크로마토그래피
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1. 개요
크로마토그래피는 혼합물을 구성하는 성분들을 분리하는 데 사용되는 물리적 분리 방법이다. 1900년대 초 미하일 츠베트에 의해 개발되었으며, 색소 분리에 처음 사용된 기술에서 유래되었다. 크로마토그래피는 고정상과 이동상 사이에서 물질의 분배 정도 차이를 이용하여 분리하며, 분배, 흡착, 크기 배제, 이온 교환, 친화성 등의 다양한 원리를 기반으로 한다. 크로마토그래피는 고정상의 형태에 따라 평면 크로마토그래피와 컬럼 크로마토그래피로, 이동상의 종류에 따라 기체, 액체, 초임계 유체 크로마토그래피로 분류된다. 다양한 종류의 크로마토그래피 기법은 제약, 식품, 화학, 법과학, 환경 분석 등 광범위한 분야에서 활용된다.
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| 크로마토그래피 | |
|---|---|
| 기본 정보 | |
 | |
| 유형 | 분리 기술 |
| 분리 대상 | 혼합물 |
| 작동 원리 | |
| 고정상 | 컬럼 내 고체 또는 지지체에 코팅된 액체 |
| 이동상 | 액체 또는 기체 |
| 분리 메커니즘 | 흡착 이온 교환 크기 배제 친화력 분배 |
| 응용 분야 | |
| 분석 | 혼합물의 성분 식별 및 정량화 복잡한 시료의 분석 |
| 준비 | 원하는 성분의 분리 및 정제 의약품, 식품, 화학 물질 생산 |
| 종류 | |
| 컬럼 크로마토그래피 | 고정상이 컬럼에 채워져 있음 |
| 평면 크로마토그래피 | 고정상이 평면에 코팅되어 있음 |
| 기체 크로마토그래피 | 이동상이 기체임 |
| 액체 크로마토그래피 | 이동상이 액체임 |
| 이온 크로마토그래피 | 이온성 물질 분리에 사용됨 |
| 크기 배제 크로마토그래피 | 분자 크기에 따라 분리함 |
| 친화성 크로마토그래피 | 특정 생체 분자와의 친화력을 이용함 |
| 기타 정보 | |
| 역사 | 20세기 초 러시아의 식물학자 미하일 츠베트가 개발함 |
| 관련 기술 | 전기영동 추출 결정화 |
2. 역사
크로마토그래피는 1901년에서 1905년 사이에 러시아 제국의 식물학자 미하일 츠베트가 카잔 연방 대학교와 바르샤바 대학교에서 개발하였다.[7][8] 그는 20세기 초반에 이 기술을 개발하고 '크로마토그래피'라는 용어를 만들었는데, 주로 클로로필, 카로틴류, 크산토필류와 같은 식물 색소를 분리하는 데 사용되었다. 이러한 성분들은 서로 다른 색깔(각각 녹색, 주황색, 노란색)의 띠로 분리되기 때문에 기술 이름의 유래가 되었다. 1930년대와 1940년대에 개발된 새로운 유형의 크로마토그래피는 이 기술을 많은 분리 공정에 유용하게 만들었다.[9]
크로마토그래피는 혼합물 속 성분들이 이동상과 정지상 사이에서 분배되는 정도의 차이를 이용하여 분리하는 방법이다.[7][8] 정지상에 강하게 결합하는 성분은 느리게, 약하게 결합하는 성분은 빠르게 이동하여 분리가 일어난다. 1901년에서 1905년 사이 미하일 츠베트가 개발했으며, 클로로필, 카로틴류, 크산토필류 등 식물 색소 분리에 이 기술을 사용하여 크로마토그래피라는 용어를 만들었다.
