효소 반응속도론

3. 가역적 촉매와 헐데인 방정식

효소는 외부 요인의 제한이 없을 때, 미시적 가역성의 원리에 따라 정반응과 역반응을 모두 촉매할 수 있다. 다음과 같은 가역적 반응을 고려해 보자.

{E} + {S} <=>[$k_1$][$k_{-1}$] ES <=>[$k_2$][$k_{-2}$] {E} + {P}

이 반응의 정상 상태에서 초기 속도($v\_0$)는 다음과 같이 나타낼 수 있다.

:$v\_0\; =\; \backslash frac\{d\backslash ,\; [\{\backslash rm\; P\}]\}\{dt\}\; =\; \backslash frac\{(k\_1\; k\_2\backslash ,\; [\{\backslash rm\; S\}]-\; k\_\{-1\}k\_\{-2\}[\{\backslash rm\; P\}])[\{\backslash rm\; E\}]\_0\}\{k\_\{-1\}+k\_2+k\_1\backslash ,\; [\{\backslash rm\; S\}]+k\_\{-2\}\backslash ,\; [\{\backslash rm\; P\}]\}$

$v\_0$는 반응이 정반응($S\; \backslash rightarrow\; P$)으로 진행되면 양수이고, 역반응($P\; \backslash rightarrow\; S$)으로 진행되면 음수이다.

평형은 $v=0$일 때 발생하며, 이 때 평형 상수($K\_\{\backslash rm\; eq\}$)는 다음과 같다.

:$\backslash frac\{[\{\backslash rm\; P\}]\_\{\backslash rm\; eq\}\}\{[\{\backslash rm\; S\}]\_\{\backslash rm\; eq\}\}=\backslash frac\{k\_1\; k\_2\}\{k\_\{-1\}\; k\_\{-2\}\}=K\_\{\backslash rm\; eq\}$

이는 열역학이 4개의 속도 상수 값 사이에 관계를 강제한다는 것을 보여준다.^[35]

정반응과 역반응의 최대 속도($V\_\{\backslash rm\; max\}$)는 각각 $[\{\backslash rm\; S\}]\; \backslash rightarrow\; \backslash infty$, $[\{\backslash rm\; P\}]\; =0$와 $[\{\backslash rm\; S\}]\; =0$, $[\{\backslash rm\; P\}]\; \backslash rightarrow\; \backslash infty$일 때 얻을 수 있으며, 각각 $V\_\{\backslash rm\; max\}^f\; =\; k\_\{2\}\; \{\backslash rm\; [E]\}\_\{tot\}$와 $V\_\{\backslash rm\; max\}^b\; =\; -k\_\{-1\}\; \{\backslash rm\; [E]\}\_\{tot\}$이다. 최대 속도의 비율($V\_\{\backslash rm\; max\}^f\; /\; V\_\{\backslash rm\; max\}^b$)은 평형 상수와 같지 않다. 이는 열역학이 최대 속도의 비율을 제한하지 않는다는 것을 의미하며, 효소가 반응의 특정 방향에서 '최대 속도' 측면에서 더 나은 촉매가 될 수 있는 이유를 설명한다.^[35]

두 미카엘리스 상수 $K\_M^S=(k\_\{-1\}+k\_2)/k\_1$와 $K\_M^P=(k\_\{-1\}+k\_2)/k\_\{-2\}$을 이용하여 헐데인 방정식(Haldane equation)을 유도할 수 있다. 헐데인 방정식은 평형 상수와 반응 속도 상수 사이의 관계를 나타낸다.

:$K\_\{\backslash rm\; eq\}=\backslash frac\{[\{\backslash rm\; P\}]\_\{\backslash rm\; eq\}\}\{[\{\backslash rm\; S\}]\_\{\backslash rm\; eq\}\}=\backslash frac\{V\_\{\backslash rm\; max\}^f\; /\; K\_M^S\}\{V\_\{\backslash rm\; max\}^b\; /\; K\_M^P\}$

따라서 열역학은 정방향 및 역방향 $V\_\{\backslash rm\; max\}/K\_M$ 값 간의 비율을 제한하지만, $V\_\{\backslash rm\; max\}$ 값의 비율을 제한하지는 않는다.

