때문에 후자의 방법이 사용되었다.

9. NMR 분광기

NMR 분광기는 자석, 프로브, 분광기 본체, 컴퓨터로 구성된다.

'''자석''' : 영구 자석 또는 초전도 자석을 사용한다. 자기장이 강할수록 감도와 분해능이 향상된다. 영구 자석은 비교적 소형이며 유지 보수가 적다는 장점이 있다. 초전도 자석은 니오브(Nb)와 티타늄(Ti) 합금 또는 니오브(Nb)와 주석(Sn) 합금을 사용하여 매우 강한 자기장을 생성한다.
'''프로브''' : 시료에 전자기파 펄스를 가하고 자유 유도 감쇠(FID) 신호를 검출한다.
'''분광기 본체''' : 전자기 펄스 발생 및 제어, 신호 증폭 및 처리를 담당한다.
'''컴퓨터''' : 분광기 설정, 데이터 처리 및 분석을 수행한다.

일본전자(JEOL), 브루커 바이오스핀(Bruker BioSpin), 옥스퍼드 인스트루먼츠(Oxford Instruments), 바리안(Varian) 등이 NMR 제조사로 유명하다.

푸리에 변환 NMR(FT-NMR)은 현재 주류 측정 방법이다. 선형 응답 이론에 따르면 임펄스 응답 함수의 푸리에 변환은 주파수 응답 함수를 제공하며, 이는 NMR 스펙트럼과 같다. 따라서 임펄스(펄스형 전자기파)를 시료에 가하여 모든 핵을 여기시키고, 발생하는 자유 유도 감쇠(FID)를 측정하여 푸리에 변환하면 NMR 스펙트럼을 얻을 수 있다.

9. 1. 소프트웨어

컴퓨터를 이용하여 분광기의 다양한 설정을 하거나, 분광기에 축적된 데이터를 처리한다.

고속 푸리에 변환(FFT)이 보편화되지 않았던 과거에는, 분광기에 축적된 FID(Free Induction Decay) 정보를 대형 컴퓨터로 옮겨 푸리에 변환을 수행했다. 그러나 현재 시판되는 개인용 컴퓨터는 고속 푸리에 변환에 충분한 사양을 갖추고 있어, 특별한 컴퓨터를 사용할 필요가 없다. 각 회사의 장치로 측정된 FID 정보를 처리하는 프리웨어도 존재한다.

핵자기공명 분광기(NMR)의 제어, 데이터 수집, 데이터 처리, 분석을 수행하는 소프트웨어로는 Mnova NMR, TopSpin, Icon-NMR 등이 있으며, 완전 자동 측정이 가능한 소프트웨어도 있다.

다음은 핵자기 공명 분광법 관련 소프트웨어 목록이다.^[1]

소프트웨어 이름
SpinWorks
NMRPipe
ACD/NMR
MNOVA
NUTS
TopSpin
Icon-NMR

10. 측정 방법

핵자기 공명(NMR) 측정은 시료의 성질, 현상 검출 방법, 핵 스핀 여기 방법, 측정 조건 등에 따라 다양한 방식이 존재한다.

FT-NMR에서는 펄스를 이용하여 코히어런스(coherence)를 생성하고, 추가적인 펄스를 가하여 이 코히어런스를 다른 핵으로 이동시킬 수 있다. 이러한 방법을 통해 특정 상호작용만을 추출하거나, 감도를 향상시킬 수 있다. 이러한 일련의 펄스 조합을 펄스 시퀀스라고 하며, 흔히 약어로 불린다.

다음은 주요 펄스 시퀀스 및 그 약어와 내용에 대한 표이다.

약어	전체 이름	설명
APT	attached proton test	¹³C-NMR에서 각 탄소에 결합된 수소 원자의 수를 결정한다.
INEPT	insensitive nuclei enhanced by polarization transfer	감도가 좋은 핵에서 감도가 낮은 핵으로 극화 전달을 통해 감도를 향상시킨다. ¹³C-NMR에서 각 탄소에 결합된 수소 원자의 수를 결정한다.
DEPT	distorsionless enhancement by polarization transfer	INEPT의 개선판으로, 감도가 좋은 핵에서 감도가 낮은 핵으로 극화 전달을 통해 감도를 향상시킨다. ¹³C-NMR에서 각 탄소에 결합된 수소 원자의 수를 결정한다.
COSY	correlated spectroscopy	스핀 결합하고 있는 핵끼리 결정하는 2차원 NMR이다. 동종핵의 결합을 결정하는 것과 이종핵의 결합을 결정하는 HETCOR가 있다.
DQF-COSY	double quantum filtered-COSY	이중 양자 코히어런스를 거치는 신호만을 추출하여 스핀 결합이 없는 신호를 제거하고, 대각 피크의 위상을 흡수형으로 만들어 대각선 근처의 교차 피크 검출을 개선한 COSY이다.
HOHAHA	homonuclear Hartmann-Hahn spectroscopy	하트만-하한 효과를 이용하여 특정 신호에서 스핀 결합을 따라 스핀 네트워크를 결정한다.
TOCSY	total correlation spectroscopy	HOHAHA를 응용한 2차원 NMR이다.
NOESY	nuclear overhauser enhancement and Exchange spectroscopy	nOe를 이용하여 가까운 거리에 있는 핵을 결정하는 2차원 NMR이다. 화학적 교환을 하고 있는 핵도 결정할 수 있다.
ROESY	rotating overhauser enhancement and exchange spectroscopy	회전계에서의 nOe를 이용하는 NOESY의 일종이다. 관성계에서의 nOe가 작은 중간 정도의 분자량을 가진 화합물의 nOe 측정에 사용된다.
HMQC	heteronuclear multi quantum correlation	감도가 좋은 핵에서 감도가 낮은 핵으로 극화 전달을 이용하여 감도를 향상시킨 이종핵 COSY이다.
HSQC	heteronuclear single quantum correlation	HMQC와 마찬가지로 감도가 좋은 핵에서 감도가 낮은 핵으로 극화 전달을 이용하여 감도를 향상시킨 이종핵 COSY이다.
HMBC	heteronuclear multiple bond correlation	감도가 좋은 핵에서 감도가 낮은 핵으로 극화 전달을 이용하여 감도를 향상시킨 이종핵 COSY로, 특히 커플링 상수가 작은 원격 스핀 결합을 하고 있는 핵만 선택적으로 결정한다.
INADEQUATE	incredible natural abandance double quantum transfer experiment	동위원소 존재비가 낮은 핵의 COSY를 측정한다.
TROSY	transverse relaxation optimized spectroscopy	스핀 결합으로 분열된 피크 중 완화 시간이 긴 피크만 선택적으로 검출하여 고분자 NMR의 분해능을 향상시키는 기법이다.