1940년대와 1950년대에 아처 존 포터 마틴과 리처드 로렌스 밀링턴 싱은 크로마토그래피 기술 연구로 1952년 노벨 화학상을 수상했다.[10] 그들은 분배 크로마토그래피의 원리와 기본 기술을 확립했으며, 종이 크로마토그래피, 가스크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 등 여러 가지 크로마토그래피 방법의 빠른 발전을 이끌었다. 그 이후로 이 기술은 급속도로 발전했다. 연구자들은 츠베트의 크로마토그래피의 주요 원리가 여러 가지 다른 방식으로 적용될 수 있다는 것을 발견했고, 그 결과 다양한 종류의 크로마토그래피가 탄생했다. 기술 발전은 크로마토그래피의 기술적 성능을 지속적으로 향상시켜 점점 더 유사한 분자를 분리할 수 있게 했다.
3. 원리
크로마토그래피 분리의 물리화학적 원리에는 분배, 흡착, 분자배제, 이온교환이 있다. 친화 크로마토그래피는 항원항체반응이나 효소, 수용체의 기질 특이성 같은 분자생물학적 반응을 이용한다.
크로마토그래피는 '''고정상'''('''담체''') 표면이나 내부를 '''이동상'''이 통과하면서 물질이 분리되는 현상이다. 고정상으로는 고체 또는 액체가, 이동상으로는 기체, 액체, 초임계유체가 사용될 수 있다.[48]
크로마토그래피는 분배 계수 개념에 기반한다. 용질은 섞이지 않는 두 용매 사이에 분배되며, 한 용매를 고정하고 다른 용매를 이동시키면 크로마토그래피가 된다. 고정상이 극성이면 정상상, 비극성이면 역상 크로마토그래피이다.
3. 1. 분배 크로마토그래피 (Partition Chromatography)
분배 크로마토그래피는 가장 일반적인 크로마토그래피 방식이다. 시료가 정지상과 이동상 사이에서 분배되는 정도의 차이를 이용한다. 분배 크로마토그래피의 예로는 역상 박층 크로마토그래피, 셀룰로오스가 고정상인 정상 박층 크로마토그래피, 페이퍼 크로마토그래피 등이 있다.[48] 셀룰로오스가 고정상인 경우, 셀룰로오스의 OH기에 수소 결합한 물이 고정상이 된다. 시료는 고정상과 이동상 사이에서 연속적으로 분배되므로 분배 계수가 큰 것부터 용출되고, 원리적으로는 용출량의 머무름 시간 분포(시료 피크)의 형태는 가우스 분포를 따른다.
실리카겔을 이용한 일반적인 추출 조작에서는 수층이 실리카겔 표면에, 유기층이 이동상에 해당하며, 고정상과 이동상 사이에서 분배(연속 추출)가 이루어진다. 이러한 고정상과 이동상의 조합을 '''순상 크로마토그래피'''라고 부른다. 극성이 높은 담체와 극성이 낮은 이동상을 사용하기 때문에, 극성이 낮은 물질의 머무름 시간이 작고, 극성이 높은 물질의 머무름 시간이 크다.
순상 실리카겔을 다양한 장쇄 알킬클로로실란으로 처리하면 Si-OH가 알킬실란으로 화학적으로 변형되어 고정상 표면은 장쇄 알킬기로 덮이게 된다. 이동상에 수용액을 사용하고 앞서 설명한 화학적 변형 실리카겔을 사용하면 고정상과 이동상의 관계가 역전된다. 이러한 고정상과 이동상의 조합을 '''역상 크로마토그래피'''라고 한다. 역상 크로마토그래피에서는 대개 극성이 높거나 소수성이 낮은 물질이 먼저 이동한다.
역상 크로마토그래피(RPC)는 이동상이 정지상보다 훨씬 더 극성인 모든 액체 크로마토그래피 절차이다. 이는 정상 크로마토그래피에서 이동상이 정지상보다 훨씬 덜 극성이기 때문에 그렇게 명명되었다. 이동상의 소수성 분자는 상대적으로 소수성인 정지상에 흡착되는 경향이 있다. 이동상의 친수성 분자는 먼저 용리되는 경향이 있다. 분리 컬럼은 일반적으로 실리카 입자 기질에 결합된 C8 또는 C18 탄소 사슬로 구성된다.
3. 2. 흡착 크로마토그래피 (Adsorption Chromatography)
고정상 표면과 시료의 흡착력 차이에 의해 분리되는 크로마토그래피이다. 용매가 존재하면 시료가 용매화되어 흡착 현상이 잘 나타나지 않으므로, 분리능이 요구되는 분석에서는 주로 가스크로마토그래피에서 이용된다.