4. 비정상 상태 반응 속도론

효소가 기질과 혼합된 직후에는 생성물이 전혀 만들어지지 않았고 중간체도 존재하지 않는다. 반응 후 수 밀리초 동안의 반응을 연구하는 것을 비정상 상태 반응 속도론이라고 한다. 따라서 비정상 상태 반응 속도론은 효소-기질 중간체(ES 또는 E* 등)의 정상 상태 농도에 도달할 때까지의 형성과 소모를 다룬다.^[41]

이 접근법은 키모트립신에 의해 촉매되는 가수분해 반응에 처음 적용되었다.^[41] 중간체의 검출은 효소의 반응 메커니즘을 밝히는 데 중요한 증거가 되기도 한다. 예를 들어, 핑퐁 메커니즘의 경우, 빠른 속도 측정으로 생성물 P의 방출과 변형된 효소 중간체 E*의 형성을 확인할 수 있다.^[42] 키모트립신의 경우, 활성 부위의 친핵성 세린이 기질을 공격하여 아실-효소 중간체가 형성되면서 중간체가 생성된다.

오른쪽 그림에서 효소는 반응 초기 몇 초 동안 E*를 빠르게 생성하고, 이후 정상 상태에 도달하면서 속도가 느려진다. 반응의 빠른 급증기(burst phase)는 효소의 단일 회전을 나타낸다. 이 급증에서 방출되는 생성물의 양은 그래프의 ''y''축 절편으로 표시되며, 이는 분석에 사용된 기능적 효소의 양을 나타내기도 한다.^[98]

5. 화학적 메커니즘

효소 반응의 화학적 메커니즘을 이해하는 것은 효소 반응속도론 연구의 중요한 목표 중 하나이다. 이는 기질이 생성물로 전환되는 과정에서 일어나는 일련의 화학적 단계들을 밝히는 것을 의미한다.

다양한 용액 조건, 약간 변형된 효소나 기질을 이용한 반응속도 측정은 반응의 속도 결정 단계나 중간체를 밝혀내어 화학적 메커니즘을 규명하는 데 도움을 준다.^[44] 예를 들어, 수소 원자와의 공유 결합 절단은 흔히 속도 결정 단계인데, 수소를 안정 동위원소인 듀테륨으로 치환하면 일차적인 동위원소 효과로 인해 반응 속도가 변하는 것을 관찰할 수 있다. 이는 듀테륨과의 결합이 수소와의 결합보다 끊어지기 어렵기 때문이다.^{[99] 13}C/¹²C 및 ¹⁸O/¹⁶O와 같은 다른 동위원소 치환으로도 유사한 효과를 측정할 수 있지만, 수소의 경우만큼 두드러지지는 않다.^[45][100]

동위원소는 최종 생성물에서 기질 분자의 각 부분이 어디에서 유래했는지 밝히는 데에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 최종 생성물 속 산소 원자의 기원을 파악하는 것은 어려울 수 있는데, 물에서 왔을 수도, 기질에서 왔을 수도 있기 때문이다. 이를 확인하기 위해 반응에 참여하는 분자에 산소의 안정 동위원소인 ¹⁸O를 치환하고 생성물에서 해당 동위원소를 확인하는 방법을 사용할 수 있다.^[46][101]

화학적 메커니즘은 pH 변화,^[47][102] 금속 이온 또는 기타 보조 인자의 변화,^[48][103] 보존된 아미노산 잔기의 부위 특이적 돌연변이 유발,^[49][104] 기질 유사체의 존재 하에서 효소의 거동을 연구함으로써 더 명확하게 밝혀질 수 있다.

6. 효소 저해 및 활성화

6. 1. 가역적 저해제

• 경쟁적 저해제: 저해제가 효소의 활성 부위에 결합하여 기질과 경쟁한다. ''K''_M은 증가하고 ''V''_max는 동일하게 유지된다.^[51]
• 비경쟁적 저해제: 저해제가 효소의 알로스테릭 부위에 결합하여 효소에 대한 기질의 결합 친화도(''K''_M의 역수)는 동일하게 유지되지만, ''V''_max는 감소한다. 라이너위버-버크 도표에서 y 절편(1/''V''_max)은 변하지만, x 절편(-1/''K''_M)은 동일하게 유지된다.^[50]
• 불경쟁적 저해제: 저해제가 효소-기질 복합체에만 결합한다.

비선형 회귀를 통해 효소의 속도론적 데이터를 위의 속도 방정식에 맞추면^[105], 해리 상수 ''K''_i 와 ''K'''_i 를 정확하게 계산할 수 있다.