10. 1. 용액 측정

일반적으로 용액을 측정할 때는 측정할 화합물을 용매에 녹여 무기 유리로 만든 NMR 튜브에 넣고, 자석 내부에 설치된 프로브에 넣어 측정한다.^[1] 유기화학에서 일반적으로 사용되는 용매에는 다량의 양성자가 포함되어 있어, 이러한 용매를 사용하여 양성자 NMR을 측정하면 용매 성분의 신호가 매우 강해져 용질 신호의 관측이 매우 어려워진다.^[1] 따라서 이 측정에 사용하는 용매로는 양성자를 중수소로 치환한 용매(중용매)를 사용한다.^[1] 중용매는 중수소의 NMR 신호를 록 신호로 사용하기도 하지만, FT-NMR 이전의 CW-NMR에서는 수소를 포함하지 않는 사염화탄소도 용매로 자주 사용되었다.^[1] CW-NMR에서는 대부분의 장치가 자장 스캔 방식이며, 측정 시 자장을 변화시키기 때문에 신호 록 자체가 성립되지 않아 록을 위한 중수소도 불필요했기 때문이다.^[1]

전자석이나 초전도자석을 이용한 장치에서 측정할 때는 중수소화된 용매를 사용하는 것이 일반적이다.^[1] 이는 자기장 고정(locking)을 위한 것이다.^[1] 비교적 장시간 측정하면 그 사이에 실온 변동 등으로 인해 초전도자석의 자기장 세기가 변하는 경우가 있다.^[1] NMR에서는 화학적 이동이나 스핀 커플링처럼 주파수의 미세한 차이를 구별할 필요가 있으므로, 자기장 세기의 변화는 치명적이다.^[1] 그래서 자기장 세기의 변화를 추적하여 보정하는 메커니즘이 있으며, 이것이 자기장 고정(locking)이다.^[1] 자기장 고정은 중수소화된 용매의 중수소 원자핵 NMR 신호(고정 신호)를 측정하고, 이것이 항상 일정한 주파수로 유지되도록 자기장을 조정하는 방식으로 이루어진다.^[1]

10. 2. 고압 NMR 분광법

고압 NMR 분광법은 압력을 변수로 사용하여 생화학 시스템 및 초임계 유체 환경에서 작은 분자의 화학적, 공간적 구조를 연구하는 방법이다.^[35] 이 분야의 초기 연구 중 하나는 1994년 J. Jonas가 발표한 연구이다.^[35]

고압 NMR 분광법은 주로 생화학 시스템 연구에 대한 관심으로 발전했는데, 고압을 이용하면 분자 간 상호 작용을 큰 교란 없이 제어된 방식으로 변화시킬 수 있기 때문이다.^[35]

고압 NMR 분광법을 이용하여 과학적 문제를 해결하려는 시도가 있었지만, 고압을 생성하고 유지하는 장비 문제로 인해 대부분의 시도는 재현하기 어려웠다.^[36]^[37]^[38]

고압 NMR 분광법은 단백질 분자 구조의 특성 분석과 같은 다양한 응용 분야에서 널리 사용되어 왔다.^[39]^[40] 최근에는 초임계 유체 환경에서 작은 분자의 화학적 및 공간적 구조를 특성화하기 위한 소프트웨어 및 설계 솔루션이 제안되었으며,^[41] 상태 매개변수를 이러한 변화를 위한 원동력으로 사용한다.^[42]

10. 3. 저온 NMR

실온에서 불안정하여 분해되는 분자의 경우, 액체질소 등을 사용하여 영하 수십 도 이하의 저온에서 용액 NMR 측정을 실시한다. 상온에서 순식간에 진행되는 반응을 저온에서 관찰하면 속도결정단계와 반응차수 등을 알 수 있다. 또한, 일반적인 온도에서 단일 화합물로 간주되는 화합물이라도 저온에서 관찰하면 호변 이성질체임을 알 수 있는 경우가 있어, 분자 구조를 더 자세히 파악할 수 있다. 단, 저온에서 시료가 얼어붙지 않도록 측정 온도 영역에서 액체 상태인 용매를 사용해야 한다. 고체 NMR에서는 더 낮은 온도 영역에서도 측정이 가능하며, 극저온 영역에서는 자기 공명 온도계로 활용할 수도 있다.

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