분취 크로마토그래피에서는 역상 조건에서, (이온교환기를 갖지 않는) 레진에 시료를 흡착시켜 정제하는 기법이 있다(보통 다른 방법으로 분리할 수 있으므로, 매우 불안정한 시료일 때 사용된다). 분리능은 낮다.
3. 3. 크기 배제 크로마토그래피 (Size-Exclusion Chromatography)
크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 젤 침투 크로마토그래피(GPC) 또는 젤 여과 크로마토그래피라고도 불리며, 분자의 크기에 따라 분자를 분리하는 방법이다. 작은 분자는 다공성 물질의 구멍에 들어가 이동상의 흐름에서 제거되지만, 큰 분자는 구멍에 들어가지 못하고 빠르게 용출된다. size exclusion chromatography영어는 시료의 분자 크기에 따른 거르기를 원리로 하는 크로마토그래피이다. 이동상이 유기 용매인 '''겔 투과 크로마토그래피'''(gel permeation chromatography, GPC)와 이동상이 수용액인 '''겔 여과 크로마토그래피'''(gel filtration chromatography, GFC)로 크게 나뉜다.
고정상 담체는 표면에서 내부로 갈수록 좁아지는 다공성 재료로 만들어져 있다. 따라서 다공성의 크기가 문제가 될 만큼 거대한 분자의 경우, 고정상 내부까지 확산 침입할 수 없다. 다시 말해, 소분자는 담체 내부까지 확산될 수 있지만, 대분자는 담체의 외부를 흘러갈 뿐이다.
이처럼 시료의 크기에 따라 고정상 용적이 달라지므로, 거대 분자가 먼저, 소분자가 나중에 유출된다. 이 원리를 크기 배제 크로마토그래피라고 한다. 일반적으로 분해능이 낮은 크로마토그래피 기법이므로 정제의 최종 단계에 사용된다. 또한, 정제된 단백질의 삼차 구조와 사차 구조를 결정하는 데에도 유용하다. 특히 천연 용액 조건에서 수행할 수 있다는 장점이 있다.
덱스트린 겔이나 아가로스 겔을 사용한 효소 단백질 정제법으로 개발되어 생화학, 분자생물학 분야에서 이용되고 있다.
용도로는 합성 고분자, 천연 고분자의 분자량, 올리고머의 분리 등에 사용된다.
특징과 주의사항은 다음과 같다.
| 특징 | 주의사항 |
|---|---|
3. 4. 이온 교환 크로마토그래피 (Ion-Exchange Chromatography)
이온 교환 크로마토그래피는 물질의 전하 차이를 이용한 이온 교환 메커니즘에 기반하는 크로마토그래피 기법이다. 주로 전하를 띠는 양이온, 음이온, 아미노산, 펩타이드, 단백질을 분리하는 데 사용되며, 정지상의 전하와 반대 전하를 띠는 물질이 더 늦게 용출되는 원리를 이용한다. 단백질 정제에 널리 사용되는 방법 중 하나이다.[26]이온 교환 크로마토그래피는 각각의 전하에 따라 분석물을 분리하며, 일반적으로 컬럼에서 수행되지만 평면 모드에서도 사용할 수 있다. 하전된 고정상을 사용하여 음이온, 양이온, 아미노산, 펩타이드, 단백질을 포함한 하전된 화합물을 분리한다. 기존 방법에서는 고정상이 반대 전하를 띤 화합물의 그룹과 상호 작용하여 유지하는 하전된 작용기를 갖는 이온 교환 수지를 사용한다.
이온 교환 크로마토그래피에는 양이온 교환 및 음이온 교환의 두 가지 유형이 있다. 양이온 교환 크로마토그래피에서 고정상은 음전하를 띠고 교환 가능한 이온은 양이온인 반면, 음이온 교환 크로마토그래피에서 고정상은 양전하를 띠고 교환 가능한 이온은 음이온이다.[26] 이온 교환 크로마토그래피는 FPLC를 사용하여 단백질을 정제하는 데 일반적으로 사용된다.