6. 2. 비가역적 저해제

• 친화성 표지: 반응성이 높은 작용기가 저해를 일으키기 위해 관심 단백질의 촉매적으로 중요한 잔기를 변형시킨다.
• 메커니즘 기반 저해: 저해제의 결합과 효소 매개 변형을 수반하여 후자를 효소를 비가역적으로 변형시키는 반응성 그룹으로 변환한다.^[2]

7. 촉매 메커니즘

효소-기질 상호작용에 대한 선호되는 모델은 유도 적합 모델이다.^[53] 이 모델은 효소와 기질 사이의 초기 상호작용은 비교적 약하지만, 이러한 약한 상호작용이 효소의 입체 구조 변화를 빠르게 유도하여 결합을 강화한다고 제안한다. 이러한 입체 구조 변화는 또한 활성 부위의 촉매 잔기를 반응에서 변경될 기질의 화학 결합에 가깝게 한다.^[54] 입체 구조 변화는 원형 이색성 또는 이중 편광 간섭계를 사용하여 측정할 수 있다. 결합이 일어난 후, 하나 이상의 촉매 작용 메커니즘은 반응에 대한 대체 화학 경로를 제공하여 반응의 전이 상태 에너지를 낮춘다. 촉매 작용 메커니즘에는 결합 변형에 의한 촉매 작용, 근접 및 배향에 의한 촉매 작용, 활성 부위 양성자 공여 또는 수용체에 의한 촉매 작용, 공유 결합 촉매 작용 및 양자 터널링이 포함된다.^[42][55]

효소 역학은 효소가 어떤 촉매 작용 방식을 사용하는지 증명할 수 없다. 그러나 일부 운동 데이터는 다른 기술로 검토할 수 있는 가능성을 제시할 수 있다. 예를 들어, 버스트-단계 전정상 상태 운동학을 갖는 핑퐁 메커니즘은 이 효소의 메커니즘에서 공유 촉매 작용이 중요할 수 있음을 시사한다. 또는, ''V''_max에는 강한 pH 효과가 있지만 ''K''_M에는 그렇지 않다는 관찰은 활성 부위의 잔기가 촉매 작용이 일어나기 위해 특정 이온화 상태에 있어야 함을 나타낼 수 있다.

8. 역사

1902년 빅토르 앙리는 효소 반응 속도론에 대한 정량적 이론을 제안했다.^[56] 그러나 당시에는 pH의 중요성이 알려지지 않았다. 1909년 페테르 로리츠 쇠렌센이 로그 pH 척도를 정의하고 완충 용액의 개념을 도입한 후,^[57] 독일 화학자 레오노르 미하엘리스와 모드 레오노라 멘텐은 앙리의 실험을 재현하고 그의 방정식을 확인했다. 이 방정식은 현재 미하엘리스-멘텐 반응 속도론(또는 ''앙리-미하엘리스-멘텐 반응 속도론'')으로 불린다.^[58] G. E. 브리그스와 J. B. S. 홀데인은 이들의 연구를 더욱 발전시켜 오늘날 효소 활성을 모델링하는 데 널리 사용되는 속도 방정식을 도출했다.^[59]

앙리와 미하엘리스-멘텐의 주요 기여는 효소 반응을 두 단계로 생각한 것이다. 첫 번째 단계는 기질이 효소에 가역적으로 결합하여 효소-기질 복합체(미하엘리스 복합체)를 형성하는 것이다. 그 후 효소는 반응의 화학적 단계를 촉매하고 생성물을 방출한다. 많은 효소의 반응속도론은 간단한 미하엘리스-멘텐 모델로 설명되지만, 일부 효소는 단백질 역학을 가지며, 이는 기본적인 미하엘리스-멘텐 메커니즘의 수학적 확장으로 모델링할 수 있다.^[63]

9. 소프트웨어

ENZO(효소 반응속도론)는 효소 촉매 반응의 동역학적 모델을 구축하기 위한 그래픽 인터페이스 도구이다. ENZO는 규정된 효소 반응 scheme으로부터 해당 미분 방정식을 자동으로 생성한다. 이러한 미분 방정식은 수치 해석기 및 회귀 알고리즘에 의해 처리되어 실험적으로 관찰된 시간 경과 곡선에 대한 미분 방정식의 계수를 맞춘다. ENZO는 경쟁적인 반응 scheme의 신속한 평가를 허용하며, 효소 반응속도론에서 일상적인 테스트에 사용할 수 있다.^[64]

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