이온 교환 수지를 고정상으로 사용하여 이온성 시료를 주입하면, 분자종과 고정상 사이의 산염기 평형 상수의 크기에 따라 연속적으로 분배된다.
3. 5. 친화성 크로마토그래피 (Affinity Chromatography)
친화성 크로마토그래피는 특정 분자와 분석 물질 간의 친화성(결합력) 차이를 이용하는 크로마토그래피 기법이다. 이 방법은 매우 특이적이지만, 반응성이 아주 좋지는 않다. 주로 생화학 실험실에서 단백질을 분리하는 데 사용된다.단백질을 히스티딘, 바이오틴, 또는 항원 등으로 표식하면, 이 표식된 단백질은 정지상에 특이적으로 결합한다. 정제 과정이 끝나면 이 표식을 제거하여 순수한 단백질을 얻을 수 있다. 생체 분자와 금속 이온(주로 아연, 구리, 철, 비소) 간의 친화성을 이용하기도 한다.[20]
고정화 금속 친화 크로마토그래피(IMAC)는 분자들의 금속에 대한 상대적 친화도 차이를 이용하여 분리하는 데 유용하다. 이러한 컬럼은 종종 다른 금속을 채워 넣어 목표 친화도를 가진 컬럼을 만들 수 있다.[23][24][25]
항원항체반응이나 효소, 수용체의 기질 특이성과 같은 분자생물학적 반응을 분리에 이용하기도 한다.
4. 종류
크로마토그래피는 정지상의 형태, 이동상의 종류, 분리 메커니즘 등에 따라 다양하게 분류할 수 있다.
미하일 츠베트는 1900년대 초 카잔 연방 대학교와 바르샤바 대학교에서 식물 색소를 분리하는 연구를 통해 크로마토그래피를 개발했다.[7][8] 1940년대와 1950년대에는 아처 존 포터 마틴과 리처드 로렌스 밀링턴 싱이 분배 크로마토그래피의 원리와 기본 기술을 확립하여 종이 크로마토그래피, 가스크로마토그래피 등 여러 크로마토그래피 방법의 발전을 이끌었으며, 이 공로로 1952년 노벨 화학상을 수상했다.[10]
4. 1. 정지상의 형태에 따른 분류
평면 크로마토그래피는 정지상이 평면 형태로 존재하는 크로마토그래피 기법이다. 평면 정지상으로는 종이( 종이 크로마토그래피 )나 유리판( TLC 크로마토그래피 )이 사용될 수 있다. 혼합물 속 각 성분은 정지상과의 결합력 차이에 의해 이동 속도가 달라지며, 이를 통해 분리가 이루어진다. 물질 고유의 Rf값(지연계수)을 통해 미지 물질을 확인할 수 있다.[16]
종이 크로마토그래피는 크로마토그래피 종이를 정지상으로 이용하는 방법이다. 시료를 점으로 찍은 종이를 용매가 얕게 담긴 용기에 넣고 밀봉하면, 용매가 종이를 타고 올라가면서 시료와 만나 분리가 일어난다. 종이는 극성인 셀룰로스로 이루어져 있어, 무극성 물질이 더 잘 이동한다. 극성이 큰 물질은 셀룰로스와 강하게 결합하여 이동 속도가 느려진다.[17]
박층 크로마토그래피(TLC)는 종이 크로마토그래피와 유사하지만, 정지상으로 실리카 젤이나 알루미나 등 흡착성 물질로 얇게 코팅된 유리판을 사용한다. 모세관 현상에 의해 용매와 시료가 정지상을 타고 올라가는 속도 차이로 분리가 일어난다. 종이 크로마토그래피보다 빠르고, 정지상의 흡착성을 조절하여 분해능을 조절할 수 있다는 장점이 있다. 반응 진행 정도, 혼합물 속 물질 종류, 물질 순도 확인 등에 사용된다.[17]
물질이 이동한 거리를 이동상이 이동한 거리로 나눈 값을 지연계수(Rf)라고 한다. 정지상과의 친화도가 클수록 Rf값은 작다. Rf값은 물질 고유의 값이므로, 미지 물질 확인에 사용될 수 있다.[16]
컬럼 크로마토그래피는 정지상이 관(column) 안에 채워져 있는 분리 기술이다. 고체 정지상 입자 또는 액체 정지상으로 코팅된 지지체가 관 내부를 채우거나(충전 컬럼), 관 내벽에 집중되어 이동상을 위한 열린 경로를 남길 수 있다(개방형 관형 컬럼). 이동 속도 차이는 시료의 머무름 시간으로 계산된다.[12][13]
1978년 W. Clark Still은 구배 펌프를 도입하여 분리 속도를 높이고 용매 사용량을 줄인 플래시 컬럼 크로마토그래피를 개발했다.[14][15] 현대 플래시 크로마토그래피 시스템은 자동화를 제공하는 검출기 및 분획 수집기와 연결될 수 있다.
확장층 흡착에서는 충전층 대신 유동층이 사용되어 초기 정제 단계를 생략할 수 있다.
인산셀룰로오스 크로마토그래피는 DNA 결합 단백질의 인산셀룰로오스에 대한 결합 친화도를 이용한다. 단백질의 DNA와의 상호 작용이 강할수록 용리에 필요한 염 농도가 높아진다.[16]
4. 2. 이동상의 종류에 따른 분류
이동상의 종류에 따라 크로마토그래피는 다음과 같이 분류한다.- '''기체 크로마토그래피 (Gas Chromatography, GC)''': 이동상이 기체인 경우이다. 주로 칼럼을 사용하며, 비흡착성 및 화학적 비활성 물질로 만들어진다. 분배 평형 원리에 기반하며, 분석 화학에서 널리 사용된다. 고온이 필요하므로 생화학보다는 석유 화학, 환경 모니터링 및 정화, 화학 산업 분야에 적합하다.[19]
- '''액체 크로마토그래피 (Liquid Chromatography, LC)''': 이동상이 액체인 경우이다. 칼럼이나 평면에서 수행할 수 있으며, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 고압에서 소량의 입자를 사용하는 현대적 기법이다. HPLC는 이동상과 고정상의 극성에 따라 정상 액체 크로마토그래피(NPLC)와 역상 액체 크로마토그래피(RPLC)로 나뉜다.[2]
- '''초임계 유체 크로마토그래피 (Supercritical Fluid Chromatography, SFC)''': 이동상이 초임계유체인 경우이다.
5. 용어
- '''분석물''' – 크로마토그래피를 통해 분리하고자 하는 물질이다. 혼합물에서 필요한 물질이기도 하다.[6]
- '''크로마토그램''' – 크로마토그래피의 결과를 시각적으로 나타낸 것이다. x축은 머무름 시간, y축은 검출기 신호 세기를 나타낸다.[6] 최적의 시스템에서 신호는 분리된 특정 분석물의 농도에 비례한다.
- '''머무름 시간''' – 시료 주입 후 특정 성분이 검출기에서 피크로 나타날 때까지 걸리는 시간이다.[6] 머무름 시간은 분석 조건이 동일하면 물질마다 고유한 값을 가지므로, 이를 통해 시료를 동정할 수 있다.
- '''Rf값'''(Retention factor) – 평면 크로마토그래피에서 각 성분의 이동 거리를 용매 전개 거리로 나눈 값이다. 물질의 고유한 값이므로, 미지 물질의 Rf값을 통해 해당 물질이 무엇인지 알 수 있다.
- '''이론 단수''' - 컬럼 크로마토그래피의 효율을 평가하는 데 사용되는 지표이다.[48]
:
:여기서, ''t''R은 머무름 시간, ''w''1/2는 피크의 반치폭이다.
- '''피크 면적'''(Peak Area) – 각 성분 피크와 베이스라인 사이의 면적을 말한다.
6. 응용
크로마토그래피는 제약 산업, 식품 산업, 음료 산업, 화학 산업, 법과학, 환경 분석, 병원 등 여러 분야에서 사용된다.[47]
참조
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日本イオン交換学会
2004
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